저자는 인수가 수행 된 몽펠리에 리오 영상 (MRI) 플랫폼을 인정하고 싶습니다. 그들은 프로토콜의 다른 부분에서의 도움을 이사벨 로페즈 크리스티나 메 지아, 알렉산드라 메츠, 이리나 Lassot, SOLANGE Desagher, 파비앙 Loust​​alot 및 버지니 Georget 감사합니다. 이 작품은 라 공들인 Médicale (FRM) (퀴프 FRM 2011-N ° DEQ20111223745는) 매그가 부어 지원되었다.

이 프로토콜의 모든 동물의 절차 11 월 24 일 1986 (86-609/EEC)의 유럽 공동체위원회 지침의 가이드 라인을 엄격하게 준수하고 있습니다. 물과식이 허용 그룹의 집은 마우스,. 12 시간 빛 : 어두운주기 (오전 7:00에 빛) 12 시간과 통제 된 환경 (22 ± 1 °의 C, 55 ± 5 %의 습도)에서 그들을 유지합니다. 1 쥐과 차 전지의 문화 :. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs) <ol><li> 얇은 집게뿐만 아니라 곡선 포셉 및 해부 가위를 압력솥. 멸균 용기에 보관합니다. 멸균 D-PBS (둘 베코 인산염 완충 식염수)를 사용합니다. 완전한 MEFs 매체를 준비 : 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM의 피루브산 나트륨, 1 % 비 필수 아미노산, 및 0.5 mM의 2 - 머 캅토 에탄올이 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) / F12 37 ° C에서 따뜻한 </li><li> 13.5 일 후 교미 (DPC에서 임신 한 마우스 (안락사)) 자궁 전위에 의해. 90 % EtOH로 소독 한 마우스에서 자궁 뿔을 제거합니다. 살균하고 깨끗한 후드에서 37 ° C에서 배아와 뿔을 배치는 D-PBS를 데워진. 뿔, 장소를 엽니 다 100mm 멸균 플라스틱 페트리 접시에있는 태아는 탯줄 자료에서 그들을 청소하고 혈액의 과잉을 제거하는 따뜻한 D-PBS로 세척. 양안에서 태아의 사지, 내장을 제거하고 뇌를 포함하는 헤드의 상부. </li><li> 새로운 배양 접시에서 말하다 무균 수술에 아주 작은 조각으로 배아 잎 가위 (최소 1 분). 다른 유전자형의 배아의 경우, 각각의 페트리 접시에 각각의 배아를 넣어 유전자형의 꼬리 또는 위쪽 머리를 유지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 1X 트립신-EDTA (0.25 % 트립신, 1 ㎜ EDTA)와 배아를 커버. 30 분 37 ° C의 배양기에서 1 시간 동안 품어. 전체의 10 ML을 추가트립신 반응을 정지 MEFs 매체. 피펫은 위아래 모두 집계를 제거합니다. 10 분 (완전 배지로 가득) 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 앉아 보자, 상온에서 300 XG에서 5 분 동안 뜨는을 원심 분리기. 완전 배지 (1 배아 6 ml)에 펠렛을 Resuspend. 가능한 유핵 세포는 트리 판을 사용하여 계산 될 수있다 푸른 (약 5 × 106 세포는 한 배아로부터 예상 될 수있다.) 60mm 페트리 접시 당 플레이트 3 ㎖. </li><li> 다음날 매체를 변경하고 세포가 성장하도록 허용 요리는 컨 플루 언트 될 때까지. 많은 세포 유형은 알 수있다, 하지만 섬유 아 세포는 계대 배양을 살아남을 것입니다. </li><li> 세포를 분리하고이 형질에 대한 50~70% 자랄 때까지, 유리 바닥 (시간 경과 실험에 대한 중요한)와 35mm 요리에서 성장 할 수 있습니다. 마이코 플라즈마와 마우스 병원균에 대한 검사. </li></ol> 2. 문화뉴런의 경우 daptations <ol><li> 문화 전날, 폴리-L-라이신 살균 청소 후드 (0.1 ㎎ / ㎖의 200 μL)과 함께 코트 35mm 유리 바닥 배양 접시 하룻밤 둡니다. </li><li> 다음날 아침에 두 번 45 분에서 1 시간에 한번씩 5 분, 대한​​ 멸균 순수한 물로 씻어. 2 DMEM의 ML 플러스 10 % FBS 배지로 교체하고 37 ° C 배양기에서 유지. </li><li> 18.5 DPC에서 배아를 해부하다. 살균하고 깨끗한 후드, 100mm 페트리 접시에 차가운 무균 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션)에 배아와 뿔을 배치합니다. 신생아 새끼 또한 댐의 수명을 유지하고, 특히 얻기 어려울 수 형질 전환 동물의 경우에, 더 많은 자손을 생성 할 수있게하기 위해 배아 대신 사용될 수있다. 각각의 배양 접시에서 각 태아 또는 신생아을하고 가위로 머리를 잘라. 눈에 곡선 집게를 삽입하여 머리를 잡아 피부를 잘라 조심스럽게 뒷면에서 부드러운 두개골을 열헤드의 눈​​까지, 헤드의 각 측면에. 시신경과 뇌 줄기를 잘라, 뇌를 제거하고 HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 넣어. 입체경에서 두 개의 얇은 집게를 사용하여 모든 수막을 제거합니다. 해마, 대뇌 피질 또는 연구하는 구조에 따라 두뇌의 다른 부분을 분리합니다. </li><li> 차가운 HBSS 4.5 ㎖에 해부 뇌 구조를 담가 15 ML 튜브에 미리 준비하고 트립신 소화 될 때까지 얼음 계속. 2.5 % 트립신 0.5 mL를 넣고 20 분까지 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 소화 뇌 부분을 폐기 할 수 없음을 매우주의하고, HBSS와 트립신의 3 배를 씻어. </li><li> 이 때까지 1 ㎖ 팁을 탑재 한 1 ㎖ 마이크로 피펫 1 ㎖ (피질) DMEM 플러스 10 % FBS 최대 피펫 아래로 여러 번에 500 μL (해마)에 재현 탁, 그 후에, 1 ㎖ 플러스 200 μL 팁 장착 눈에 띄는 집계하지 않습니다. </li><li> 각 35mm 유리 BOTTO에 세포 현탁액 100 ~ 200 μl를 배포DMEM 플러스 10 % FBS를 포함하고 신경이 적어도 3 시간 동안 37 ° C에서 밀착시켜 m 접시. 데워진 신경 완전 배지로 교체 (Neurobasal 매체, 250 μM의 L-글루타민과 NS21 보충 첸 등. 19에 기술 된 바와 같이 제조) 및 신경 세포의 성장을 할 수 있도록 37 ° C에 둡니다. (DIV) (형질 전환 효율이 DIV하지만 시냅스 연결의 몇 가지 더 나은 7-10 사업부에서 설립 된 후에 높은) 체외에서 5~14일에서 신경 세포를 형질. </li></ol> EGFP-G3BP1 구문의 3. 형질 35mm 접시 당 정제 된 플라스미드의 3 μg을 사용하여, 형광 마커 (등 GFP, YFP) 융합 관심의 단백질의 cDNA를 (SG를의 구성 요소)를 포함하는 벡터로 세포를 형질. <ol><li> 제조자의 프로토콜 (자재 / 시약의 표 참조) 다음, 시판의 방법을 사용 MEFs를 형질. </li><li> 칼슘과 함께 신경 세포를 형질. 시아 등 20 간단히에서 적응 인산 방법 : <ol><li> 솔루션을 준비 : DMEM 세척 : 25 밀리미터의 KCl을 포함하는 DMEM; 형질 솔루션 : 1X DMKY (HEPES 5 mm의 MgCl2를 10 mM의 페놀 레드)를 포함하는 DMEM 세척; 충격 솔루션 : HEBS 1X, 1X DMKY 및 DMSO 2 % (V / V) 37 ℃에서 보관하십시오 </li><li> 뉴런, 여과 액에서 용지를 제거하고, 37 ℃에서 보관 DMEM 세척으로 세척 한 후 형질 배지로 교체하고 인산 칼슘 플라스미드 DNA 침전물의 준비 기간 동안 37 ° C로 유지한다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서, (이 순서대로) 브라운 물 (최종 부피 50 μL), 염화칼슘 2.5 M의 5 μL, 플라스미드 DNA의 3 μg을 추가합니다. 이미 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 도입 HEBS 2 배의 50 μL에이 조합을 삭제합니다. 낙하와 함께 회전에 의해 튜브를 섞는다. 30 분 동안 실온에서 침전물 형태하자. </li><li> precipitat 추가전자 뉴런에 적가하고 30 ~ 50 분 동안 37 ° C에서 둡니다. </li><li> 1 분 동안 충격 솔루션으로 교체 한 후 DMEM 세척과 헹굼 마지막으로 미리 조정 매체를 재 도입. 37 ° C에서 세포를 유지 </li></ol></li></ol> SG를 조립 및 역학을 포함하는 G3BP 4. 시각화 <ol><li> 페놀 레드없는 매체에 의해 페놀 레드를 포함하는 세포의 매체를 교체합니다. </li><li> 인수에 대한 형광을 갖춘 공 ​​초점 현미경을 사용합니다. 현미경 시스템을 켜십시오 : 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저. 20 분 이상 인수를 시작하기 전에 37 ° C에 실을 따뜻하게. </li><li> G3BP의 이상 발현은 SG를 유형의 자연 형성을 유도한다. 세포는 따라서 스트레스 유도없이 형질 전환 후 SG를 24 시간 오른쪽의 조립 관찰 할 수있다. 대안 적으로, 응력은 상기 SG를 조립을 유도하도록 유도 될 수있다. 0.5 ㎜의 아비산 나트륨과 별 추가오른쪽 화합물 (과립 확실히 1 시간 내에 형성 될 것이다)의 첨가 후 획득 t. </li><li> 침지 목적에 기름을 추가 (40X 또는 63X 목표를 사용) 및 적응 35mm 현미경 홀더의 목적에 페트리 접시를 설치, 무대 홀더에 안정. 요리의 인수가 변경 될 것입니다 그렇지 않으면 평평한 지 확인합니다. 관련 형광 물질에 따라 형광 빛을 켜고 형질 전환 세포를 시각화. 그 세포는 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 필드에 한 번 형광을 끕니다. </li><li> &quot;취득 탭&quot;에서 태그 형광 (EGFP-태그 G3BP를 사용하여 우리의 프로토콜에있는 488 나노 미터)의 여기 파장에 따라 레이저를 선택하고 PMT에 대한 적응 방출 길이 (광전자 증 배관)을 선택합니다. 잡음 및 과포화뿐만 아니라 독성을 최소화하기 위해 레이저 파워 (통상 10 % 이상)을 조정하고, 이득을 설정하고 신호 대 잡음비를 수정 오프셋.레이저 박람회 기간 (라인 평균 2, 프레임 평균 1)을 최소화하기 위해 (1,000 Hz에서) 빠른 스캔합니다. 원하는 경우, Z 스택에 대한 매개 변수가 3D에서 이미지를 (1 ㎛의 Z 단계는 세포와 일반적으로 괜찮습니다) 재구성 할 수 있도록 설정. 각 인수 사이의 시간 간격을 결정 : 작은 간격은보다 일관된 영화를 얻을 수 있도록하지만이 광표백 및 독성 (20 초 간격이 기술 실험에 사용 된)를 유도 할 수 있습니다. 총 취득 기간은 스트레스의 유형에 따라 다를 수 있습니다. 많은 G3BP 함유 SG를이 아비 산염 처리에서 매우 빠르게 형성과 치료의 1 시간 후 잘 볼 수 있습니다됩니다 :이 경우에, 15의 인수의 총 지속 시간, 바로 스트레스 후 인수 필름 및 시작 빠르게 셀을 선택합니다 - 20 분 여러 SG를 조립을 준수 크게 충분. </li><li> 사진을 저장하고 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 스택과 영화를 재구성. </li></ol>

<ol>
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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

프로토콜 우려 형질 조심스럽게 세포 독성을 낮추기 위해 모니터링 할 필요가 더 많은, 특히 시간 경과 인수에서 가장 중요한 단계. 일차 세포의 배양 한 멸균 조건이 유지되고,주의가 절개 및 세포 분리 단계 동안의 손상을 방지하기 위해 수행되는 한, 어려운 부분이 아니다. MEFs 초기 구절에서 냉동 보관하실 수 있습니다. 칼슘과 함께 신경 세포의 형질이 잘 21 일을 ...

스트레스 과립 (SGS는) 같은 높은 온도, 산화 스트레스, 저산소증, 삼투압 충격, 자외선 조사, 포도당 박탈, 또는 바이러스 감염 1과 같은 환경 스트레스에 대한 세포 보호 반응으로 형성된 비 막 세포질 초점입니다. 이들은 산화 스트레스를 유발 나트륨 아비 산염과 같은 화합물로 처리함으로써 화학적으로 유도 될 수있다. SG를 실속 번역 체포 메신저 리보 (mRNPs)를 축적하면 번역 기계에서의 mRNA를 금속 이온 봉쇄, 2 단지, 자신의 어셈블리 eIF2α의 인산화 (진핵 개시 인자 2 α)에 의해 트리거 될 수 있습니다. SGS는 P-시체 같은 polysom​​es 및 다른 과립과 구성 요소를 교환 동적 구조입니다. 그들은의 mRNA가 정렬하고 안정적인 비 polysomal의 mRNPs 3로 번역, 재개시, 저하 또는 포장 중 하나에 대해 처리하는 &quot;우선 순위 구분 센터&quot;를 구성. SG를 조립 빠른 B입니다유타는 큰 과립으로 뭉쳤다 초기 다수의 작은 골재와 점진적 과정이다. 미세 소관을 중단 시키거나 안정화 화학적 억제제의 사용은 미세 소관 네트워크가 조립 합체 및 분해 공정 등 SG 역학 필요하다는 것을 보여준다. SG를의 동적 어셈블리는 TIA-1 (T-세포 내부 항원-1)과 같은 특정 RNA 결합 단백질 (RNA-BP)의 집계에 의해 추진됩니다 TIAR 이량 할 수 있습니다 (TIA-1 관련 단백질), SGS 및 4에 polysome 분해의 mRNA의 경로를 촉진합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)의 세포가 아비 산염 또는 고온 강조하고, 탈 인산화 G3BP의 과발현이 SG를 어셈블리 (5)를 유도 할 수있을 때 SG를에 지역화와 같은 RNA-BP입니다. G3BP는 처음 RasGAP P (라스 - GTPase의 활성화 단백질과의 상호 작용을 특징으로 한 진화 적으로 보존 된 RNA-BP입니다(120) 6); 그러나 이러한 상호 작용은 최근 7을 재 방문했다. G3BP 제품군은 두 개의 포유류의 회원, G3BP1 (G3BP이라 함)과 G3BP2 8이 포함되어 있습니다. 세포가 스트레스를 9을 실시 할 때 두 단백질은, SGS에 colocalize. 정식 RNA 인식 모티프 (RRM)를 보존 RNP1 및 RNP2 모티브 : G3BPs는 N-말단 NTF2 도메인 프롤린 리치 (PxxP) 모티프 다음에 자신​​의 현지화 및 올리고머를, 영향을 제안 구성, 다음 C-말단 모티브는 RNA 바인딩과 관련된 , 아르기닌 - 글리신 리치 (RGG) 상자 하였다. 흥미롭게도, EGFP 융합 다른 도메인을 구성하여 단백질의 상이한 부분을 분석 한 NTF2 같은 도메인 및 RNA-결합 도메인이 가장 효율적 이량의 특성의 중요성을 제안하는, SGS 모집 및 RNA는 바인딩 것으로 나타났다 SG를 조립. 다양한 모델은 체외 10-13에서 G3BP 단백질의 다른 기능을 공개했다.생쥐 G3BP가 중단 발달 성장과 생존 14,뿐만 아니라 공간 작업 기억 (15)에 운동 장애와 결함을 특징으로 중추 신경계 (CNS)에 G3BP의 중요한 역할이 단백질의 중요성을 보여 주었다. G3BP 결핍은 SG 형성 및 신경 퇴행성 질환 (15) 사이의 직접 링크를 설정, 변경된 신경 가소성과 칼슘 항상성에 이르게한다. 이 신경 세포와 같은 일차 전지에있는 SG를의 역학을 연구 할 수있는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 아비 산염 처리에서 일차 전지에 G3BP1 함유 SG를 조립을 관찰 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 그것은 스트레스의 예를 다른 종류의 서로 다른 조건에서 SG를 조립을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 SG를 다른 과립 또는 다른 성분으로 구성 될 수있다. 사실,이 프로토콜은 G3BP1에 초점을 맞추고 있지만, TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2와 같은 다른 스트레스 과립 마커가있다FMRP (허약 한 X 정신 지체 증후군 단백질) 16, TDP-43 (transactive 응답 DNA 결합 단백질 43) (17) 또는 슈타우펜 18. 특히, TIA-1 / R과 같은 단백질이 과발현되면 다른 SG를 형성 기능, 규제와 관련된 성적에 차이가있다하더라도, SGS 어셈블리를 유도 할 수 RNA 결합 단백질을 핵, G3BP 같은입니다. SG를 이러한 핵심 구성 요소의 일부 또는 nucleators의 형광 - 태그 버전의 형질 이미지 특정 SG를 조립 및 역학을 수행 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)</td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Very thin, tips 0.1 mm</td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Can be useful to remove hippocampi</td></tr><tr><td>Polyplus transfection JetPEI reagent&amp;nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

SGS는 특정 단백질의 구성 요소 또는 폴리 A +의 mRNA의 면역 염색에 의해 세포를 시각화 할 수 있습니다. SGS는 매우 동적이며 자신의 조립과 운명의 연구는 스트레스에 대한 세포 반응을 이해하는 것이 중요합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)과 같은 SG를 주요 요인의 결핍 생쥐와 중추 신경계의 변화에​​ 발달 결함이 발생합니다. 유기체, 1 캔 문화의 기본 세포에서 세포의 SG를의 역학을 연구하고 SG를의 형질 태그 구성 요소의 지역화를 수행합니다. 우리는 마우스 배아 섬유 아 세포의 G3BP1 함유 SG를 (MEFs)을 관찰하기 위해 시간 경과 실험을 설명합니다. 이 기술은 또한 최근 이러한 SG를가 알츠하이머 병 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 형성되어 도시되었을 결정적이다 라이브 뉴런 G3BP 함유 SG를 연구하는 데 이용 될 수있다. 이 방법은 임의의 다른 셀룰러 바디 및 과립 단백질 성분에 적응하고, 수행 될 수있다형질 전환 동물,이 과립의 특정 인자의 부재하에, 예를 들면 과립 역학 라이브 연구를 허용한다.

스트레스 과립 형성 스트레스 아폽토시스 방지 연결된 클리어 할 때까지, 스톨 번역문 셀룰러 적응을 허용, 스트레스에 셀의 반응에서 중요하다. 이 분석은 허가 키의 SGS 단백질 구성 요소의 현지화 (그림 1)에 따라, 일차 전지에있는 SG를 공부합니다. G3BP, SGS 어셈블리의 핵심 요소는, 배양 MEFs 또는 뉴런 (그림 2A의 A와 C)의 세포질에 오히려으로 확산 존재하고, 명확하게 MEF...

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Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K 조회수.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535.  스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다. 

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

연구

암 연구학

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

발생학

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

면역학 및 감염병학

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

생체공학

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

생물학

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em&gt; D. discoideum</em&gt; 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

RPA2 면역형광 염색을 통한 G1 상 단일 가닥 DNA 병소 검출

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

저자 스포트라이트: Visualizing Single-Stranded DNA During DNA repair for Therapeutic Insights (치료적 통찰력을 위한 DNA 복구 중 단일 가닥 DNA 시각화) 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...