Name: simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover
Uploaded: 2016-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

لتحديد بدقة دوران cardiomyocyte ويجب أن المقايسات تجديد تميز بين جيل cardiomyocyte صحيح والانقسام الحمض النووي غير منتجة. لا تزال العديد من الدراسات ببساطة تجاهل هذه الأحداث غير منتجة، قياس انتشار cardiomyocyte فقط عن طريق التعبير عن الحركية عند السيكلين وعلامات دورة الخلية. حتى الآن أسلوب واحد الذي يسمح للتقدير دقيق لدوران cardiomyocyte في حين السيطرة على هذه الأحداث غير منتجة يبقى ملمح. وعلى وجه الخصوص ما زال من الصعب حساب لpolyploidization cardiomyocyte الذي يسهم تصل الى ~ 65٪ من cardiomyocyte تكرار الحمض النووي (13). لذلك للمساعدة في تقدير دقيق للجيل cardiomyocyte قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح الكمي القوي لمعدلات نوى cardiomyocyte الجدد مع استبعاد تكرار الحمض النووي أن يؤدي إلى زيادة الصيغة الصبغية. على الرغم من أن هذا البروتوكول لا يمكن التمييز بين الأجناس الجدد cardiomyocyteنشوئها وcardiomyocyte ثنائية التنوي، ويمكن استخدامه بسرعة وبدقة حساب الجزء العلوي من الحد (المحاسبة عن الصيغة الصبغية) من الجيل cardiomyocyte. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول أداة فحص لتقييم التغيرات المحتملة في معدلات توليد cardiomyocyte وpolyploidization في نماذج المرض أو لتقييم كفاءة المحتملة من العلاجات. مرة واحدة يتم تحديد التغيرات في معدل توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte باستخدام هذا البروتوكول دراسات لاحقة يمكن أن تستخدم للتأكد ما إذا كان هذا نتيجة للتغيرات في الجيل cardiomyocyte عدد cardiomyocyte التنوي، كما هو موضح سابقا 2،13،17،18. وتشمل هذه استخدام النسيجية ديناميات التنوي الكمي cardiomyocyte خلال الفترة النبض أو تحليلات أقسام الأنسجة التي تم الحصول عليها من ايدو الحيوانات نابض في لمقارنة EDU التأسيس في السكان cardiomyocyte mononucleated ومتعددة النوى. ويرجع ذلك إلى انخفاض مستويات دوران cardiomyocyte هذايستخدم بروتوكول الحقن متعددة من ايدو على مدى 7 أيام. وهذا يسمح أيضا &quot;مطاردة&quot; من جميع المصادر المحتملة الخلوية من الجيل cardiomyocyte ويسمح الكمي من الجيل cardiomyocyte نوى التراكمي خلال هذه الفترة الزمنية. اعتمادا على هذه الدراسة، يمكن تعديل هذا الإطار الزمني لتتناسب مع المستويات المتوقعة من الجيل cardiomyocyte. لتقدير دقيق لايدو التأسيس في نوى cardiomyocyte، لا بد من أن ليس هناك وسم غير محدد من النوى مع الأجسام المضادة الثانوية تستخدم لكشف PCM-1 التفاعل. وبالتالي سيكون من الحكمة لإجراء التجارب الأجسام المضادة المعايرة الثانوية إضافية من أجل تحسين هذا الجانب من البروتوكول، لا سيما إذا كان الضد الثانوية غير أن اقترح في هذا البروتوكول هو لاستخدامها. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم PCM-1 التعبير لتحديد نوى cardiomyocyte. في حين أن هذا هو علامة cardiomyocyte المعمول بها، علامات بديلة يمكن استخدامها للتحقق من صحةالبيانات؛ وتشمل هذه الأجسام المضادة المحددة للالقلب تروبونين تي والتي تم تحديدها على أنها مترجمة جزئيا في نوى cardiomyocyte 1. وبالمثل، يمكن استخدام البروتينات المترجمة النووية بديلة لتحديد وقياس EDU التأسيس في السكان أنويتها غير ذلك من العضلية. من المهم أن كل نواة cardiomyocyte التي تشهد بنشاط الانقسام مستثناة من التحليل، ومصير هذه توليف الحمض النووي غير معروف ويمكن أن يؤدي في أي انقسام الخلية أو زيادة الصيغة الصبغية. تم تفكيكها PCM1 خلال المرحلة M من دورة الخلية وبالتالي العضلية تمر الانقسام لن يتم تحديدها من قبل التعبير PCM1. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تستبعد كل نواة في مرحلة من مراحل دورة الخلية من تحليل لاحقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق المعزولة من جميع نوى مع كثافة دابي فوق السكان 2N بما في ذلك تلك التي لديها كثافة دابي بين 2N و4N السكان. على الرغم من أنها على نحو متزايدقبلت أن القلب لديه القدرة على استبدال العضلية أثناء الشيخوخة الطبيعية، وبعد الإصابة الحادة، ويبقى مصدر ودرجة هذه الإمكانات المثير للجدل. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن معدلات متباينة من دوران cardiomyocyte 1،7،20-22. قد يكون هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات في تحديد بدقة وقياس الجدد cardiomyocyte جيل 19. حتى الآن غالبية الدراسات اعتمدوا فقط على استخدام التحليل النسيجي وتحديد العضلية عن طريق التعبير عن بروتينات حشوية، بما في ذلك البروتينات من قسيم عضلي، لتقدير حجم دوران cardiomyocyte وتجديد 2،4،23،24. استخدام هذه الأساليب للكشف عن التعبير عن علامات انتشار الأسلحة النووية، أو كما هو موضح هنا، وإدماج نظائرها ثيميدين يمكن أن يؤدي بسهولة في عدم التعرف على أنواع الخلايا القلبية الأخرى العضلية. في حين أن استخدام التصوير متحد البؤر 3D يمكن أن يساعد على التخفيف من حدة هذه المشاكل عشرطرق جنوب شرقي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. ومن المثير للاهتمام، وبروتوكول الموصوفة هنا يوضح يحدث جيل أنويتها الجدد cardiomyocyte بمعدل 0.17٪ في الأسبوع. وهذا يتفق مع تدفق الآخر الخلوي الدراسات التي تعتمد إظهار معدلات دوران أسبوعية تصل إلى 0.13٪ 5. على الرغم من أنه من المغري لاستقراء معدلات دوران السنوية بناء على هذه البيانات، كما هو الحال في الدراسات السابقة 2،5،25،26، وهذا هو صورة غير ملائمة معدلات دوران ديناميكية خلال فترة حياة الحيوان (13). هذا الأسلوب لديه عدد من التطبيقات المحتملة بما في ذلك تقييم العلاجات المحتملة لتعزيز تجديد cardiomyocyte أو التحقيق في آثار أمراض القلب على دوران cardiomyocyte ومعدلات polyploidization cardiomyocyte.

في السنوات الأخيرة كان هناك تراكم الأدلة تتحدى الافتراض بأن القلب هو متباينة عضال، بعد الإنقسامية الجهاز 1،2. ومع ذلك، وتحديد حجم دوران cardiomyocyte وتجديد يبقى تحديا. وذكرت الصعوبات في تحديد بدقة الجيل cardiomyocyte نادر باستخدام تقنيات المناعى القياسية أيضا 3. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مصدر الخلوية من الجيل cardiomyocyte لا يزال غير مؤكد مع الدليل على مساهمات من انتشار cardiomyocyte فضلا عن الخلايا الجذعية التمايز 4-6. ولذلك، فإن استخدام نماذج النسب تتبع التي تتطلب معرفة النمط الظاهري cardiomyocyte السلف مستحيل وتقدير الانتشار في عدد السكان واحد، بما في ذلك العضلية، غير مناسب. وعلاوة على ذلك لcardiomyocyte ديه القدرة على endoreplication دون الحرائك النووية (مما أدى إلى السيارة المتعددة الصبغياتdiomyocyte) أو الحرائك النووية في غياب الانقسام السيتوبلازمي (مما أدى إلى cardiomyocyte binucleated) 7،8. والتقدير الدقيق دوران cardiomyocyte يعتمد على القدرة على التمييز بين هذه الأحداث وجيل صحيح الجدد cardiomyocyte. وهذا يخلق تعقيدات فريدة من نوعها لتكرار الحمض النووي والتعبير عن تحركات تعتمد على السيكلين في العضلية لا تظهر على وجه الحصر انقسام الخلايا الحقيقية 9،10. للمساعدة في القياس الكمي للجيل الجدد cardiomyocyte، جمعنا بين تقنية أنشئت العزلة نوى، ووضع العلامات المناعي من المواد محيط بالمريكز 1 (PCM1) لتحديد نوى cardiomyocyte كما وصفها برغمان وآخرون 7،11 مع طرق جديدة للالمدى الطويل وضع العلامات الحمض النووي وتحليل الصيغة الصبغية. PCM-1 هو بروتين الجسيم المركزي التي تتراكم على سطح النووي متباينة، myocytes غير ركوب الدراجات. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الأجسام المضادة ضدPCM-1 تسمية تحديدا نوى cardiomyocyte 7،11 وكما تم استخدام هذا PCM1 من قبل عدد من جماعات مستقلة لتحديد العضلية 1،12،13. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا أن PCM1 التعبير خرائط لنوى cardiomyocyte المسمى وراثيا في نموذج لجنة المساواة العرقية تي ان تي المعدلة وراثيا الماوس 14 (الشكل التكميلي 1). بروتوكول صفها هنا يمكن تحديد دقيق وحساس من جيل cardiomyocyte نوى الجدد في قلب فأر، بغض النظر عن أصول الخلوية (الشكل 1A و B) مع استبعاد في نفس الوقت وضع العلامات نوكليوزيد بسبب polyploidization من التحليل (الشكل 1C و D). على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن السيطرة على ازدواجية النواة cardiomyocyte، لأنها تتيح الكمي السريع والقوي من نوى الجدد cardiomyocyte وهو مطلوب لتقدير دقيق لدوران cardiomyocyte. علاوة على ذلك،أنه يوفر أداة الفرز السريع لتقييم التغيرات المحتملة في ديناميات الجيل cardiomyocyte. في حين وصفها الحمض النووي وعادة ما ينطوي 5-برومو-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) كما التناظرية ثيميدين، وبروتوكول الموصوفة هنا يستخدم فحص 5-إيثينيل-2&#39;-deoxyuridine (EDU) استنادا لأنه يتطلب خطوات المعالجة أقل لأسرع من خلال-وضع ولا يتطلب تغيير طبيعة الحمض النووي للالمناعية الكشف، مما يجعلها متوافقة مع بروتوكولات المناعية الأخرى، وبالتالي زيادة التطبيقات المصب المحتملة لهذه الطريقة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> الشكل 1: ينبض المستمر مع ايدو تسميات الجدد العضلية بغض النظر عن الأسلاف الخاصة بهم. أدرج (A) EDU في الحمض النووي العضلية أثناء انقسام الخلية. وانتشار بين السكان cardiomyocyte بالنتيجهتي في زيادة أو استبدال الخلايا العضلية وهو توليف الحمض النووي وبالتالي إنتاجية (يساهم في صيانة الأنسجة وإصلاح). أدرج (ب) EDU في الحمض النووي للخلايا السلف القلب أثناء انقسام الخلية. سيتم الاحتفاظ هذا في الخلية خلال التمايز إلى النسب cardiomyocyte. وهذا تمايز الخلايا الجذعية يؤدي أيضا إلى زيادة في عدد الخلايا العضلية، وبالتالي يساهم في صيانة الأنسجة والإصلاح. (C) العضلية لديها القدرة على الخضوع لتكرار الحمض النووي &quot;غير منتجة&quot; مما أدى إلى زيادة الصيغة الصبغية cardiomyocyte، الذي يرتبط مع تضخم cardiomyocyte وإعادة عضلة القلب، ولكن لا يحل محل العضلية المفقودة. عملية polyploidization تختلف عن ازدواجية النواة كما أنه يؤدي إلى cardiomyocyte مع نواة واحدة والذي يحتوي على أربعة أو أكثر من مجموعات من اثنين من الكروموزومات المتماثلة (&gt; 2N). (D) وبعد نوى ص المستمرulse، يصف هذا البروتوكول العزلة النوى وتحديد نوى cardiomyocyte من التعبير PCM1 للسماح الكمي لكلا الصيغة الصبغية cardiomyocyte وايدو التأسيس. PCM1 التعبير وايدو التأسيس الكشف باستخدام التدفق الخلوي. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

على الرغم من أن من المسلم به أن القلب لديها امكانات محدودة لتجديد العضلية بسبب الإصابة بجانب أن انخفاض مستويات دوران cardiomyocyte تحدث أثناء الشيخوخة الطبيعية، وتحديد حجم هذه الأحداث لا يزال تحديا. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى ندرة هذه العملية وحقيقة أن مصادر الخلوية متعددة تساهم في صيانة عضلة القلب. وعلاوة على ذلك، ازدواجية الحمض النووي داخل العضلية وغالبا ما يؤدي إلى cardiomyocyte المتعددة الصبغيات ونادرا ما يؤدي إلى العضلية الجديدة عن طريق الانقسام الخلوي. من أجل تحديد بدقة التمييز دوران cardiomyocyte بين هذه العمليات أمر ضروري. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم العلامات نوكليوزيد على المدى الطويل من أجل تسمية كل نوى التي نشأت نتيجة لنوى تكرار الحمض النووي وcardiomyocyte التي تم تحديدها من خلال الاستفادة من العزلة النوى وimmunolabeling PCM1 لاحق. معا وهذا يسمح بتحديد دقيق وحساس من وضع العلامات نوكليوزيد من جardiomyocyte السكان أنويتها. وعلاوة على ذلك، 4 &quot;، ووضع العلامات وتحليل الصيغة الصبغية أنويتها 6 diamidino-2-phenylindole، يمكن التمييز نوى الجدد cardiomyocyte من نوى التي أدرجت نوكليوزيد خلال polyploidization. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن السيطرة على ازدواجية النواة cardiomyocyte، لأنها تتيح الكمي السريع والقوي من نوى الجدد cardiomyocyte بينما يمثل polyploidization. هذا الأسلوب لديه عدد من التطبيقات المصب بما في ذلك تقييم العلاجات المحتملة لتعزيز تجديد cardiomyocyte أو التحقيق في آثار أمراض القلب على دوران cardiomyocyte والصيغة الصبغية. هذا الأسلوب هو أيضا متوافقة مع تقنيات immunohistological المصب إضافية، مما يسمح الكمي التأسيس نوكليوزيد في جميع أنواع الخلايا في القلب.

يسمح هذا الأسلوب الكمي لزيادة دمج EDU بسبب انقسام نواة cardiomyocyte في حين السيطرة على زيادة polyploidization. عن طريق فحص BrdU القائمة، ونحن أثبتنا سابقا أن قلب الثدييات يستجيب لفقدان cardiomyocyte المزمنة، في نموذج الفأر MDX ضمور العضلات دوشين، مع تجديد الخلايا العضلية الجديدة. وقد استخدمنا الأساليب المذكورة هنا لمزيد من التحقق من صحة النتائج التي نشرت لدينا، وإثبات فائدة من البروتوكول. وفقا للبروتوكول وصفها. ونابض الكبار (12 أسبوع من العمر) MDX والسيطرة الفئران bl10 مع الحقن اليومي واحدة من ايدو لمدة 7 أيام، وذكرت في وقت سابق للسماح للتحليل إحصائيا بين المجموعات التجريبية 5،13. تحليل Immunohistological القلوب نابض يوضح وجود PCM1 التعبير العضلية التي أدرجت ايدو (الشكل 3A). النقيب ومع ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليهاز طرق immunohistological يمكن أن يساء تفسيرها، وأنواع الخلايا الأخرى التي أدرجت ايدو يمكن أخطأ في التعرف كما العضلية. ويتجلى مثال على هذا في الشكل 1A التكميلي وباء. وعلاوة على ذلك أساليب immunohistological لا تميز polyploidization من الانقسام النووي. تدفق تحليل الخلوي بالتفصيل في هذا البروتوكول تمكن الكمي السريع لتقسيم النووي cardiomyocyte في الفئران MDX والسيطرة، مع استبعاد الخلايا التي أدرجت ايدو بسبب polyploidization. على غرار البيانات المنشورة سابقا 13، وكشف التحليل زيادة في معدلات توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte في قلوب MDX الماوس بالمقارنة مع سن يقابل الضوابط (1.2٪ مقابل 0.17٪، الشكل 3B و C). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> الشكل (3): </strong&gt; الكمي من ايدو صفت العضلية في wildtype وقلوب MDX. (أ) صورة من التوقعات Z كومة مأخوذة من 40 ميكرون أبواب سميكة من قلوب MDX. PCM-1 التعبير عن نوى cardiomyocyte (الأخضر) التي أدرجت ايدو (الحمراء). يشير السهم الأصفر EDU المسمى العضلية. الأول والثاني يشير الفردية EDU المسمى العضلية هو مبين في Z-الطائرة. وصفت نوى مع دابي (الأزرق) (B و C) التدفق الخلوي من نواة معزولة تظهر المؤامرات تمثيلية 12-13 أسبوع النوع القديم البرية (C57 / BL10) والفئران MDX (MDX - / ص على C57 / خلفية BL10). (ب) رسم بياني يظهر دابي كثافة والتمييز بين 2N و&gt; 2N نوى. (C) المؤامرات التي تبين التأسيس ايدو في عدد السكان نوى 2N cardiomyocyte عند تحليلها على النحو المفصل في هذا البروتوكول. لجميع الفئران كانت تدار ايدو ل1 أسبوع من 12 أسابيع من العمر. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الشكل التكميلي 1: PCM-1 هو علامة معينة لنوى cardiomyocyte باستخدام بروتوكول وصف تم عزل نواة من الماوس المعدلة وراثيا المزدوج التي تنتجها عبور الفئران TNT-لجنة المساواة العرقية 14 مع ROSA NT / NG خط مراسل لجنة المساواة العرقية حساسة 16. في ينجم عن ذلك من تفعيل الماوس لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة تروبونين تي (TNT) المروج يؤدي إلى التعبير لا رجعة فيه GFP مع المترجمة إلى نوى. وصفت نوى مع isotype السيطرة (ايزو) يدل على القدرة على تحديد GFP معربا عن cardiomyocyte نوى السكان (488/530/30-A). وضع العلامات من نوى مع مكافحة PCM1 (الضد الثانوية الكشف عنها بواسطة 633-660 / 20-A) يدل على ارتباط التعبير PCM1 مع cardiomyocy GFP التعبيرالسكان أنويتها الشركة المصرية للاتصالات. في هذا المثال 98.8٪ من نوى cardiomyocyte كما حددها نشاط المروج تي ان تي، وصفت من قبل PCM1 الأجسام المضادة. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل الشكل التكميلي 1.</a> معارض التحديات لقياس تجديد cardiomyocyte بواسطة تقنيات immunohistological (A) 2D صورة اثنين PCM-1 التعبير عن نوى cardiomyocyte (الأخضر) التي يبدو أنها وصفت أيضا لايدو (الأحمر): الشكل التكميلي 2. وتشير الأسهم الصفراء على ما يبدو العضلية التي أدرجت ايدو. هذا ويرجع ذلك إلى ظاهر شارك في توطين التعبير PCM1 وEDU الوسم عندما تصور باستخدام التصوير 2-dimentional. (ب) إسقاط 3-الأبعاد من هذه الصورة يحدد ايدو وصفت الخلايا ليست العضلية ولكن هي خلايا غير cardiomyocyte المغطي PCM1 معربا عن نوى cardiomyocyte. الفئران C57 / BL10 في 12 أسابيع من العمر المستخدمة في التجارب. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل التكميلي الشكل 2A.</a> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل التكميلية الشكل 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> مكونات رد فعل </td><td colspan="2"> عدد من ردود الفعل </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> 875 ميكرولتر </td><td> 2.19 مل </td></tr><tr><td> بروتيكتانت النحاس </td><td> 20 ميكرولتر </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> صبغة الفلورسنت picolyl أزيد </td><td> 5 ميكرولتر </td><td> 12.5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> رد فعل مخففالمخزن المؤقت أعد 4.1 </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> 250 ميكرولتر </td></tr><tr><td> إجمالي حجم رد الفعل </td><td> 1 مل </td><td> 2.5 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 2: ايدو المكونات كوكتيل. وصفة لEDU الوسم كوكتيل المطلوبة في القسم بروتوكول 4 (الكشف عن EDU التأسيس).

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

تقييم سلامة الحمض النووي الخلايا الجذعية للعلاج بخلايا القلب

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genetics

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medicine

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Biology

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

طريقة عالية الإنتاجية في الموقع لتقدير البليدي النووي الكبدي في الفئران

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

نموذج من مرض القلب الإقفاري والمقارنة المستندة إلى الفيديو من انكماش القلبية من خلال استخدام هابسك المشتقة من القلب

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...