המחברים רוצים להכיר את פלטפורמת מונפלייה ריו ההדמיה (MRI) שבו בוצעו הרכישות. הם מודים איזבל כריסטינה לופז מחייה, אלכסנדרה מץ, אירינה Lassot, סולאנז&#39; Desagher, פביאן Loustalot, וירג&#39;יני Georget לעזרתם בחלקים שונים של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-N ° DEQ20111223745).

כל הליכי בעלי החיים בפרוטוקול זה הם בהקפדה עם ההנחיות של הוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 נובמבר 1986 (86-609/EEC). בית העכברים בקבוצה, המאפשרים כרצונך מודעת מזון ומים. לשמור אותם בסביבה מבוקרת (C ° 22 ± 1, ± 55 לחות 5%) עם שעות 12: שעות אור 12: מחזור כהה (אור על שעת 7:00 בבוקר). 1 תרבות של תאי Murine ראשיים:. Fibroblasts העכבר עוברי (MEFs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מלקחיים דקים, כמו גם מלקחיים מעוקלים ולנתח מספריים. לאחסן במכל סטרילי. השתמש D-PBS סטרילי (פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco). להכין מדיום MEFs מלא: בינוני הנשר שונה Dulbecco (DMEM) / F12 בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FBS), 1 מ&quot;מ L-גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, חומצות אמינו לא חיוני 1%, ו0.5 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol וחם על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בהריון (ב13.5 ימים לאחר coïtum-(DPC)) על ידי נקע בצוואר הרחם. הסר את קרן הרחם מהעכבר מחוטא עם 90% EtOH. מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, הניחו את הקרניים עם העוברים ב37 ° C prewarmed D-PBS. פתח את הקרניים, המקום העוברים בצלחת פלסטיק סטרילי 100 מ&quot;מ פטרי, לנקות אותם מחומר חבל הטבור ולשטוף אותם עם D-PBS החם כדי להסיר את עודפי דם. תחת משקפת, להסיר גפיים של העובר, האיברים הפנימיים ו את החלק העליון של הראש המכיל את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת פטרי חדשה, ברר עוברים לחתיכות קטנות מאוד עם סטרילי כירורגים להב או מספריים (לפחות 1 דקות). במקרה של עוברים של גנוטיפים שונים, להיות זהיר לשים כל עובר בצלחות פטרי פרט ולשמור על הזנב או עליון הראש לגנוטיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את העובר עם 1x טריפסין-EDTA (טריפסין 0.25%, 1 mM EDTA). דגירה במשך 30 דקות עד 1 שעה ב37 מעלות צלזיוס חממה. הוסף 10 מיליליטר של שלםבינוני MEFs לעצור תגובת טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי להסיר את כל אגרגטים. בואו לשבת ההשעיה התא לתוך צינור מיליליטר 50 (מלא בינוני מלא) עבור 10 דקות, ו צנטריפוגות supernatant במשך 5 דקות ב300 XG בטמפרטורת חדר. Resuspend את הכדור במדיום מלא (6 מיליליטר לעובר 1). ניתן לספור תאי בעלי גרעין קיימא באמצעות trypan כחול (ניתן לצפות מעובר אחד בסביבות 5 x 10 6 תאים). צלחת 3 מיליליטר ל60 מ&quot;מ צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום למחרת ו מאפשר לתאים לגדול עד המנות ומחוברות. רבים ניתן לראות סוגי תאים, אבל רק fibroblasts ישרוד תת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את התאים ולאפשר להם לגדול ב35 מנות מ&quot;מ עם תחתית זכוכית (חשובה לניסוי זמן לשגות), עד confluency 50-70% עבור transfection. מבחן לMycoplasma ופתוגנים עכבר. </li></ol> 2. תרבותdaptations במקרה של נוירונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני התרבות, צלחות פטרי זכוכית תחתונה מ&quot;מ מעיל 35 עם פולי-L-ליזין (200 μl של 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר) מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, ולהשאיר למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר שלמחרת, לשטוף עם מים טהורים סטרילי, פעמיים למשך 5 דקות ופעם אחת עבור 45 דקות עד 1 שעה. החלף עם 2 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% בינוניים FBS ולשמור בחממה 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עוברים ב18.5 DPC. מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, הנח את הקרניים עם העוברים בHBSS הקר סטרילי (תמיסת מלח מאוזנת של האנק) ב100 מ&quot;מ צלחת פטרי. יכולים לשמש גם גורי ילודים במקום עוברים על מנת לשמור על חייו של הסכר ותאפשר לה לייצר יותר צאצאים, במיוחד במקרה של בעלי חיים מהונדסים שיכול להיות קשה להשיג. בצלחות פטרי אישיות, לקחת כל עובר או יילוד וחתך את ראשו במספריים. החזק את ראשו על ידי החדרת מלקחיים מעוקלים לתוך העיניים, לחתוך את העור ולפתוח בזהירות את הגולגולת הרכה מהחלק האחורישל הראש עד לעיניים, בכל צד של הראש. חותכים את עצבי ראייה ואת גזע המוח, להסיר את המוח, ושם אותו בצלחת פטרי המכילה HBSS חדשה. תחת stereoscope, להסיר את כל קרומי המוח באמצעות שני מלקחיים דקים. הפרד את hippocampi, קליפה או כל חלק אחר של המוח בהתאם למבנה ללימודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את מבנה המוח גזור ב4.5 מיליליטר של HBSS הקר שהוכן קודם לכן ב15 צינורות מיליליטר ולשמור על קרח עד לעיכול עם טריפסין. הוסף 0.5 מיליליטר של טריפסין 2.5% ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ל20 דקות. יש לשטוף 3x טריפסין עם HBSS, להיות זהיר מאוד שלא להשליך את חלקי המוח מתעכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 500 μl (היפוקמפוס) ל 1 מיליליטר DMEM (קליפת המוח) בתוספת 10% FBS ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים עם micropipette מיליליטר 1 מצויד עם טיפ 1 מיליליטר, ולאחר מכן מצויד עם 1 מיליליטר בתוספת 200 טיפים μl, עד שלא יהיה ללא צבירה גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 100-200 μl של השעיה תא לכל botto זכוכית 35 מ&quot;ממנה מ &#39;המכילה DMEM בתוספת 10% FBS ולתת נוירונים לדבוק ב37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 שעות. החלף על ידי בינוני מלא נוירון prewarmed (הבינוני Neurobasal בתוספת 250 מיקרומטר L-גלוטמין וNS21, שהוכן כפי שמתואר בחן et al. 19) ולהשאיר על 37 ° C כדי לאפשר צמיחה עצבית. Transfect נוירונים ב5-14 ימים במבחנה (DIV) (היעילות של transfection היא גבוהה יותר אחרי כמה קשרים סינפטיים div אבל הם טובים יותר הוקמו 7-10 div). </li></ol> 3. Transfection של Construct EGFP-G3BP1 Transfect התאים עם וקטור המכיל cDNA של חלבון עניין שלך (כל רכיב של SGS) התמזגו סמן פלואורסצנטי (GFP, YFP, וכו &#39;), באמצעות 3 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר ל35 מנה מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect MEFs בשיטה מסחרית, בעקבות הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect נוירונים עם סידןשיטת פוספט הותאמה מ שיה ואח&#39; 20 בקצרה.: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות: DMEM שטיפה: DMEM המכיל 25 מ&quot;מ KCl; פתרון transfection: DMEM שטיפה המכילה 1x DMKY (HEPES 5 מ&quot;מ, MgCl 2 10 מ&quot;מ, פנול אדום); ופתרון הלם: HeBS 1x, DMKY 1x, וDMSO 2% (v / v); ולשמור אותם על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהנוירונים, התסנין, ולשמור אותו על 37 ° C. לשטוף עם DMEM לשטוף לאחר מכן להחליף עם מדיום transfection ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההכנה של משקעים DNA פוספט-פלסמיד סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, להוסיף (לפי סדר זה) מים בראון (μl 50 הנפח סופי), 5 μl של CaCl 2 2.5 M, ו3 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד. ירידה זו תערובת על גבי 50 μl של HeBS 2x כבר הציג בצינור פוליפרופילן תחתית עגול. מערבבים את הצינור על ידי סיבוב יחד עם השחרור. בואו צורת המשקע בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את precipitatדואר dropwise על גבי תאי העצב ולהשאיר על 37 מעלות צלזיוס במהלך 30-50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם פתרון הלם דקות 1, ולאחר מכן לשטוף עם DMEM לשטוף וסופו של דבר להחזיר את מדיום preconditioned. שמור את התאים על 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. ויזואליזציה של G3BP מכילה SGS הרכבה וDynamics <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום של התאים המכיל פנול אדום על ידי אדום בינוני ללא פנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ confocal מצויד בקרינה עבור הרכישות. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. לחמם את החדר ל37 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות לפני תחילת הרכישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי היתר של G3BP גורם להיווצרות הספונטנית של סוג של SGS. התאים עשויים כך שנצפו להרכבה של SGS 24 תקין שעות לאחר transfection ללא אינדוקציה לחץ. לחלופין, לחץ יכול להיגרם כדי לגרום להרכבה של SGS נוסף. הוספת arsenite נתרן 0.5 מ&quot;מ וכוכבt הרכישה מייד לאחר התוספת של המתחם (גרגרים יוקמו גם בתוך שעה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שמן למטרת הטבילה (להשתמש 40X או 63X מטרות) ולהתקין צלחת פטרי על המטרה בבעל מיקרוסקופ 35 מ&quot;מ המותאם, התייצב על בעל הבמה. בדוק שהצלחת שטוחה אחרת הרכישות יהיו שונה. להדליק את אור הקרינה פי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנת וcytotoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;לרכוש&quot;, בחר בלייזרים בהתאם לגל העירור של fluorophore התג (488 ננומטר בפרוטוקול שלנו אשר משתמש G3BP מתויג-EGFP) ובחר את האורך המותאם פליטה לPMT (צינור מכפיל). להתאים את כוח הלייזר (בדרך כלל לא יותר מ -10%) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעיל, ולהגדיר את הרווח לקזז כדי לשנות את יחס האות לרעש.סריקה מהירה (1,000 הרץ) על מנת לצמצם את משך הזמן של אקספוזיציה לייזר (קו ממוצע 2, ממוצע פריים 1). אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z כדי להיות מסוגלים לשחזר את התמונה ב-3D (צעד Z של 1 מיקרומטר הוא בדרך כלל בסדר עם תאים). לקבוע את מרווח הזמן בין כל רכישה: מרווחים קטנים יותר נאפשר להשיג סרט קוהרנטית יותר, אבל זה עשוי לגרום photobleaching ורעילות (מרווח של 20 שניות היה בשימוש בניסויים שתוארו). משך הרכישה כוללת עשוי להשתנות בהתאם לסוג הלחץ. SGS המכיל G3BP רבים נוצרים בקצב מהיר מאוד תחת טיפול arsenite והם גם נראים לעין לאחר 1 שעות של טיפול: במקרה זה, לבחור במהירות תאים לסרט ולהתחיל את הרכישות מייד אחרי המתח, עם משך זמן כולל של רכישות של 15 - 20 דקות במידה רבה מספיק כדי לבחון את ההרכבה של כמה SGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונות ולשחזר את הערימות וסרט באמצעות תוכנת ImageJ. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+granules:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability.">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules.">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li><li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein.">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li><li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein:+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1.">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li><li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+G3BPs:+tissue+specific+expression,+chromosomal+localisation+and+rasGAP(120)+binding+studies.">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li><li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#945;+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress.">PKC&#945; Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp:+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization.">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li><li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+helicase+VIII:+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein,+an+element+of+the+ras+transduction+pathway.">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li><li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha,+entry+to+cytoplasmic+stress+granules,+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs.">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li><li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+(G3BP)+is+a+modulator+of+USP10,+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease.">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li><li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP.">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+G3BP1,+the+stress+granules+assembly+factor,+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons.">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult.">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li><li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly.">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase/ERK-Dependent+Mechanism.">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li><li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2&#945;+phosphorylation.">Large G3BP-induced granules trigger eIF2&#945; phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר בדאגת פרוטוקול transfection ועוד במיוחד רכישות הזמן לשגות, שצריך להיות במעקב צמוד על מנת להפחית את cytotoxicity. תרבות של תאים ראשוניים היא לא חלק קשה, כל עוד תנאים סטריליים נשמרים והזהירות לנקוט על מנת למנוע נזק במהלך ?...

גרגרי מתח (SGS) הם מוקדי cytoplasmic שאינם קרומיים נוצרו כתגובה מגן סלולרית ללחץ סביבתי, כגון טמפרטורה גבוהה, סטרס חמצוני, היפוקסיה, הלם אוסמוטי, קרינת UV, מניעת גלוקוז, או זיהום ויראלי 1. הם יכולים להיגרם על ידי טיפול כימי עם תרכובות כמו arsenite נתרן, אשר מפעיל לחץ חמצוני. SGS לצבור ribonucleoprotein נתקעה תרגום נעצר שליח (mRNPs) קומפלקסים 2, sequestering mRNAs ממכונות translational, וההרכבה שלהם יכולה להיות מופעלת על ידי זירחון של eIF2α (גורם ייזום אוקריוטים 2 α). SGS הם מבנים דינמיים אשר מחליפים רכיבים עם polysomes וגרגרים אחרים כמו P-הגופות. הם מהווים &quot;מרכז מיון&quot; שבו mRNAs מסודרים ומעובד או תרגום, reinitiation, השפלה, או אריזה לmRNPs הלא polysomal היציב 3. ההרכבה של SGS היא ב מהירut זה תהליך הדרגתי עם אגרגטים קטנים רבים ראשוניים שלהתגבש לתוך גרגרים גדולים יותר. השימוש במעכבים כימיים המשבשים או לייצב microtubules מראה כי רשת microtubule נדרשת לדינמיקת SG כוללים תהליכי הרכבה, גיבוש ופירוק. ההרכבה הדינמית של SGS גם מקודמת על ידי צבירה של חלבוני קושרי RNA ספציפיים (RNA-BP) כמו TIA-1 (T-cell פנימי אנטיגן-1) וTIAR (חלבון הקשורים ל-TIA-1), אשר מסוגל dimerize ולקדם polysome פירוק והניתוב של mRNAs ל4 SGS. G3BP (חלבון RasGAP SH3 תחום מחייב) הוא RNA-BP כזה שמתאים לSGS כאשר תאים הדגישו עם arsenite או טמפרטורה גבוהה, וביטוי יתר של G3BP dephosphorylated יכול לגרום להרכבת SGS 5. G3BP הוא RNA-BP אבולוציונית שימור שהיה בתחילה אפיין דרך האינטראקציה שלו עם חלבון הפעלת ראס-GTPase (RasGAP p120 6); אך אינטראקציה זו הייתה לאחרונה וביקרה 7. משפחת G3BP כוללת שני חברים ביונקים, G3BP1 (המכונה G3BP) וG3BP2 8. שני חלבוני colocalize בSGS, כאשר תאים נחשפים למתח 9. G3BPs מהווה תחום NTF2 N-מסוף הציע להשפיע על הלוקליזציה שלהם וoligomerization, ואחריו פרולין עשיר מוטיבים (PxxP), ולאחר מכן מוטיבים בטרמינל C-קשורים RNA מחייב: RNA-ההכרה המוטיב הקנונית (RRM) עם מוטיבים RNP1 וRNP2 שימור , ואחריו תיבת ארגינין-גליצין עשיר (RGG). מעניין לציין, כי הניתוח של חלקים שונים של החלבון על ידי בניית תחומים שונים התמזגו EGFP הראה כי תחום כמו NTF2 ותחום המחייב-RNA היו מגויס באופן יעיל ביותר לSGS, המצביע על חשיבותם של המאפיינים של dimerization ו-RNA מחייב ב ההרכבה של SGS. מודלים מגוונים חשפו פונקציות שונות של חלבוני G3BP במבחנה 10-13.שיבוש של G3BP בעכברים הראו את החשיבות של חלבון זה בגידול התפתחותית והישרדות 14, כמו גם תפקיד חשוב לG3BP במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתאפיינת באטקסיה וליקויים בזיכרון עבודה המרחבי 15. מחסור G3BP מוביל להומאוסטזיס פלסטיות עצבי וסידן שהשתנה, הקמת קשר ישיר בין היווצרות SG ומחלות ניווניות 15. זה כן חשוב להיות מסוגל ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים ראשוניים כמו תאי עצב. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לבחון את ההרכבה של SGS המכיל G3BP1 בתאים ראשוניים תחת טיפול arsenite. זה יכול לשמש כדי לחקור הרכבה SGS בתנאים שונים, לדוגמא סוגים שונים של לחצים. זה גם יכול להיות מותאם לגרגירים או מרכיבים אחרים אחרים של SGS. ואכן, בפרוטוקול זה מתמקד בG3BP1, אבל יש סמני גרגרי מתח אחרים כמו TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (פיגור שחלבון ה-X שביר תסמונת נפשית) 16, (חלבון קושר DNA תגובת transactive 43) TDP-43 17 או Staufen 18. בפרט, חלבונים כמו TIA-1 / R הם, כמו G3BP, nucleating חלבוני RNA מחייבים שיכול לגרום להרכבת SGS כאשר ביטוי יתר, גם אם SGS נוצר השונים יכול להיות שונה בתפקוד, ויסות ותמלילים כרוכים בכך. Transfection של גרסה מתויג fluorophore של כל אחד מהמרכיבים המרכזיים אלה או nucleators של SGS יכול להתבצע להרכבת תמונה מסוימת SGS ודינמיקה.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)</td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Very thin, tips 0.1 mm</td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Can be useful to remove hippocampi</td></tr><tr><td>Polyplus transfection JetPEI reagent&amp;nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

ניתן דמיינו SGS בתאים על ידי immunostaining של מרכיבי חלבון מסוימים או הפולה + mRNAs. SGS הם מאוד דינמי והמחקר של ההרכבה וגורלם חשוב להבין התגובה התאית ללחץ. המחסור בגורמים מרכזיים של SGS כמו G3BP (חלבון קושר תחום RasGAP SH3) מוביל לפגמים התפתחותיים בעכברים ובשינויים של מערכת העצבים המרכזית. כדי ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים מאורגניזם, תאים ראשוניים ניתן תרבות ובצע את הלוקליזציה של transfected רכיב מתויג של SGS. אנו מתארים ניסוי הזמן לשגות להתבונן SGS המכיל G3BP1 בfibroblasts העכבר עוברי (MEFs). גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור SGS המכיל G3BP בנוירונים בשידור חי, שהוא חיוני כפי שהוצג לאחרונה כי SGS אלה נוצרים בהתפרצות של מחלות ניווניות כמו אלצהיימר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל מרכיב גוף סלולארי וחלבון גרגר אחר, ובביצועעם בעלי חיים מהונדסים, המאפשר הלימוד החי של דינמיקת גרגרים למשל בהעדר גורם ספציפי של גרגרים אלה.

היווצרות גרגר מתח היא חשובה בתגובה של תאים ללחץ, ומאפשרת הסתגלות סלולרית עם תרגום נתקע, עד שהלחץ יש לו פינה, הקשורים למניעת מות תאים מתוכנת. היתרי assay זה ללמוד את SGS בתאים ראשוניים, על ידי ביצוע הלוקליזציה של מרכיבי חלבון SGS המרכזיים (איור 1). G3BP, גורם מפתח של ההר?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells at JoVE.com

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

גרגרי מתח (SGS) הם גרגרי cytoplasmic RNA המכילים חלקיקים נתקע ribonucleoprotein (RNPs), וחשובים בתגובה תאית ללחצים שונים. דינמיקה של SGS יכולה להיות מיושמת בתאי חיים על ידי הדמיה הלוקליזציה של רכיב מתויג של SGS בתאים ראשוניים transfected אחרי המתח.

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535.  גרגרי מתח (SGS) הם גרגרי cytoplasmic RNA המכילים חלקיקים נתקע ribonucleoprotein (RNPs), וחשובים בתגובה תאית ללחצים שונים. דינמיקה של SGS יכולה להיות מיושמת בתאי חיים על ידי הדמיה הלוקליזציה של רכיב מתויג של SGS בתאים ראשוניים transfected אחרי המתח. 

Video: Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Cancer Research

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Developmental Biology

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Immunology and Infection

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Bioengineering

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

שיטות לסיווג מוקדים Cytoplasmic כמו גרגרי מתח יונקים

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

זיהוי מוקדי DNA חד-גדילי בשלב G1 באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

מחבר זרקור: הדמיה של DNA חד-גדילי במהלך תיקון DNA לתובנות טיפוליות 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...