Supportato da l&#39;Istituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant &#39;linfopoiesi&#39;), il REVIVE futuro programma di investimenti e &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Dichiarazione etica: tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo l&#39;Istituto Pasteur Etica Carta, approvato dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese, e gli orientamenti dell&#39;Unione europea. Un manipolatore con la formazione su piccola chirurgia roditore, certificato dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese, esegue tutti gli interventi chirurgici. NOTA: Vedere in allegato la tabella 1 mostra la procedura di programma in 5 fasi. 1. Selezione degli embrioni <ol><li> Utilizzare 36 C57BL femmine / 6 CD45.2, 12 femmine CD45.1, 12 C57BL / 6 maschi e 12 CD45.1 C57BL / 6 maschi CD45.2. Attraversando le femmine sia con genotipo maschio produrrà embrioni CD45.1 / 2 e CD45.1 usati come fonte di TSP o CD45.2 utilizzato come fonte di destinatario lobi timici. Casa tutti i maschi singolarmente. </li><li> Per ottenere embrioni per isolamento E18 TSP, mettere 2 femmine in una gabbia con uno CD45.1 maschile alle 06:00, 21 giorni prima dell&#39;esperimento innesto. Verificare la presenza di un tappo vaginale il giorno dopo, prima di mezzogiorno. Sepavalutare le femmine collegati. </li><li> Per ottenere gli embrioni E14 per essere colonizzata da TSP, ripetere la procedura (1.2), utilizzando i maschi CD45.2, 17 giorni prima dell&#39;esperimento innesto. </li><li> Per ottenere gli embrioni per isolare E13 TSP, ripetere la procedura (1.2), utilizzando i maschi C57BL / 6 CD45.1, 16 giorni prima dell&#39;esperimento innesto. </li></ol> 2. Dissezione del embrioni Sotto una orizzontale flusso laminare Hood NOTA: due giorni prima dell&#39;esperimento innesto. <ol><li> Sacrificare le femmine gravide per dislocazione cervicale o progressiva somministrazione di gas CO 2 per almeno 5 minuti, in una camera chiusa saturante. Garantire la morte per arresto definitivo dei movimenti cardio-respiratorio. Bagnare l&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Fate una incisione longitudinale nella pelle all&#39;addome linea mediana e aprirlo tirando la pelle a parte. Aprire il peritoneo con pinze e forbici senza toccare il tratto digestivo. Estrarre il uter bifidanoi e separarlo dalla vagina con le forbici. </li><li> Mettere l&#39;utero in una capsula di Petri di 90 x 15 mm, contenente 40-50 ml DPBS e tagliare trasversalmente tra decidua di ogni embrione. </li><li> Con la coppia di forbici punta fine e una pinza sottile rimuovere la membrana muscolare dell&#39;utero, togliere gli embrioni tagliando tra la placenta e il sacco vitellino, e rimuovere i amnios, che è mantenere gli embrioni. </li><li> Mettere gli embrioni in una capsula di Petri 90 x 15 mm contenente siero fetale di vitello HBSS + 1% (FCS). Per gli embrioni più vecchio di E15, togliere le teste con un paio di forbici prima di ogni ulteriore dissezione. </li></ol> 3. Isolamento del timo <ol><li> Sotto la lente d&#39;ingrandimento binoculare, posizionare l&#39;embrione, che giace in posizione supina (vista ventrale), su un letto di garza umida. </li><li> Inserire una pinza longitudinalmente lungo la cartilagine dello sterno, pizzico e aprire la griglia toracica. Con pinze curve, tirare la parete toracica da parte per visualizzare il tlobi hymic su ciascun lato della trachea. </li><li> Tenere con cura ogni lobo pizzicando sotto con una pinza sottile e metterli in una capsula di Petri contenente 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolare i lobi e rimuovere il tessuto connettivo circostante con due 1 ml siringhe + 26 G ⅜ &quot;aghi, senza danneggiare la capsula. </li><li> Lavare lobi in 3 ml di HBSS + 1% FCS per eliminare le cellule del sangue. NOTA: Prima E15, lobi timici sono situate su ciascun lato della trachea e fusibile successivamente nel mezzo di costituire un organo bi-lobare. </li></ol> 4. sospensioni cellulari <ol><li> Tease oltre i lobi sotto la lente di ingrandimento binoculare, con due aghi 26 G montate su 1 ml siringhe, in HBSS + 1% FCS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon. </li></ol> 5. La colorazione con anticorpi fluorescenti e ordinamento delle cellule NOTA: Tutti gli anticorpi sono già titolati per ottenere la definizione ottimale delle popolazioni (il titration può variare con il lotto di anticorpi). <ol><li> Incubare i timociti (E13 o E18) per 15-30 minuti a 4 ° C con 100 pl di un cocktail di anticorpi biotinilati per colorare le cellule positive lineage (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , CD11c anti-, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Per lavare via l&#39;eccesso di anticorpi rallentano i tubi con 4 ml HBSS + 1% FCS a 280 xg per 7 minuti, eliminare il supernatante e ri-sospensione il pellet in fresco HBSS + 1% FCS. Ripetere la centrifugazione. </li><li> Incubare le cellule marcati con biotina E18 con microsfere streptavidina durante 15 min a 4 ° C e lavare le cellule due volte in HBSS 1% FCS. Risospendere le cellule in 2 ml HBSS + 1% FCS. La maggior parte dei timociti E13 sono lignaggio negativo e, pertanto, non hanno bisogno di MACS arricchimento prima separazione delle cellule. </li><li> Passare le celle nella colonna LS, secondo le istruzioni del produttore. Quando tutta la sospensione cellulare è entrato colonna aggiungere 2 ml HBSS + 1% FCS. Recuperare il4 ml della colonna scorrono attraverso e centrifugare le cellule per 7 minuti a 280 x g. </li><li> Risospendere il pellet di una impoverito E18 o totali timociti E13 in 50 ml di miscela di anticorpi TSP (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 e streptavidina Pacific Blue ) e incubare per 20 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 4 ml HBSS + 1% FCS e risospendere le cellule in 1 ml HBSS + 1% FCS con ioduro di propidio. </li><li> Ordinare il TSP Lin - CD44 + CD117 + CD24 basso CD127 + CD135 + cellule in un FACS (con 4 laser) su un provette da 1,5 ml contenenti 200 ml terreno completo + 20% FCS. Prima porta le cellule in base alle loro dimensioni e granularità sulla FSC e canali SSC. Eliminare le cellule morte (colorazione con ioduro di propidio), cancello fuori doppiette e segnare la fluorescenza in scala esponenziale. Circa 100 o 600 TSP possono essere ottenuti da uno E13 o E18 uno timo, respectively. </li></ol> 6. La colonizzazione di E14 timica lobi con Progenitori: Hanging Tecnica Goccia <ol><li> Irradiare (30 Grays = 30 Gy) E14 lobi del timo da embrioni CD45.2, 3 ore prima della cultura. NOTA: E14 o E15 lobi timici sono stati utilizzati con successo come destinatario di progenitori delle cellule T. Utilizzando destinatari lobi timici di successivi giorni gestazionale risultati in necrosi precoce a causa delle dimensioni più grandi dell&#39;organo mentre lobi del timo in precedenti giorni di gestazione sviluppano male, probabilmente a causa di sviluppo incompleto delle cellule epiteliali. </li><li> Centrifuga allineati TSP e risospendere le cellule in terreno di coltura (OPTI-MEM terreno completo con il 10% FCS, penicillina (50 unità / ml), streptomicina (50 mg / ml) e 2β-mercaptoetanolo (50 micron)) tale che 35 ml contiene 500 TSP. </li><li> Mettere una goccia di 35 ml di sospensione cellulare ogni altro bene di una piastra ben Terasaki 60. NOTA: 35 gocce microlitri può fondere se sono collocati in pozzi contigui. </li><li> Inserire un lobo irradiati sulla superficie di ciascuna goccia. Chiudere la piastra Terasaki e ruotare la piastra capovolta per consentire le cellule raggiungono il polo apicale della goccia per gravità. </li><li> Hit delicatamente il lato superiore della piastra capovolta per obbligare i lobi di scorrere verso il bordo apicale della goccia. Incubare la piastra Terasaki invertita in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 ° C + 5% CO 2. Dopo la colonizzazione, sia la cultura E14 thymi in FTOC 7, o trapianto sotto la capsula renale di un destinatario del mouse per adulti 8. </li></ol> 7. fetale timica Cultura Organo <ol><li> Inserire 3 ml di terreno completo su una piastra di Petri da 35 mm. Inserire un filtro a membrana isopore galleggia sul supporto. Posizionare i lobi ricostituiti sul bordo della membrana con una pinza (non più di 8 lobi su una membrana). </li><li> Porre le capsule Petri contenenti lobi timici all&#39;interno di un piatto 90 millimetri Petri, insieme con un piatto 35 mm, senza coperchio, contenente 2 ml di water, per assicurare l&#39;umidità ottimale. Incubare 12 giorni a 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Innesti sotto la capsula renale Under sterili Condizioni NOTA: Il parenchima renale è circondato da tessuto connettivo formando una capsula. La regione sub-capsulare è particolarmente ricca di vasi sanguigni e linfatici fornendo in tal modo un ambiente adatto per lo sviluppo di innesti (ad esempio, i lobi del timo, isole pancreatiche o cuori neonati). Innesti si realizza al rene sinistro perché è più accessibile rispetto al rene destro. CD3 - / - topi maschi sono stati utilizzati come destinatari evitando reazione GVH a causa di antigeni di istocompatibilità minori legate al cromosoma Y, perché la determinazione del sesso prima di E15 non è fatto facilmente. <ol><li> Sterilizzare gli strumenti ed indossare guanti sterili lungo la chirurgia. Anestetizzare il mouse per iniezione intra peritoneale di una soluzione di ketamina 10 mg / ml + Xylazina 1 mg /ml diluito in PBS: (50 a 100 microlitri per 10 g di peso corporeo), utilizzando una siringa da 1 ml. Verificare anestesia verificando la mancanza di riflessi interdigitali. Mettere una goccia di gel idro-Optimune su ciascun occhio per prevenire la disidratazione durante l&#39;anestesia. NOTA: La soluzione deve essere preparata estemporaneamente e riscaldata a temperatura ambiente prima dell&#39;iniezione. L&#39;anestesia dura almeno 20 minuti. Il grado di anestesia dovrebbe essere controllato lungo tutta la chirurgia. L&#39;anestesia può essere prolungata iniezione intra peritoneale di mezza dose ogni 20 min. </li><li> Posizionare il mouse sul lato destro, sotto una cappa a flusso lamina orizzontale. Sterilizzare il campo chirurgico con etanolo al 70% e il 10% di soluzione di ioduro dermica. Con una parte pinza capelli mouse lungo una lunghezza di 2 centimetri appena sopra l&#39;articolazione della zampa posteriore. Radere l&#39;area chirurgica. </li><li> Con un bisturi praticare un&#39;incisione 1,5 cm di lunghezza della prima, il tessuto cutaneo, quindi con forbici tagliare il tessuto muscolare. Applicare una leggera pressione su entrambi i lati dell&#39;incisione, Che costringerà il rene fuori della cavità addominale. </li><li> Applicare soluzione salina con un batuffolo di cotone con auricolari per mantenere il rene umido. Se avete difficoltà a esporre l&#39;organo, utilizzare una pinza piatta per estrarre il tessuto adipociti circostante a cui è collegato il rene. Mantenere il rene fuori della cavità retroperitoneale da un batuffolo di cotone posto sotto l&#39;organo. </li><li> Con due pinza sottile, praticare un foro 2-3 mm nella capsula (evitare di toccare il parenchima per prevenire le emorragie). Durante tutta la procedura chirurgica mantenere la capsula renale esposti continuamente inumidito. </li><li> Inserire attentamente i lobi sotto la capsula renale, mantenendo la parete della capsula aperta e far scorrere l&#39;innesto sotto la capsula verso il polo bordo. Posizionare fino a 6 lobi per rene. </li><li> Sostituire il rene nella cavità retro-peritoneale. Suturare la aponeurosi muscolare, poi la pelle con i singoli nodi chirurgo. Bagnare la ferita con soluzione al 10% di povidone ioduro. Posizionare il mouse su una pa riscaldatod a 37 ° C. </li><li> Indagine il mouse trapiantato fino al completo recupero dall&#39;anestesia per il controllo dei movimenti cardiaci, respiratori e basette, i colori delle mucose fino al recupero totale visto da Self Contained movimenti. NOTA: si consiglia l&#39;iniezione di soluzione analgesico (buprenorfina, 0,1 mg / kg) del muscolo intra subito dopo l&#39;intervento chirurgico e 2 giorni dopo l&#39;intervento per prevenire il dolore post-operatorio. </li><li> Mantenere l&#39;animale operato in isolamento fino alla completa guarigione. Controllare ogni giorno i punti della ferita per verificare e prevenire l&#39;infezione. Mai osservata infezione della ferita seguendo questa procedura. NOTA: analisi settimanale di cellule del sangue periferico dal CD3 - / - mice innestate consentono di rilevare la timica popolazioni provenienti originati sia da E13 o E18 progenitori utilizzando il marcatore allotypic CD45 e lignaggio cellule T anticorpi specifici (Figura 3). </li></ol> 9. Analisi della progenie TSP mediante citometria di flusso <ol><li&gt; stuzzicare il FTOCs individualmente per ottenere sospensioni singola cella (vedere paragrafo protocollo 4). </li><li> Sospensioni cellulari Macchia da lobi individuali con una miscela di anticorpi contenenti anticorpi che riconoscono CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE e incubare come descritto nel capitolo 5. </li><li> Risospendere le cellule in HBSS + 1% FCS + propidio ioduro e analizzare in un citometro a flusso (vedere i risultati in figura 2). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Due saggi principali possono essere utilizzati per analizzare differenziazione delle cellule T ex vivo. Il più recentemente riportato è il co-coltura di progenitori emopoietici con cellule stromali BM, OP9, esprimendo i ligandi di Noth1, delta come 1 o 4 12. Questo test 2-D è facile da eseguire, altamente efficiente e sensibile, permettendo analisi a livello di singola cellula. Tuttavia, esso non sostiene lo sviluppo delle cellule T oltre lo stadio di DP né la generazione di γδ DETC 13,</s...

Linfociti T, che porta il αβ o γδ recettore delle cellule T (TCR), si differenziano in un organo specializzato, il timo. Il timo completamente sviluppato è organizzato in due regioni distinte: la corteccia, dove progenitori timiche sviluppare e dove timociti che produttivamente riorganizzare i β TCR e catena geni α sono salvati dalla morte programmata (un processo noto come selezione positiva); e il midollo, dove scelto timociti con troppo forte reattività per auto-leganti vengono eliminati (selezione negativa) 1,2. Il timo proviene dallo strato endodermico del terzo sacchetto faringeo che è poi circondata da cellule mesenchimali 3. Si è colonizzata da progenitori ematopoietici a partire da giorno embrionali E12 e, da allora in poi, il reclutamento continua è necessaria per il normale sviluppo delle cellule T 4. Immigrati del timo evolvono attraverso fasi di sviluppo successive, orchestrato da un programma strettamente regolato, iniziato e maintained per l&#39;attivazione della via di segnalazione di Notch sui timociti in seguito all&#39;interazione con il suo ligando, delta come 4, espresso sulle cellule epiteliali del timo (TEC) 5. Sviluppo timocita inizia il cosiddetto CD4 - CD8 - doppia negativi (DN) fasi. Timociti DN possono essere ulteriormente suddivisi secondo l&#39;espressione di CD25 e CD44 in DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) suddivide ulteriormente il vano DN1 in 5 sottogruppi dove DN1A e b corrispondono ai primi progenitori timo (PTE). Timociti riordinare le δ, β e α catene TCR in fase di DN e sottoposti pre-TcR selezione (stadi DN3-DN4). Essi hanno inoltre il transito al CD4 + CD8 + doppio positiva (DP) del vano in cui la catena α TcR riorganizza prima sele positivi e negativiction. In questa fase la maggior parte dei timociti sono eliminati e solo una piccola percentuale (3-5%) raggiungono il CD4 + o CD8 + T maturi vano cella. La differenziazione percorso linfoide progredisce attraverso le tappe di HSC che generano progenitori multipotenti (MPP) e progenitori multipotenti linfoidi predisposte (LMPP) che hanno perso il eritrociti e megacariociti potenziale 6. LMPP sono fenotipicamente definito dall&#39;assenza di marcatori di cellule del sangue differenziate (lineage negative, Lin -), l&#39;espressione di c-kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e l&#39;assenza di livelli rilevabili di interleuchina ( IL) -7 recettore α catena (IL-7rα o CD127). LMPPs ulteriormente differenziarsi in progenitori comuni linfoidi (CLP) 7 che a quel punto hanno perso la capacità di generare cellule mieloidi. CLP conservare linfociti (B e T cellulare), delle cellule NK, DC e cellule linfoidi innate (ILC) potenziale, e differiscono da LMPP dall&#39;espressione di CD127 e l&#39;assenza di elevati livelli di Sca-1. Anche se la natura dei timici assestamento progenitori (TSP) è stato ampiamente dibattuto 8, è diventato recentemente chiaro che il cambiamento TSP fenotipo, il potenziale e la funzione di differenziazione, durante tutto lo sviluppo 9. Abbiamo eseguito in vitro e in vivo per caratterizzare il TSP, isolato da FACS cell sorting sia da E13 (prima onda) o E18 (seconda ondata). Fetali colture d&#39;organo del timo (FTOC) con lobi timici irradiati colonizzate da un numero uguale di E13 e E18 progenitori, tenendo diversi marker allotypic, ammessi dopo la loro prole in un ambiente di sviluppo simile e rivelate cellule proprietà intrinseche, diversi tra i due tipi di progenitori. Lobi del timo colonizzati da una E13 o E18 TSP permesso lo sviluppo senza selezione a causa della concorrenza tra i due progenitori. In vivo il trapianto dei lobi timici colonizzati ha dimostrato inoltre che anche tegli progenie maturo di E13 e E18 TSP hanno differenti proprietà biologiche in vivo. TSP dalla prima ondata rapidamente generano cellule T, ma danno origine a un basso numero di cellule αβ e γδ T. Tra questi ultimi abbiamo rilevato dendritiche cellule epiteliali Vγ5Vδ1 T (detc), che hanno un TcR invariante, migrano verso l&#39;epidermide in cui esercitano una funzione nella guarigione delle ferite e sono prodotti solo durante lo sviluppo embrionale 10. Al contrario, TSP dalla seconda ondata richiede tempo maggiore per generare un numero elevato di cellule TcR + T e non sono in grado di generare DETC.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>26 G &amp;frac38;&quot; 0.45 x 10 mm syringes with needles</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspension</td></tr><tr><td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtration of cells</td></tr><tr><td>Ethanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Iodide Povidone 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Ketamine 100 mg/ml (stock solution)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anesthesic and muscle relaxant</td></tr><tr><td>Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morphinic analgesic</td></tr><tr><td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Eye protection</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>to isolate embryos</td></tr><tr><td>HBSS Hanks&#039; Balanced Salt Solution (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>to wash out the blood and dissect the embryos</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medium for cultures</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>Penicilin and streptomycin</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotics for cultures</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Cold lamp source</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Two goose neck fibers adapted</td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissecting Pad</td></tr><tr><td>Spoon, round and perforated</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Fine iris scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>2 pairs of fine straight watchmakers&amp;rsquo; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Needle-holder</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td></tr><tr><td>Membrane Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>For FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 wells plates</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>For hanging drop technique</td></tr><tr><td>Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>To apply disinfecting solution</td></tr><tr><td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td><td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&amp;nbsp;</td><td>Clone Number see table below</td><td>Staining cells</td></tr><tr><td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Cell depletion</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&amp;nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td><td>Source of cells and thymic lobes</td></tr><tr><td>Mice</td><td>CDTA Orl&amp;eacute;ans, France</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Grafting experiment</td></tr></tbody></table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

Caratterizzare timo sedimentazione progenitori è importante per comprendere le fasi di pre-timici di sviluppo delle cellule T, essenziale per elaborare strategie di sostituzione delle cellule T nei pazienti linfocitopenico. Abbiamo studiato timica stabilirsi progenitori da murino giorno embrionale 13 e 18 thymi da due complementari in vitro ed in vivo le tecniche, sia in base al metodo &quot;goccia appeso&quot;. Questo metodo ha permesso la colonizzazione irradiati lobi del timo fetale con E13 e / o E18 progenitori timo distinguono per CD45 marcatori allotypic e successive loro progenie così. La colonizzazione con popolazioni miste consente l&#39;analisi di cellule differenze autonome in proprietà biologiche dei progenitori, mentre la colonizzazione sia con popolazione rimuove eventuali pressioni selettive competitive. I lobi timici colonizzati possono anche essere innestati immunodeficienti topi riceventi maschi consentono l&#39;analisi della progenie di cellule T mature in vivo, quali la dinamica di popolazione di tegli PERIFERICA sistema immunitario e colonizzazione dei vari tessuti ed organi. Colture d&#39;organo timo fetali hanno rivelato che i progenitori E13 sviluppato rapidamente in tutto mature cellule CD3 + e hanno dato luogo al sottoinsieme di cellule T γδ canonica, noto come le cellule T epiteliali dendritiche. In confronto, i progenitori E18 hanno una differenziazione ritardata e non erano in grado di generare cellule epiteliali T dendritiche. Il monitoraggio di sangue periferico di timo-innestato CD3 - / - mice inoltre dimostrato che progenitori E18 timica decantazione generano, con il tempo, un maggior numero di cellule T mature rispetto ai loro omologhi E13, una caratteristica che non poteva essere apprezzata nel timo fetale breve termine colture d&#39;organo.

Per scegliere un metodo per esaurire lobi timici di timociti endogeni che permettono il migliore sviluppo dei progenitori colonizzatrici, abbiamo confrontato i livelli di ricostituzione delle cellule T in lobi del timo colonizzati dopo l&#39;irradiazione o un desossi-guanosina 5 giorni (d-Gua) trattamento. I risultati mostrano che, mentre non vi è alcuna differenza a giorno 9 della cultura, lobi irradiati contenevano più cellule T rispetto a quelli trattati con d-Gua, al giorno 12. Pertanto, l&#39;irraggiamento è pi?...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K Views.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Biologia

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Immunologia e infezioni

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Ricerca sul cancro

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ricreare il microambiente timico con organoidi derivati da iPSC

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulle cellule epiteliali timiche e sulle cellule T con organoidi timici umani

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso

Riepilogo

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Capitoli in questo video

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

Derivazione di cellule T

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali