This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

動物の作業はニューカッスル大学の倫理審査委員会によって承認され、承認されました。全ての動物手順は、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する欧州議会の指令63分の2010 / EUからのガイドラインに準拠して実施しました。 1. EDU管理<ol><li> 12.5ミリグラム/ mlの最終濃度で、滅菌生理食塩液中EDU（w / vの0.9％）を溶解させます。 <ol><li>完全に溶解するために40°Cと渦の溶液を加熱します。 6毎日の注射を可能にする研究にすべてのマウスを注入するために4℃で十分なEDU /生理食塩水を保管してください。 注：通常6以上のマウスが各実験群のために必要とされます。しかし、電力の計算は、独立した研究のために行われるべきです。 </li></ol></li><li>個々のマウスの重量を測定。各マウスにEDU /生理食塩水を100μg/グラム（グラムあたりの株式EDU液の8μl）を管理するために必要な量を計算します。 </li><li>適切なvolumを描きます25 G針を有するインスリン注射器へのEDU /生理食塩水の電子。 </li><li>承認された内務省の技法を用いてマウスを処理しながら、腹腔内（ip）注射を行います。 <ol><li>ケージの蓋の上にマウスを置きます。ゆっくり尾の付け根に引き戻し、しっかりと首筋によってマウスを把握します。 </li><li>ヘッドのベース近くに人差し指と親指でマウスを保持し、床に向かって後方に動物の頭を傾けて注入するための腹部を公開します。 </li><li> 70％アルコール溶液で腹部を拭いてください。動物の正中線と右下の象限の位置を確認します。右下の象限に動物にEDU /生理食塩水を注入します。 </li><li> EDU /食塩水をマウスに注射し、時刻を記録します。 </li></ol></li><li>繰り返して、6日間連続して、一日の同じ時間に1.4から1.2を繰り返します。 注：EDUネガティブコントロールは、フローサイトメトリー分析のためにゲートを設定するために必要とされるように、付加的な年齢、性別を注入し、実験的に一致EDUのない等量の生理食塩水とエドマウス。これは、必要な制御（無EDU制御）を提供します。この制御は、設定の試薬およびサイトメーターのバッチの変動を可能にするために、すべての研究のために含まれるべきです。 </li></ol> 2.収穫ハーツ<ol><li> 6 番目の EDUの注射後24時間で、頸椎脱臼（または1内務省は、認可済みの代替スケジュール法）を用いてマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>仰臥位で犠牲に動物を置き、手術用ハサミで振動板に半ば腹部から皮膚切開を行います。 </li><li>横隔膜をカットし、心臓を露出するために、左右カット、体腔から離れて胸骨を保持しています。 </li><li>少し心を持ち上げ、胸腔から心臓を解剖する流出路の主要な血管を切ります。 </li><li>すぐにPBSを4℃に冷やした10ミリリットルを含む個々の15​​mlの遠心管に各心を置きます。 </li><li> 9月に心を移し矢状方向に二​​つにそれぞれの心をカットメスを用いて、10センチメートルペトリ皿をarate、静かにピンセットで圧搾することにより心を洗います。そして、できるだけ多くの血液を除去するためにPBSを交換してください。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>同じ個体1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにそれぞれの心の両方の部分を置きます。 </li><li> 3または代替的に店舗標本に進み-80℃〜ステップ2.9と2.10で説明するように。 </li><li> 25 G針を使用して、心臓が処理されるときにマイクロ遠心チューブのふたに小さな穴が原因でガスの膨張開口部から蓋を防止することを可能にします。 </li><li>凍結し、液体窒素の容器に各マイクロチューブや場所にラベルを付けます。 </li></ol> 3.核解離および心筋細胞核のラベリング注：この核解離および心筋細胞核の標識はバーグマンらのものから適合されている11注入すべてのサンプルでこの手順を実行します。EDUと注入された生理食塩水（無EDU制御）を陰性対照と。これらの手順を実行するために必要なソリューションのレシピについては、 表1を参照してください。 <ol><li>各心臓を分析するために、30分間インキュベートし、超遠心チューブに1％BSA / PBS溶液36 mlで配置溶液を捨て、次いで空気乾燥さ許します。 注：このチューブはステップ3.6で使用されています。 </li><li>心はミンチ処理中に解凍することを可能にメスを用いて氷とミンチに10ミリメートル皿に個々の冷凍心を置きます。 </li><li> 50mlの遠心チューブに細胞溶解バッファーの15ミリリットルに刻んだ心を置き、室温で25,000 rpmで15秒間プローブホモジナイザーで均質化します。 </li><li>遠心チューブに細胞溶解バッファーのさらに15ミリリットルを追加し、大きなクリアランス乳棒で40ミリリットルダウンスに移します。乳棒で10ストロークを実行し、50ミリリットルの遠心分離管に100ミクロンを介して、その後40μmのセルストレーナーをフィルタリングします。 </li><li> 10分aの遠心分離機トン700 4℃でXG、上清を除去します。 </li><li>ショ糖勾配溶液25mlに核ペレットを再懸濁し、3.1で製造した超遠心管中で新鮮なショ糖勾配溶液10mlの上に溶液を含む細胞核をレイヤー。 </li><li>スイングアウトチューブローターを用いて4℃で1時間13,000×gで遠心分離します。 </li><li>遠心分離後、上清を捨て、1.5 mlのマイクロ遠心チューブやラベルPCM1に核蓄積バッファの1300μlの核ペレットを再懸濁します。 </li><li>新しいマイクロチューブに懸濁液の300μlのを削除し、新たな核格納用バッファの700μlに追加します。 ISOコントロールとしてこのチューブにラベルを付けます。 </li><li> PCM1ラベルされたマイクロチューブにミリリットル8μgの/の最終濃度で抗PCM1を追加し、ISO制御ラベルされたマイクロチューブに8μgの/ mlの濃度でウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を追加します。 </li><li> 4℃で一晩インキュベートします。次のincubエーション、10分間、700×gで遠心分離器は、700×gで10分間、再び新鮮な核格納バッファ、再懸濁と遠心1mlで置き換え、上清を捨てます。上清を捨て、新鮮な核貯蔵緩衝液1mlと交換してください。 </li><li> 2μg/ mlの最終濃度を達成するためのF（ab &#39;）ヤギ抗ウサギIgG（H + L）抗体（FITCまたは同等の緑色蛍光色素）の2断片の1μlを添加します。 注：F（AB &#39;）を使用する2フラグメント抗体は、マクロファージ及びB細胞を含む免疫細胞の非特異的標識の可能性を低下させます。 </li><li>アルミホイルでラップ管は光から保護し、4℃で1時間インキュベートします。 </li></ol> EDU定款4.検出<ol><li>希薄10xが脱イオン水でEDU反応バッファー1:10に濃縮しました。 </li><li>遠心機PCM-1およびISO制御標識核懸濁液10分間700×gで、上清を廃棄し、1mlの核ペレットを再懸濁1％BSA / PBS溶液。二回の核ペレットを洗浄します。 </li><li>最後の洗浄後、上清を破棄し、EDU固定液100μlと交換してください。 </li><li>光から保護し、室温で15分間インキュベートするアルミホイルでチューブを包みます。 </li><li> 700×gで1％BSA / PBS溶液を、遠心1mlで二回サンプルを洗浄し、室温で15分間、1Xサポニンベースの透過溶液でインキュベートします。 </li><li> 1×EDUのラベリングカクテル（ 表2）を準備します。 2反応を最小にはEDU制御を含まないために必要とされます。 </li><li>既に1×サポニンベースの透過性溶液100μlに核を含む各サンプルに直接1xのEDUのラベリングカクテルの500μlを添加して、30分間、光から保護し、室温でインキュベートします。 </li><li> 1％BSA / PBSの1ミリリットルで700×gで再懸濁で遠心分離し、このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li> 700×gで遠心分離し、上清を破棄し、4と交換DNA染色溶液の00μlの（ 材料の表を参照してください）。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td> 1.細胞溶解バッファー </td></tr><tr><td> 0.32 Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス - 塩酸（pH値= 8） </td></tr><tr><td> 5 mMのCaCl 2を</td></tr><tr><td> 5 mMの酢酸マグネシウム</td></tr><tr><td> 2.0 mMのEDTA </td></tr><tr><td> 0.5mMのEGTA </td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 2.Sucroseグラデーションソリューション </td></tr><tr><td> 2.1 Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス - 塩酸（pH値= 8） </td></tr><tr><td> 5 mMの酢酸マグネシウム</td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 3.核蓄積バッファ（NSB） </td></tr><tr><td> 0.44 Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス - 塩酸（pH値= 7.2） </td></tr><tr><td> 70のKCl </td></tr><tr><td> 10のMgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5ミリモルのスペルミン</td></tr></tbody></table> 表1： 核単離緩衝液成分プロトコルセクション3（核解離と心筋細胞核標識）で使用されるすべてのバッファのためのレシピ。 5.フローサイトメトリー分析注：以前に7,11,15説明したように、単離された核のフローサイトメトリーを実行します。 <ol><li>まず、破片（ 図2A）からの核の識別を可能にするために、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）を記述するプロットを作成します。 </li><li>高さ対）4をプロットすることにより、凝集体（ 図2B）から単核を識別するためのプロットを作成&#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）エリア（3から405/450/50 A）（33から405/450 / 50-H）。 thaのを確認してくださいトン3から405/50分の450-信号は、DNA含有量の正確な決意を可能にするために、リニアスケールで収集されます。 </li><li> 535分の488/30 A（PCM-1）SSC対を記述したプロットを作成し、一集団中のPCM-1発現を評価するために、5.2で作成した一重ゲートからイベントのみを表示します。 </li><li> PCM-1陽性ゲート（ 図2C）を確立するために、アイソタイプコントロールサンプルを実行します。 PCM1の少量を実行しPCM1表現する人口とゲート位置を確認するために、サンプルを標識しました。 </li><li> （DAPIを検出するために）450分の405/50 A対SSC-Aを説明するプロットを作成します。このプロットでは、5.3で作成されたゲートを使用して、核を表現するだけシングレットPCM1を表示します。のみ2N核（ 図2D）が含まれている追加の階層ゲートを作成するには、このプロットを使用してください。 </li><li>心筋細胞集団を表現するPCM1のEDU標識の同定を可能にするために1から633/20分の660-A対535分の488/30 Aを説明するプロットを作成します。一重である核のみを表示し、P<html>上記のゲーティングを使用して、CM1 +および2N。 </li><li> EDU正のゲート（ 図2E）を設定していないEDUコントロールから心臓サンプルを実行します。 EDU +細胞のための適切なゲートを作成します。 </li><li>録音し定量シングレット、EDUが組み込まれているPCM-1を発現する、2N核。 </li><li>合計一、PCM1 +核の割合として、この人口を計算します。これは、全心筋細胞核の割合として、7日EDUパルス期間中に、ネオ心筋細胞核発生速度を提供します。 注：DAPIがDNAに結合する蛍光強度はDNAの量に比例した化学量論的であるように。以前に7説明したように、450分の405/50信号の強度に基づいて、倍数性を決定します。 </li><li>総心筋細胞集団内の倍数性を評価するために5.5に設立され、プロットし、DNA濃度7に基づいて、ゲート戦略を使用しています。 </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; 図2：心筋細胞EDUの取り込みと倍数性を定量化するためのゲーティング戦略 （A）核は前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）に基づいて破片から区別されます。 （B）線形ゲートが作成され、一核集団をDAPI標識と領域信号対405/450/50高さに基づいて特定されます。 （C）蛍光ゲーティングは心臓組織からの心筋細胞の核（PCM-陽性1）と非心筋細胞（PCM-1陰性）核の分離を可能にします。 （D）DAPI信号の強度は、DNA濃度およびPCM1 +心筋細胞集団のそれによって核倍数性を決定するために使用されます。マウスでは&gt;心筋細胞核の80％は、二倍体（2n個）です。 （E）蛍光ゲーティングは2Nを分離することができ、2NからEDU（PCM + / EDU + = 0.9％）に組み込まれている心筋細胞核、EDU（PCM + EDU-）に組み込まれていない心筋。すべてのステップは、プロトコル5.0で詳述されています。 MDXから示す例- 。C57 / BL10の背景に/ A yマウス<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

正確に心筋細胞のターンオーバーと再生アッセイを定量化するために、真の心筋細胞の生成と非生産的DNA分裂を区別する必要があります。多くの研究はもっぱらサイクリンキネシスと細胞周期マーカーの発現により心筋細胞の増殖を定量化する、単にこれらの非生産的なイベントを無視し続けています。これらの非生産的なイベントのために制御することがほのめかしたまま心筋細胞のターンオーバーの正確な定量化を可能にする単一のメソッドを今日まで。特に、心筋細胞のDNA複製13の65％〜最大寄与心筋細胞の倍数体を考慮することは難しいままです。したがって、心筋細胞の生成の正確な定量化を支援するために、我々は増加倍数性をもたらすDNA複製を排除しながらネオ心筋細胞核の割合の堅牢な定量化を可能にするプロトコルを開発しました。このプロトコルは、ネオ心筋細胞の属間で差別することはできませんがンおよび心筋二核は、心筋細胞の生成（倍数性を占める）の上限値を算出し、迅速かつ正確に使用することができます。このプロトコルは、したがって、疾患モデルにおける心筋細胞の発生と倍数体の速度の潜在的な変化を評価するために、または治療薬の潜在的な効率を評価するためのスクリーニングツールを提供しています。ネオ心筋細胞の核生成速度の変化は、このプロトコルを使用して同定されると心筋細胞核数の心筋細胞の生成の変化によるこの、以前に2,13,17,18に記載のようにあればその後の研究では確認するのに使用することができます。これらは、単核および多核心筋細胞集団にEDUの取り込みを比較することでEDUパルス動物から得られたパルス周期または組織切片の解析中に組織学的定量心筋細胞核ダイナミクスの使用を含みます。 心筋細胞のターンオーバーこの低レベルへプロトコルは、7日間にわたってEDUの複数回の注射を使用しています。これはまた、心筋細胞の生成のすべての潜在的な細胞源の &quot;追いかける&quot;と、この期間にわたって累積的な心筋細胞の核生成の定量化を可能にすることができます。研究によって、この時間枠は、心筋細胞の発生予測レベルに合わせて調節することができます。心筋細胞核におけるEDUの取り込みの正確な定量化のためには、PCM-1反応性を検出するために使用される二次抗体と核の非特異的標識が存在しないことが肝要です。したがって、このプロトコルで示唆した以外の二次抗体を使用する場合は特に、プロトコルのこの側面を最適化するために付加的な二次抗体を滴定実験を行うことが賢明であろう。ここで説明するプロトコルは、心筋細胞の核を識別するために、PCM-1の発現を使用しています。これは、確立された心筋細胞のマーカーであるが、代替的なマーカーは、検証するために使用することができデータ;これらは、心筋細胞核1に部分的にローカライズされたとして同定された心筋トロポニンTに対する特異的な抗体が含まれます。同様に、代替的な核局在化タンパク質は、心筋以外の核の集団にEDUの取り込みを同定および定量するために使用され得ます。このDNA合成の運命は未知であり、細胞分裂又は増加倍数性のいずれかをもたらすことができるように積極的に有糸分裂を受けているすべての心筋細胞核が、分析から除外されていることが重要です。 PCM1は、したがって、有糸分裂を受けた心筋細胞は、PCM1式によって識別されることはありません、細胞周期のM期の間に解体されています。加えて、細胞周期のS期における全ての核は、その後の分析から除外されるべきです。これは2Nと4N集団間のDAPI強度を有するものを含む2N人口上記DAPI強度で全ての核をゲートすることによって達成することができます。 それはますますあるが心臓が正常な老化と次の急性損傷時の心筋細胞を交換する能力を有することが認められ、この電位源と程度は依然として議論の余地があります。また、心筋細胞のターンオーバーの異種率が1,7,20-22を報告されています。これは、正確ネオ心筋世代19を識別し、定量化の困難に一部であってもよいです。大多数の研究とデートするには、心筋細胞のターンオーバーと更新2,4,23,24の定量化のために、筋節のタンパク質を含む、唯一の組織学的分析の使用および細胞質タンパク質の発現を介した心筋細胞の同定に依存してきました。これらの方法の使用は、増殖マーカーの発現を検出するため、またはここで示されているように、チミジン類似体の組み込みを容易に心筋のような他の心臓の細胞タイプの誤認をもたらすことができます。 3D共焦点イメージングの使用は、第これらの問題を軽減するのに役立つことができるがESEの方法は、高価で時間がかかります。興味深いことに、ここで説明するプロトコルは、ネオ心筋細胞の核生成は週に0.17パーセントの割合で発生示しています。これは、最大0.13％5の毎週の離職率を実証する他のフローサイトメトリーベースの研究と一致しています。それは以前の研究2,5,25,26のように、このデータに基づいて、年間離職率を推定することは魅力的ですが、離職率が動物13のライフタイム中に動的であるため、これは不適切です。 この方法は、心筋細胞の再生を増強するために潜在的な治療薬を評価または心筋細胞のターンオーバーと心筋細胞の倍数体の速度に心臓疾患の影響を調査するなど、潜在的なアプリケーションの数を持っています。

近年では、心臓が最終分化、有糸分裂後の臓器1,2であるという仮定に挑戦する証拠の蓄積がありました。しかし、心筋細胞のターンオーバーと再生の定量化は依然として厳しいです。 正確に、標準的な免疫組織化学的技術を使用して、希少な心筋細胞の生成を特定の難しさはよく3を報告しています。また、心筋細胞の世代の細胞源は、心筋細胞の増殖によってだけでなく、幹細胞の分化4-6の貢献のための証拠が不明です。したがって、心筋細胞前駆細胞表現型の知識を必要と系譜トレースモデルの使用が不可能と心筋細胞を含む単一集団、中の増殖の定量化され、不適切です。さらに、心筋細胞は、倍数体の車の中で得られた（核分裂せずに内部複製のための可能性を秘めていますdiomyocyte）または細胞質分裂（二核心筋細胞を生じる）7,8の不在下で核分裂。心筋細胞のターンオーバーの正確な定量化は、これらのイベントと真ネオ心筋世代区別する能力に依存しています。心筋細胞におけるDNA複製及びサイクリン依存性キナーゼの発現は、もっぱら真細胞分裂9,10を示さないので、これはユニークな合併症を作り出します。 バーグマンらによって記載されているようにネオ心筋細胞世代の定量化を支援するために、我々は、確立された核の分離技術、および心筋細胞核を識別するための中心体周辺物質1（PCM1）の免疫学的標識を組み合わせている。長期の新規な方法で7,11 DNA標識および倍数性分析。 PCM-1は、分化、非サイクリング筋細胞の核表面に蓄積中心体タンパク質です。以前の研究では、に対する抗体ことが実証されていますPCM-1は、具体的に心筋細胞核7,11と、このようなPCM1が心筋細胞1,12,13を識別するために、独立したグループの数によって使用されているようにラベルを付けます。さらに、我々はPCM1発現は、TNT CREトランスジェニックマウスモデル14（ 補足図1）における遺伝的に標識された心筋細胞の核にマップすることが実証されています。 同時に解析（ 図1CおよびD）からによる倍数体にヌクレオシド標識化を排除しながら、ここで説明されたプロトコルにかかわらず、携帯の起源（ 図1AおよびB）の、マウス心臓におけるネオ心筋細胞核の生成の正確かつ敏感な識別を可能にします。この方法は、心筋細胞の二核性のために制御することはできませんが、それは心筋細胞のターンオーバーの正確な定量化のために必要とされるネオ心筋細胞核の迅速かつ堅牢な定量化を可能にします。また、それは、心筋細胞の生成のダイナミクスの潜在的な変化を評価するための迅速なスクリーニングツールを提供しています。 DNAの標識化は、通常、チミジン類似体として、5-ブロモ-2&#39;-デオキシウリジン（BrdU）を含むが、ここで説明するプロトコルは、より迅速なため、より少ない処理工程を必要とする5-エチニル-2&#39;-デオキシウリジン（EDU）ベースのアッセイを使用して入れスルーと、免疫検出のためのDNAの変性、他の免疫染色のプロトコルと互換性作り、それによって方法の潜在的な下流のアプリケーションを増やす必要はありません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> 図1：EDU による連続パルス化は関係なく、それらの前駆細胞のネオ心筋細胞を標識します 。 （A）EDUは、細胞分裂の間に心筋細胞のDNAに組み込まれます。心筋細胞集団における増殖はresulます心筋細胞の中で増加、または交換におけるtとは、したがって、生産的なDNA合成は、（組織のメンテナンスや修理に貢献する）です。 （B）EDUは、細胞分裂の間に心臓前駆細胞のDNAに組み込まれます。これは、心筋細胞系譜への分化中の細胞内に保持されます。この幹細胞の分化はまた、心筋細胞の数の増加をもたらし、したがって、組織の維持および修復に寄与するであろう。 （C）心筋細胞は、心筋細胞肥大や心筋リモデリングに関連付けられている増加した心筋細胞の倍数性、結果として「非生産的」DNA複製を受ける可能性を持っていますが、失われた心筋細胞を置き換えるものではありません。それは2つの相同染色体（&gt; 2N）の4組以上含む単一の核を有する心筋細胞になるよう倍数体のプロセスは、二核性とは異なります。連続核Pに続いて（D）ulse、このプロトコルは、心筋細胞の倍数性とEDUの取り込みの両方の定量化を可能にするためにPCM1の発現による心筋細胞核の核の単離および同定を記載します。 PCM1発現とフローサイトメトリーを用いて検出されたEDUの取り込み。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

それは心臓が損傷後の心筋細胞を再生するための限られた可能性を秘めていると心筋細胞のターンオーバーの低レベルは正常な老化の間に発生することがことが認められているが、これらのイベントの定量化は依然として厳しいです。これは、プロセスの希少性と複数の細胞源は、心筋の維持に寄与しているという事実に一部です。さらに、心筋細胞内のDNAの複製は、多くの場合、倍数体、心筋細胞につながり、まれにしか細胞分裂によって新たな心筋細胞につながりません。正確にこれらのプロセス間の心筋細胞のターンオーバーの差別を定量化するためには不可欠です。ここで説明するプロトコルは、核の単離およびその後のPCM1の免疫標識を利用することによって同定されたDNAの複製および心筋細胞核の結果として発生したすべての核を標識するために、長期的なヌクレオシドラベリングを採用しています。一緒にこれはCのヌクレオシド標識の正確かつ敏感な同定を可能にします核人口をardiomyocyte。また、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニル標識および核倍数性の分析は、倍数体の間ヌクレオシド組み込んだ核からネオ心筋細胞核の識別を可能にします。この方法は、心筋細胞の二核性のために制御することはできませんが倍数体を考慮しながら、それはネオ心筋細胞核の迅速かつ堅牢な定量化を可能にします。この方法は、心筋細胞の再生を増強するために潜在的な治療薬を評価または心筋細胞のターンオーバーと倍数性に心臓疾患の影響を調査するなど、下流のアプリケーションの数を持っています。この技法は、すべての心臓細胞型においてヌクレオシドの取り込みの定量化を可能にする付加的な下流の免疫組織学的技術と互換性があります。

増加倍数体のために制御しながら、この方法が原因心筋細胞核の分裂に増加EDUの取り込みの定量化を可能にします。 BrdUのベースアッセイを使用して、我々は以前に、哺乳動物の心臓が新しい心筋細胞の再生と、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおいて、慢性心筋細胞の損失に応答することを実証しました。我々はさらに、当社の公開調査結果を検証するために、プロトコルの有用性を実証するために、ここで説明する方法を使用しています。記載されたプロトコルに従って、成人（12週齢） のmdxと制御BL10マウスは7日間EDUの1日1回の注射でパルスした、実験群5,13間の静的解析を可能にするために、以前に報告されました。パルス状の心の免疫組織学的分析は、EDU（ 図3A）に組み込まれている心筋細胞を表現PCM1の存在を示しています。しかし、データが取得usinEDUが組み込まれている他の細胞型は、心筋細胞と誤認することができるように、G免疫組織学的方法は、誤って解釈することができます。この例では補足図1A及びBに示されています。さらに、免疫組織学的方法は、原子力部門の倍数体を区別しません。倍数体にEDUを組み込まれた細胞を除外しつつ、このプロトコルで詳述フローサイトメトリー分析は、MDXと対照マウスでは心筋細胞の核分裂の急速な定量化を可能にします。以前に公表されたデータ13と同様に、分析は、コントロールと一致した年齢に比べてmdxマウス心臓におけるネオ心筋細胞核発生率の増加を明らかにした（0.17％に対し1.2％; 図3BおよびC）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> 図3： </strong&gt; EDUの定量化は、野生型および MDX 心の 中で心筋細胞を標識した 。MDX心の40μmの厚さの切片から取られたZ-スタック投影の（A）の画像。 PCM-1を発現する心筋細胞核EDU（赤）を組み込んでいる（緑）。黄色の矢印は、EDUは、心筋細胞を標識した示しています。 IおよびIIは、個々のEDUは、Z平面に示した心筋細胞を標識した示しています。 （ - C57 / BL10の背景に/ yの MDX）核はDAPI（青）（BおよびC）フローサイトメトリー、単離された核の流れ12-13週齢の野生型（C57 / BL10）とmdxマウスからの代表的なプロットを示すで標識しました。 （B）ヒストグラムは2Nと&gt; 2N核との間のDAPI強度や差別を示します。このプロトコルで詳述されるように分析した場合、2Nの心筋細胞核集団におけるEDUの取り込みを示す（C）プロット。すべてのマウスについてエドゥは1から1週間投与しました生後2週間。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足図1：PCM-1は、心筋細胞核の特異的マーカーであるプロトコルを使用するには、核がROSA NT / NG CRE敏感なレポーターライン16とTNT-CREマウス14を交配することによって生成さ二重トランスジェニックマウスから単離した説明しました。トロポニンT（TNT）プロモーターの制御下で、得られたマウスのCREの活性化では核に局在するとGFPの不可逆的な発現をもたらします。核はアイソタイプコントロール（ISO）で標識された心筋細胞核集団を（530分の488/30 A）を発現するGFPを特定する能力を示しています。抗PCM1（二次抗体633から660/20-Aによって検出される）との核の標識は、GFPを発現するcardiomyocyとPCM1発現の相関関係を示していますTE核人口。この例では、TNTのプロモーター活性によって識別されるように心筋細胞核の98.8パーセントは、PCM1抗体によって標識されている。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">補足図1をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 補足図2： 免疫組織学的手法により心筋細胞の再生を定量化するための課題 （A）2DイメージもEDU（ ​​赤）のために標識されるように表示される2つのPCM-1を発現する心筋細胞の核（緑）を示しています。黄色の矢印は、EDUが組み込まれている心筋細胞と思われるものを示しています。これは、PCM1発現とEDUのラベリング2次元イメージングを用いて可視化の見かけの共局在化にあります。 （B）この画像の3次元投影は、EDUは、細胞が心筋細胞ではなく、PC上に重なる非心筋細胞である、標識を識別するM1は、心筋細胞の核を表現します。 C57 / BL10マウス実験のために使用生後12週で。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">補足図2Aをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">補足図2Bをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 反応成分 </td><td colspan="2"> 反応数 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875μlの</td><td> 2.19ミリリットル</td></tr><tr><td>銅の保護</td><td> 20μlの</td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>蛍光色素ピコリルアジド</td><td> 5μlの</td><td> 12.5μlの</td></tr><tr><td>希釈した反応4.1で調製した緩衝液</td><td> 100μlの</td><td> 250μlの</td></tr><tr><td>全反応容量</td><td> 1ミリリットル</td><td> 2.5ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表2：EDU カクテル成分 。プロトコルセクション4（EDUの取り込みの検出）に必要なEDUのラベリングカクテルのレシピ。

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K ビュー.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

ビデオ: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

遺伝学

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

発生生物学

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

事後組織から心筋細胞核の分離

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

医学

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

生物学

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

hiPSC由来心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルと心筋細胞収縮の映像的比較

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...