Gli autori desiderano ringraziare la piattaforma Montpellier Rio Imaging (MRI) in cui sono state effettuate le acquisizioni. Ringraziano Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget per il loro aiuto in diverse parti del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Tutte le procedure sugli animali in questo protocollo sono in stretta aderenza con le linee guida della Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86-609/EEC). Casa dei topi in gruppo, permettendo cibo e acqua ad libitum. Mantenerle in un ambiente controllato (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% di umidità), con una 12 ore: 12 ore di luce: ciclo di buio (luce alle 07:00). 1 Culture di cellule murine primari:. Fibroblasti embrionali di topo (MEF) <ol><li> Autoclave pinze sottili, così come pinze curve e forbici dissezione. Conservare in un contenitore sterile. Utilizzare sterile D-PBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Preparare mezzo completo MEF: modificata mezzo Eagle Dulbecco (DMEM) / F12 supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1 mM L-glutammina, 1 mM piruvato di sodio, 1% di amminoacidi non essenziali, e 0,5 mM 2-mercaptoetanolo e caldo a 37 ° C. </li><li> Euthanize un topo in stato di gravidanza (a 13,5 giorni post-coitum (DPC)) Per dislocazione cervicale. Rimuovere le corna uterine dal mouse igienizzato con il 90% EtOH. Sotto una cappa sterile e pulito, mettere le corna con gli embrioni nel 37 ° C preriscaldata D-PBS. Aprire la corna, posto gli embrioni in una plastica sterile capsula di Petri 100 mm, li ripulire dal materiale cordone ombelicale e lavarli con acqua calda D-PBS per rimuovere l&#39;eccesso di sangue. Sotto un binocolo, rimuovere gli arti dell&#39;embrione, gli organi interni e la parte superiore della testa contiene il cervello. </li><li> In un nuovo piatto di Petri, tritare il embrioni in pezzi molto piccoli con un chirurgico sterile lama o forbici (almeno per 1 min). Nel caso di embrioni di diversi genotipi, stare attenti a mettere ogni embrione nelle singole piastre di Petri e mantenere la coda o la testa superiore per la genotipizzazione. </li><li> Coprire l&#39;embrione con 1x tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 1 mM EDTA). Incubare per 30 minuti a 1 ora a 37 ° C incubatore. Aggiungere 10 ml di completoMEF mezzo per fermare la reazione tripsina. Pipettare su e giù per rimuovere tutti gli aggregati. Lasciare riposare la sospensione cellulare in una provetta 50 ml (riempito con mezzo completo) per 10 min, e centrifugare il surnatante per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in mezzo completo (6 ml per 1 embrione). Cellule nucleate vitali possono essere contati utilizzando trypan blu (Circa 5 x 10 6 cellule può aspettare da un embrione). Piatto 3 ml per 60 millimetri piatto di Petri. </li><li> Cambiare il mezzo il giorno successivo e permettono alle cellule di crescere fino a quando i piatti sono confluenti. Molti tipi di cellule possono essere visti, ma solo fibroblasti sopravviverà sottocultura. </li><li> Dividere le celle e permettono loro di crescere in 35 piatti mm con fondo di vetro (importante per esperimento lasso di tempo), fino al 50-70% di confluenza per la trasfezione. Test per Mycoplasma e agenti patogeni mouse. </li></ol> 2. Culture Adaptations nel caso di neuroni <ol><li> Il giorno prima la cultura, cappotto di 35 millimetri di vetro fondo piastre di Petri con poli-L-lisina (200 ml di 0,1 mg / ml) sotto una cappa sterile e pulito, e lasciare tutta la notte. </li><li> La mattina successiva, sciacquare con acqua pura sterile, due volte per 5 min e una volta per 45 minuti a 1 ora. Sostituire con 2 ml di DMEM + 10% FBS medie e tenere in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Sezionare embrioni a 18,5 dpc. Sotto una cappa sterile e pulito, mettere le corna con gli embrioni in freddo sterile HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) a 100 millimetri piatto di Petri. Cuccioli neonatali possono anche essere utilizzati al posto di embrioni al fine di preservare la durata della diga e consentirgli di produrre più discendenti, soprattutto nel caso di animali transgenici che possono essere difficili da ottenere. Nei singoli piatti Petri, prendere ogni embrione o neonato e tagliare la testa con le forbici. Tenere la testa inserendo pinze curve negli occhi, tagliare la pelle e aprire con cautela il cranio molle dal retrodella testa fino agli occhi, su ciascun lato della testa. Tagliare i nervi ottici ed il tronco cerebrale, rimuovere il cervello, e metterlo in un nuovo piatto di Petri contenente HBSS. Sotto uno stereoscopio, rimuovere tutte le meningi con due pinze sottili. Separare ippocampi, la corteccia o qualsiasi altra parte del cervello in funzione della struttura di studiare. </li><li> Immergere la struttura del cervello sezionato in 4,5 ml di HBSS freddo preparato in precedenza in provette da 15 ml e tenere in ghiaccio fino digestione con tripsina. Aggiungere 0,5 ml di 2,5% tripsina e incubare a 37 ° C per 15 min a 20 min. Sciacquare il 3x tripsina con HBSS, essere estremamente attenti a non scartare le parti del cervello digeriti. </li><li> Risospendere in 500 microlitri (ippocampo) a 1 ml (corteccia) DMEM + 10% FBS e pipettare su e giù parecchie volte con un ml micropipetta 1 dotato di una punta di 1 ml, quindi dotato di 1 ml più 200 consigli microlitri, finché non ci sarà nessun aggregato visibile. </li><li> Distribuire 100-200 ml di sospensione cellulare ad ogni botto vetro 35 millimetrim piatto contenente DMEM + 10% FBS e lasciare che i neuroni aderiscono a 37 ° C per almeno 3 ore. Sostituire con neurone preriscaldata mezzo completo (Neurobasal mezzo supplementato con 250 mM L-glutammina e NS21, preparato come descritto in Chen et al. 19) e lasciato a 37 ° C per permettere la crescita neuronale. Transfettare i neuroni a 5 a 14 giorni in vitro (div) (l&#39;efficienza di trasfezione è più elevato dopo un paio di connessioni sinaptiche div, ma sono meglio stabilito 7-10 div). </li></ol> 3. Trasfezione di EGFP-G3BP1 Construct Trasfezione delle cellule con un vettore contenente il cDNA della proteina di interesse (qualsiasi componente di SGS) fuso con un marcatore fluorescente (GFP, YFP, ecc), utilizzando 3 pg di plasmide purificato per piastra da 35 mm. <ol><li> Transfettare il MEF utilizzando un metodo commerciale, seguendo il protocollo del produttore (Vedi Tabella dei materiali / reagenti). </li><li> Transfettare i neuroni con un calcioMetodo di fosfato adattato da Xia et al 20 brevemente.: <ol><li> Preparare le soluzioni: DMEM-wash: DMEM contenente 25 mM KCl; soluzione di trasfezione: DMEM-lavaggio contenente 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, rosso fenolo); e la soluzione choc: HeBS 1x, DMKY 1x, e DMSO 2% (v / v); e tenerli a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il supporto dai neuroni, filtrato, e la tiene a 37 ° C. Lavare con DMEM-wash quindi sostituire con terreno di trasfezione e mantenere a 37 ° C durante la preparazione dei calcio fosfato plasmide precipitati DNA. </li><li> In una provetta da 1,5 ml, aggiungere (in questo ordine) Braun acqua (volume finale di 50 ml), 5 ml di CaCl 2 2,5 M e 3 microgrammi di plasmide DNA. Cadere questo mix su 50 ml di HeBS 2x già introdotti in un tubo tondo fondo in polipropilene. Mescolare il tubo dalla rotazione insieme con l&#39;eliminazione. Lasciare la forma precipitato a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Aggiungere il precipitate goccia a goccia sui neuroni e lasciare a 37 ° C durante 30 a 50 min. </li><li> Sostituire con una soluzione shock per 1 minuto, quindi risciacquare con DMEM-wash e, infine, reintrodurre il mezzo precondizionato. Conservare le cellule a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualizzazione G3BP contenenti SGs Montaggio e Dynamics <ol><li> Sostituire il medium delle cellule che contiene rosso fenolo da terreno privo di rosso fenolo. </li><li> Utilizzare un microscopio confocale equipaggiato con fluorescenza per le acquisizioni. Accendere i sistemi microscopio: lampada a mercurio, computer e laser. Riscaldare la camera a 37 ° C per almeno 20 minuti prima dell&#39;inizio delle acquisizioni. </li><li> L&#39;espressione sopra del G3BP induce la formazione spontanea di un tipo di SGS. Le cellule possono quindi essere osservati per l&#39;assemblaggio di SGs 24 ore dopo la trasfezione, senza induzione di stress. In alternativa, lo stress può essere indotto a indurre ulteriormente l&#39;assemblaggio della SGS. Aggiungere 0,5 mM arsenito di sodio e di stellet dell&#39;acquisizione subito dopo l&#39;aggiunta del composto (granuli saranno ben formate entro 1 ora). </li><li> Aggiungere olio l&#39;obiettivo ad immersione (usare 40X o 63X obiettivi) e installare la piastra di Petri rispetto all&#39;obiettivo nel supporto microscopio 35 millimetri adattato, stabilizzato sul supporto palco. Verificare che il piatto è piatto altrimenti le acquisizioni verranno alterati. Accendere la luce di fluorescenza secondo il fluoroforo rilevante e visualizzare le cellule trasfettate. Spegnere fluorescenza volta che una cellula di interesse nel settore al fine di minimizzare il candeggio e citotossicità. </li><li> Nella &quot;acquisire scheda&quot;, selezionare i laser in funzione della lunghezza d&#39;onda di eccitazione del fluoroforo tag (488 nm nel nostro protocollo che utilizza G3BP EGFP-tag) e seleziona la lunghezza emissione adattato per la PMT (tubo fotomoltiplicatore). Regolare la potenza del laser (di solito non più del 10%) per ridurre il rumore e sovrasaturazione nonché tossicità, e impostare il guadagno e offset di modificare il rapporto segnale-rumore.Scansione veloce (1,000 Hz), al fine di minimizzare la durata di esposizione laser (line media 2, media telaio 1). Se lo si desidera, impostare i parametri per la pila Z per poter ricostruire l&#39;immagine in 3D (una fase Z di 1 micron di solito va bene con le cellule). Determinare l&#39;intervallo di tempo tra ogni acquisizione: intervalli più piccoli permettono di ottenere un film più coerente ma questo può indurre fotoscolorimento e tossicità (un intervallo di 20 secondi è stato usato negli esperimenti descritti). Durata di acquisizione totale può variare a seconda del tipo di stress. Molti SGS-G3BP contenente si formano molto rapidamente sotto trattamento arsenito e sono ben visibili dopo 1 ora di trattamento: in tal caso, scegliere rapidamente le cellule per filmare e avviare le acquisizioni a destra dopo lo stress, con una durata complessiva di acquisizioni di 15 - 20 min ampiamente sufficiente per osservare l&#39;assemblaggio di diversi SGS. </li><li> Salvare le immagini e ricostruire le pile e film utilizzando il software ImageJ. </li></ol>

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	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+granules:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability.">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules.">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li><li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein.">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li><li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein:+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1.">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li><li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+G3BPs:+tissue+specific+expression,+chromosomal+localisation+and+rasGAP(120)+binding+studies.">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li><li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#945;+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress.">PKC&#945; Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp:+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization.">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li><li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+helicase+VIII:+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein,+an+element+of+the+ras+transduction+pathway.">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li><li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha,+entry+to+cytoplasmic+stress+granules,+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs.">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li><li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+(G3BP)+is+a+modulator+of+USP10,+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease.">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li><li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP.">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+G3BP1,+the+stress+granules+assembly+factor,+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons.">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult.">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li><li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly.">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase/ERK-Dependent+Mechanism.">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li><li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2&#945;+phosphorylation.">Large G3BP-induced granules trigger eIF2&#945; phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I passaggi più critici del protocollo riguardano la trasfezione e più in particolare le acquisizioni lasso di tempo, che devono essere attentamente monitorati al fine di abbassare la citotossicità. Coltura di cellule primarie non è una parte difficile, finché le condizioni sterili sono mantenute e cautela è presa per evitare danni durante le fasi di dissezione e dissociazione cellulare. MEF può essere mantenuto congelato alle brevi passaggi. Neuron trasfezione con fosfato di calcio ha...

Granuli di stress (SGS) sono non-membranosa foci citoplasmatica formata come una risposta protettiva cellulare a stress ambientali, come la temperatura elevata, stress ossidativo, ipossia, shock osmotico, irradiazione UV, deprivazione di glucosio, o infezione virale 1. Essi possono essere indotti chimicamente mediante trattamento con composti come arsenito di sodio, che innesca lo stress ossidativo. SG accumulano in fase di stallo traduzione arrestato messaggero ribonucleoproteina (mRNPs) Complessi 2, sequestrando mRNA dal macchinario traslazionale, e il loro montaggio può essere attivato dalla fosforilazione di eIF2α (fattore di iniziazione eucariotica 2 α). SG sono strutture dinamiche che scambiano i componenti con le polisomi e altri granuli come il P-corpi. Essi costituiscono un &quot;centro di smistamento&quot;, dove mRNA sono ordinati ed elaborati sia per la traduzione, reinitiation, il degrado o l&#39;imballaggio in stabili mRNPs non polisomi 3. L&#39;assemblea di SGS è veloce but è un processo graduale, con iniziali numerosi piccoli aggregati che si coagulano in granuli più grandi. L&#39;uso di inibitori chimici che interrompono o stabilizzano i microtubuli mostra che è necessaria rete di microtubuli per dinamiche SG comprendenti processi di assemblaggio, di coalescenza e smontaggio. L&#39;assembly dinamico di SGS è anche favorito dalla aggregazione di specifici RNA-binding proteins (RNA-BP) come TIA-1 (T-cellulare interna antigene-1) e TIAR (proteina TIA-1-correlati), che sono in grado di dimerize e promuovere polisoma smontaggio e l&#39;instradamento di mRNA in SG 4. G3BP (RasGAP SH3 dominio di binding protein) è tale un RNA-BP che localizza a SGS quando le cellule sono stressati con arsenito o ad alta temperatura e sovraespressione di G3BP defosforilato può indurre SG gruppo 5. G3BP è evolutivamente conservata RNA-BP che è stato inizialmente caratterizzato attraverso la sua interazione con una proteina attivazione Ras-GTPasi (RasGAP p120 6); ma questa interazione è stato recentemente rivisitato 7. La famiglia G3BP comprende due membri nei mammiferi, G3BP1 (denominato G3BP) e G3BP2 8. Entrambe le proteine ​​colocalize in SGS, quando le cellule sono sottoposte a stress 9. G3BPs comprendono un dominio NTF2 N-terminale suggerito di influenzare la loro localizzazione e oligomerizzazione, seguiti da prolina ricchi (PxxP) motivi, quindi motivi C-terminale associato con RNA vincolante: il canonico RNA-Riconoscimento Motif (RRM) con RNP1 e RNP2 motivi conservati , seguita da un ricco casella arginina-glicina (RGG). È interessante notare che l&#39;analisi delle diverse parti della proteina creando diversi domini fuse ad EGFP dimostrato che il dominio NTF2-simili e il dominio legante l&#39;RNA erano i più efficientemente assunto per SGS, suggerendo l&#39;importanza delle proprietà di dimerizzazione e RNA vincolante l&#39;assemblea di SGS. Diversi modelli hanno rivelato diverse funzioni delle proteine ​​G3BP in vitro 10-13.Interruzione del G3BP nei topi hanno dimostrato l&#39;importanza di questa proteina in crescita dello sviluppo e sopravvivenza 14, così come un ruolo importante per G3BP nel Sistema Nervoso Centrale (SNC), caratterizzata da atassia e difetti nella memoria di lavoro spaziale 15. Carenza G3BP porta ad alterata plasticità neuronale e calcio omeostasi, stabilendo un collegamento diretto tra la formazione di SG e le malattie neurodegenerative 15. È quindi importante poter studiare la dinamica dello SGS in cellule primarie come neuroni. Questo protocollo fornisce un modo semplice per osservare l&#39;assemblaggio di-G3BP1 contenente SG in cellule primarie in trattamento arsenite. Può essere usato per studiare assembly SGs in condizioni diverse, ad esempio diversi tipi di stress. Può anche essere adattato ad altri granuli o altri costituenti del SGS. Infatti, questo protocollo si concentra sulla G3BP1, ma ci sono altri granuli di stress marcatori come TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (fragile X ritardo mentale Sindrome di proteine) 16, TDP-43 (DNA risposta transattivo binding protein 43) 17 o Staufen 18. In particolare, proteine ​​come TIA-1 / R sono, come G3BP, nucleazione RNA proteine ​​leganti che possono indurre assembly SGs quando overexpressed, anche se le varie SGs formate possono differire in funzione, regolazione e trascrizioni associati. Trasfezione versione fluoroforo-tag di una di queste componenti chiave o nucleatori di SG può essere eseguita per l&#39;immagine particolare assemblaggio e la dinamica SG.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)</td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Very thin, tips 0.1 mm</td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Can be useful to remove hippocampi</td></tr><tr><td>Polyplus transfection JetPEI reagent&amp;nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

SGs può essere visualizzato in cellule mediante immunocolorazione delle componenti proteici specifici o polyA + mRNA. SG sono altamente dinamico e lo studio del loro assemblaggio e il destino è importante per capire la risposta cellulare allo stress. Il deficit dei fattori chiave della SG come G3BP (RasGAP SH3 dominio Binding Protein) porta a difetti dello sviluppo in topi e alterazioni del Sistema Nervoso Centrale. Per studiare la dinamica di SG in cellule di un organismo, si può cellule primarie di cultura e seguire la localizzazione di un componente etichettato transfettate di SGS. Descriviamo esperimento di time-lapse per osservare-G3BP1 contenente SG in fibroblasti embrionali di topo (MEF). Questa tecnica può anche essere usato per studiare SGS-G3BP contenente neuroni in vivo, che è cruciale come è stato recentemente dimostrato che questi SGs si formano alla insorgenza di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Questo approccio può essere adattato a qualsiasi altro componente corpo cellulare e proteine ​​granuli, ed eseguitocon animali transgenici, permettendo lo studio vivo di granulati dinamiche per esempio in assenza di un fattore specifico di questi granuli.

Formazione stress granulo è importante nella risposta delle cellule allo stress, permettendo un adattamento cellulare con traduzione in stallo, finché lo stress ha autorizzato, associata alla prevenzione dell&#39;apoptosi. Permette questo test per studiare SGS in cellule primarie, seguendo la localizzazione delle principali componenti proteiche SGS (Figura 1). G3BP, un fattore chiave di montaggio SGS, è presente piuttosto diffusamente nel citoplasma di MEF coltivate o neuroni (Figura 2A A</st...

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Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Granuli di stress (SGS) sono granuli citoplasmatici RNA contenenti particelle in fase di stallo ribonucleoproteiche (RNP), e importante nella risposta cellulare alle varie sollecitazioni. Dinamica di SG possono essere seguite in cellule vive visualizzando la localizzazione di un componente taggato di SG in cellule primarie transfettate dopo stress.

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535.  Granuli di stress (SGS) sono granuli citoplasmatici RNA contenenti particelle in fase di stallo ribonucleoproteiche (RNP), e importante nella risposta cellulare alle varie sollecitazioni. Dinamica di SG possono essere seguite in cellule vive visualizzando la localizzazione di un componente taggato di SG in cellule primarie transfettate dopo stress. 

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Biologia dello sviluppo

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Analisi dell&#39;immunofluorescenza della formazione di granuli di stress dopo la sfida batterica delle cellule dei mammiferi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Immunologia e infezioni

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Bioingegneria

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biologia

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Metodi per classificare i foci citoplasmatici come granuli di stress di mammiferi

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imaging a cellule vive dell'attività trascrizionale a rotture a doppio filamento di DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Rilevamento di focolai di DNA a filamento singolo in fase G1 tramite colorazione immunofluorescente RPA2

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

Autore in primo piano: Visualizzazione del DNA a filamento singolo durante la riparazione del DNA per approfondimenti terapeutici 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

Visualizzazione dei focolai di DNA a singolo filamento nella fase G1 del ciclo cellulare

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

Riepilogo

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