Laringoscopia murina minimamente invasiva per l'imaging ravvicinato del movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione

Questo protocollo descrive un approccio di laringoscopia transorale seriale per topi e ratti che consente l'imaging video ravvicinato e senza ostacoli della laringe durante la respirazione e la deglutizione utilizzando un regime anestetico ottimizzato e tecniche di manipolazione endoscopica finemente sintonizzate.

La laringe è un organo essenziale nei mammiferi con tre funzioni primarie: respirazione, deglutizione e vocalizzazione. È noto che un'ampia gamma di disturbi compromette la funzione laringea, con conseguente difficoltà respiratoria (dispnea), compromissione della deglutizione (disfagia) e/o compromissione della voce (disfonia). La disfagia, in particolare, può portare a polmonite da aspirazione e morbilità associata, ospedalizzazione ricorrente e mortalità precoce. Nonostante queste gravi conseguenze, i trattamenti esistenti per la disfunzione laringea sono in gran parte finalizzati a interventi chirurgici e comportamentali che purtroppo in genere non ripristinano la normale funzione laringea, evidenziando così l'urgente necessità di soluzioni innovative.

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un approccio endoscopico sperimentale per studiare la disfunzione laringea in modelli murini (cioè di topo e ratto). Tuttavia, l'endoscopia nei roditori è piuttosto impegnativa a causa delle loro dimensioni ridotte rispetto all'attuale tecnologia degli endoscopi, delle differenze anatomiche nelle vie aeree superiori e della necessità dell'anestesia di accedere in modo ottimale alla laringe. Qui, descriviamo un nuovo approccio alla laringoscopia transorale che consente l'imaging video ravvicinato e senza ostacoli del movimento laringeo in topi e ratti. Le fasi critiche del protocollo includono una gestione precisa dell'anestesia (per prevenire il sovradosaggio che abolisce la deglutizione e/o rischia la mortalità correlata al distress respiratorio) e il controllo con micromanipolatore dell'endoscopio (per la registrazione video stabile del movimento laringeo da parte di un singolo ricercatore per la successiva quantificazione).

È importante sottolineare che il protocollo può essere eseguito nel tempo negli stessi animali per studiare l'impatto di varie condizioni patologiche in particolare sulla funzione laringea. Un nuovo vantaggio di questo protocollo è la capacità di visualizzare la protezione delle vie aeree durante la deglutizione, che non è possibile nell'uomo a causa dell'inversione epiglottotica sopra l'ingresso laringeo che ostruisce la glottide alla vista. I roditori offrono quindi un'opportunità unica per studiare in modo specifico i meccanismi di protezione delle vie aeree laringee normali rispetto a quelle patologiche allo scopo ultimo di scoprire trattamenti per ripristinare efficacemente la normale funzione laringea.

La laringe è un organo cartilagineo situato all'intersezione delle vie respiratorie e digestive della gola, dove funziona come un meccanismo valvolare per controllare con precisione il flusso e la direzione dell'aria (cioè durante la respirazione e la vocalizzazione) rispetto al cibo e al liquido (cioè durante la deglutizione). È noto che una vasta gamma di disturbi colpisce la laringe, tra cui congeniti (ad esempio, laringomalacia, stenosi sottoglottica), neoplastici (ad esempio, papillomatosi laringea, carcinoma a cellule squamose), neurologici (ad esempio, paralisi laringea idiopatica, ictus, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica) e iatrogeni (ad esempio, lesioni involontarie durante un intervento chirurgico alla testa o al collo). Indipendentemente dall'eziologia, la disfunzione laringea si traduce tipicamente in una triade di sintomi di dispnea (difficoltà respiratoria), disfonia (compromissione della voce) e disfagia (compromissione della deglutizione) che hanno un impatto negativo sul benessere economico e sociale di una persona 1,2,3,4.

Inoltre, la disfagia, in particolare in individui fragili dal punto di vista medico, può portare a polmonite da aspirazione (dovuta alla fuoriuscita di cibo o liquidi attraverso una laringe non completamente chiusa nei polmoni) e morbilità associata, ospedalizzazione ricorrente e mortalità precoce ^5,6. Nonostante queste gravi conseguenze, i trattamenti esistenti per la disfunzione laringea sono in gran parte mirati a interventi chirurgici e comportamentali che in genere non ripristinano la normale funzione laringea 1,2,7,8,9,10, evidenziando così l'urgente necessità di soluzioni innovative. A questo scopo, abbiamo sviluppato un approccio endoscopico sperimentale per studiare la disfunzione laringea in modelli murini (cioè murini e ratti).

In medicina umana, il gold standard per la valutazione della disfunzione laringea è la visualizzazione endoscopica, nota come laringoscopia^11,12. Tipicamente, un endoscopio flessibile viene fatto passare attraverso il naso per esaminare la laringe, in particolare le corde vocali e le strutture laringee sopraglottiche e sottoglottiche adiacenti. Un endoscopio rigido può anche essere utilizzato per visualizzare la laringe attraverso la cavità orale. Entrambi gli approcci consentono l'esame macroscopico dell'anatomia laringea e possono essere utilizzati per valutare la mobilità e la funzione laringea durante la respirazione, la fonazione e una varietà di riflessi protettivi delle vie aeree come la tosse e il riflesso adduttore laringeo 13,14,15,16. Durante la deglutizione, tuttavia, la laringe è completamente oscurata dall'epiglottide poiché si inverte per coprire l'ingresso laringeo, proteggendolo dal percorso del bolo di cibo/liquido che viene inghiottito. Di conseguenza, la visualizzazione diretta del movimento laringeo durante la deglutizione non è possibile nell'uomo e deve quindi essere indirettamente dedotta utilizzando altri approcci diagnostici (ad esempio, fluoroscopia, elettromiografia, elettroglottografia).

Questo articolo descrive un innovativo protocollo di laringoscopia per topi e ratti che consente l'imaging ravvicinato e senza ostacoli della respirazione e la protezione delle vie aeree durante la deglutizione in anestesia leggera. Il protocollo è compatibile con una varietà di sistemi endoscopici disponibili in commercio in combinazione con una piattaforma personalizzata per immobilizzare il roditore anestetizzato durante tutta la procedura. È importante sottolineare che sono effettivamente possibili numerosi progetti/configurazioni di piattaforme endoscopiche, a seconda delle risorse disponibili e dell'agenda di ricerca di ciascun laboratorio. Il nostro intento qui è quello di fornire una guida ai ricercatori da considerare nel contesto della loro ricerca. Inoltre, miriamo a dimostrare come questo protocollo di laringoscopia possa portare a una ricchezza di dati oggettivi che possano innescare nuove intuizioni sulla nostra comprensione della disfunzione laringea e della rigenerazione.

L'effetto combinato di tutti i passaggi descritti in questo protocollo di laringoscopia murina si traduce in un esame minimamente invasivo della laringe murina adulta che può essere ripetuto negli stessi animali per rilevare e caratterizzare la disfunzione laringea nel tempo in risposta al danno iatrogeno, alla progressione della malattia e/o all'intervento di trattamento relativo alla protezione delle vie aeree. Da notare che questo protocollo non valuta la funzione laringea correlata alla vocalizzazione.

Il protocollo di laringoscopia murina segue un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e le linee guida del National Institutes of Health (NIH). È stato sviluppato per l'uso con oltre 100 topi adulti C57BL/6J e oltre 50 ratti Sprague Dawley adulti, di sesso approssimativamente uguale e di età compresa tra 6 settimane e 12 mesi per entrambe le specie. È necessario un ulteriore sviluppo del protocollo per l'adattamento ai roditori più giovani/più piccoli. Gli animali sono stati alloggiati in gruppo (fino a quattro topi o due ratti per gabbia, in base al sesso e alla cucciolata). Le condizioni standard del vivarium includevano l'ingabbiamento statico con una rigorosa regolazione della temperatura ambiente (20-26 °C), dell'umidità (30%-70%) e del ciclo di luce standard di 12 ore. Tutti gli animali hanno ricevuto materiale fresco di arricchimento (ad esempio, capanna/tubo, dolcetti dentali, nido) durante i cambi di gabbia settimanali. È stato fornito l'accesso illimitato a cibo e acqua, tranne durante una breve (fino a 4-6 ore) restrizione alimentare prima dell'anestesia, come descritto di seguito. Il personale veterinario e di ricerca monitorava gli animali ogni giorno.

1. Anestesia animale che non abolisce la deglutizione

1. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati (ad es. guanti, maschera) per ridurre al minimo l'esposizione agli allergeni durante il lavoro con i roditori.
2. Limitare il cibo in ogni gabbia per roditori fino a 4-6 ore prima dell'anestesia per ridurre al minimo la ritenzione di cibo nella cavità orale e nella faringe, che può interferire con la visualizzazione endoscopica e/o provocare l'aspirazione del cibo durante la procedura.
   NOTA: La ritenzione di cibo nella cavità orale è un reperto normale nei roditori senza disfagia se non sono stati sottoposti a restrizioni alimentari.
3. Predisporre una "stazione di riscaldamento" per l'induzione/recupero degli animali.
   1. Preriscaldare un termoforo a circolazione d'acqua a 37 °C su una superficie del piano di lavoro.
   2. Selezionare gabbie di induzione/recupero di dimensioni adeguate per la specie da testare. Ad esempio, le gabbie per scatole da scarpe per topi con coperchi superiori filtranti sono di dimensioni adeguate per l'induzione/recupero di topi e ratti. Utilizzare una gabbia di induzione/recupero fresca per ogni animale sottoposto a test; Utilizzare una singola gabbia sia come gabbia di induzione che di recupero per lo stesso animale.
   3. Rivestire il pavimento della gabbia di induzione/recupero con un leggero strato di materiale assorbente (ad es. trucioli di pioppo tremulo, tovagliolo di carta, tappetino per cuccioli) per il calore e l'assorbimento delle secrezioni corporee durante l'induzione e il recupero dell'anestesia.
   4. Posizionare le gabbie preparate (con i coperchi superiori del filtro) completamente sul termoforo per 30-60 minuti prima dell'induzione dell'anestesia.
      NOTA: Questo microambiente fornisce calore supplementare sufficiente per promuovere un metabolismo stabile dell'anestesia durante l'induzione e il recupero.
4. Posizionare la gabbia di casa dell'animale a metà sul termoforo preriscaldato a 37 °C per circa 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia.
   NOTA: Fornire calore supplementare prima della procedura può accelerare l'induzione dell'anestesia e prevenire il sovradosaggio accidentale dovuto al metabolismo dell'anestesia rallentato/ritardato dall'ipotermia.
5. Preparare l'anestesia ketamina-xilazina (KX) in base alla specie e al peso corporeo.
   1. Per i topi: una miscela di 90 mg/kg di ketamina e 11 mg/kg di xilazina è sufficiente per la laringoscopia transorale in topi adulti di fondo C57BL/6 di entrambi i sessi. Regolare le dosi per altri ceppi di topi ed età.
   2. Per i ratti: una miscela di 60 mg/kg di ketamina e 6 mg/kg di xilazina è sufficiente per la laringoscopia transorale nei ratti Sprague Dawley adulti di entrambi i sessi. Regolare le dosi per altri ceppi di ratti ed età.
6. Preriscaldare gli agenti anestetici riempiti con siringa sulla stazione di riscaldamento a 37 °C per evitare la perdita di calore negli animali che si verifica durante l'iniezione di liquidi freddi.
7. Iniettare nel roditore la dose KX calcolata utilizzando una siringa di dimensioni adeguate (ad es. 1 ml) e un ago (ad es. 26 G1/2).
   1. Per i topi: somministrare una singola iniezione sottocutanea (SC).
      NOTA: Nella nostra esperienza, le iniezioni SC nei topi riducono/aboliscono la mortalità correlata all'anestesia rispetto alle iniezioni intraperitoneali (IP).
   2. Per i ratti: somministrare una singola iniezione SC o IP. Se si preferisce, sedare i ratti con isoflurano (ISO) (3-5%) in una camera di induzione immediatamente prima dell'iniezione di KX.
      NOTA: Il movimento spontaneo del corpo può riprendere per un breve periodo (in genere <1 minuto) fino a quando il KX non ha effetto.
8. Somministrare glicopirrolato (agente anticolinergico) immediatamente dopo l'iniezione di KX per ridurre le secrezioni salivari in eccesso che possono ostacolare la visualizzazione della laringe durante l'endoscopia transorale e/o ostruire meccanicamente le vie aeree superiori durante il recupero in anestesia.
   NOTA: Il dosaggio e il percorso di somministrazione sono identici per topi e ratti (0,01-0,02 mg/kg SC) e l'effetto è quasi immediato e dura diverse ore.
9. Dopo l'iniezione di glicopirrolato, posizionare il roditore anestetizzato nella gabbia di induzione preriscaldata sulla stazione di riscaldamento e coprire la gabbia con un telo chirurgico per fornire un ambiente buio che riduca al minimo la stimolazione visiva per 10 minuti, indisturbato.
   1. Terminare la procedura se il roditore rimane deambulante 10 minuti dopo la dose iniziale di KX.
      NOTA: I tentativi di fornire un'anestesia aggiuntiva (KX o mantenimento con ketamina) saranno probabilmente inutili.
10. Dopo 10 minuti, somministrare una dose di mantenimento di ketamina (1/4 della dose iniziale se i riflessi degli arti posteriori sono diminuiti o 1/2 della dose iniziale se i riflessi degli arti posteriori sono vivaci; SC per i topi e SC/IP per i ratti) per mantenere l'anestesia.
11. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale e i traumi associati durante la procedura di laringoscopia.
12. Trasferire il roditore anestetizzato su una piattaforma endoscopica personalizzata per iniziare la procedura di laringoscopia.
    NOTA: Abbiamo progettato la nostra piattaforma endoscopica (Figura 1) in modo che disponga di molteplici funzionalità per l'uso con una varietà di approcci chirurgici ed elettrofisiologici per roditori che non richiedono necessariamente l'endoscopia. In quanto tale, è sovradimensionato per un uso puramente endoscopico. Ove pertinente, evidenzieremo le caratteristiche/componenti essenziali per questo protocollo laringoscopia.
13. Da questo punto in poi, controllare i riflessi degli arti posteriori ogni 15-20 minuti durante l'intera procedura e fornire dosi di mantenimento aggiuntive di ketamina secondo necessità, distanziate di almeno 20 minuti l'una dall'altra. Poiché si tratta di una procedura relativamente breve (in genere <45 minuti in anestesia), raramente è necessaria un'ulteriore ketamina dopo la dose iniziale di mantenimento.

2. Passaggio transorale dell'endoscopio per visualizzare la laringe

1. Prima di anestetizzare l'animale, preparare un endoscopio di dimensioni adeguate con capacità di registrazione video.
   NOTA: Utilizziamo abitualmente un otoscopio a zero gradi con un diametro dello stelo di 1,9 mm e una lunghezza dello stelo di 10 cm con una guaina metallica personalizzata (Figura 2), che è l'endoscopio rappresentativo utilizzato in questo protocollo.
   1. Collegare l'endoscopio a una sorgente luminosa e a un sistema di registrazione endoscopica per la visualizzazione in tempo reale e la registrazione video a una velocità minima di 30 fotogrammi al secondo (fps).
   2. La messa a fuoco e il bilanciamento del bianco della fotocamera garantiscono una qualità dell'immagine ottimale.
   3. Collegare l'endoscopio a un micromanipolatore.
      NOTA: Per il tracciamento del movimento laringeo, fissiamo l'endoscopio a un micromanipolatore sulla piattaforma endoscopica per consentire un controllo preciso dell'endoscopio per un'acquisizione video stabile.
2. Fissare il roditore in decubito dorsale su una piattaforma riscaldata. Stabilizzare e immobilizzare la testa fissandola con barre auricolari.
   1. Assicurati che la testa del roditore possa ruotare liberamente su/giù (ma non da un lato all'altro) nelle barre auricolari senza scivolare fuori. Questo grado di libertà facilita l'inserimento transorale e l'avanzamento dell'endoscopio per raggiungere la laringe.
3. Se durante l'endoscopia si desidera la registrazione elettrofisiologica sincrona della respirazione, della deglutizione e della coordinazione deglutizione-respirazione, procedere con l'applicazione di sensori appropriati a tale scopo (Figura 3).
   1. Fissare un sensore respiratorio all'addome sulla linea mediana, immediatamente caudale al processo xifoideo, utilizzando del nastro chirurgico.
   2. Radere e pulire/disinfettare la pelle con una salvietta imbevuta di alcol prima di inserire gli elettrodi dell'ago per prevenire l'infezione.
   3. Utilizzare un ago da 22 G per perforare una piccola apertura attraverso la pelle prima di inserire l'elettrodo dell'ago per evitare danni all'ago per elettromiografia (EMG).
   4. Inserire un elettrodo ad ago EMG concentrico sterile (ad es. 25 mm x 0,3 mm/30 G) attraverso la pelle sottomentoniera sulla linea mediana nella base della lingua (ad es. genioglosso o muscolo genioioideo, a seconda della profondità di inserimento dell'ago).
   5. Inserire un elettrodo di terra (ad es. acciaio inossidabile da 27 G) per via sottocutanea sull'anca (su entrambi i lati).
   6. Collegare il sensore respiratorio e gli elettrodi ad ago EMG a un sistema di registrazione elettrofisiologica (ad es. bioamplificatore e sistema di acquisizione dati con acquisizione video sincrona) e verificare i segnali elettrofisiologici puliti in entrambi i canali prima di procedere.
   7. Avvolgere i siti di connessione degli elettrodi con un foglio di alluminio per schermare dal rumore elettrico e migliorare il rapporto segnale/rumore nelle registrazioni elettrofisiologiche corrispondenti.
   8. Regolare la posizione del sensore respiratorio e la profondità dell'elettrodo dell'ago EMG secondo necessità per ottenere segnali elettrofisiologici puliti in entrambi i canali. Per seguire questo protocollo, utilizzare una frequenza di campionamento di 1k per la respirazione e una frequenza di campionamento di 20k e un filtro passa-banda (ad esempio, 150-3.000 Hz) per l'EMG.
4. Copri il busto del roditore (e il sensore respiratorio) con una coperta trasparente per facilitare la termoregolazione e consentire la visualizzazione del movimento addominale durante la respirazione. Lasciare gli arti posteriori e il basso addome liberamente esposti per l'accesso durante i controlli dei riflessi e il ridosaggio di mantenimento della ketamina. Assicurarsi che la coperta non limiti il movimento addominale durante la respirazione.
5. Procedere con l'endoscopia transorale (Figura 4).
   1. Apri la bocca del roditore inserendo un applicatore affusolato con punta di cotone dietro gli incisivi centrali, perpendicolare alla mascella. Ruotare il batuffolo di cotone sulla superficie dorsale della lingua per sporgerla leggermente dalla bocca.
6. Usando una presa leggera per le dita, tirare delicatamente la lingua fuori dalla bocca su un lato degli incisivi centrali mentre si inserisce la punta dell'endoscopio nella cavità orale (Figura 4A, B).
   1. Accendere la fonte di luce dopo aver inserito la punta dell'endoscopio in bocca per evitare di danneggiare potenzialmente gli occhi del roditore.
   2. Inserire l'endoscopio lateralmente agli incisivi sullo stesso lato della lingua retratta. Gli incisivi centrali impediscono l'inserimento dell'endoscopio sulla linea mediana, rendendo quindi necessario questo approccio di inserimento laterale.
7. Avviare i sistemi di registrazione endoscopica (ed elettrofisiologica). Registrare continuamente durante l'intera procedura per garantire dati sufficienti per l'analisi post hoc o registrare in momenti selezionati, a seconda delle esigenze dello studio.
8. Far avanzare con cautela l'endoscopio per visualizzare l'orofaringe, facendo attenzione a non graffiare contro il palato duro o applicare una pressione eccessiva sulla lingua che potrebbe causare lesioni.
   1. Rimuovere eventuali particelle di cibo visibili e/o secrezioni salivari in eccesso utilizzando un tampone di dimensioni adeguate (ad es. un micro-pennello da 1,5 mm) per ridurre al minimo il rischio di aspirazione man mano che la procedura avanza.
   2. Continuare ad avanzare/regolare la posizione dell'endoscopio fino a quando l'ipofaringe non è centrato all'interno del campo visivo sul monitor e le strutture anatomiche chiave sono identificabili (Figura 4C). A questo punto, tutte le strutture dovrebbero apparire anatomicamente allineate/simmetriche all'interno del campo visivo della fotocamera; In caso contrario, riposizionare l'endoscopio secondo necessità.
   3. Osservare il movimento evocato della mascella/lingua durante l'avanzamento dell'endoscopio. In caso di assenza, procedere senza ulteriori dosi di ketamina. Se presente, somministrare una seconda dose di mantenimento della ketamina (da 1/4 a 1/2 della dose iniziale di ketamina) e attendere circa 5 minuti per fare effetto prima di procedere. Risomministrare la dose solo se sono trascorsi almeno 20 minuti dall'iniezione precedente per evitare l'eccessiva sedazione e l'abolizione della deglutizione.
   4. Esamina la lingua del roditore ogni 5 minuti durante la procedura per verificare che lo scolorimento scurito, che è indicativo di ischemia. Per evitare ciò, riposizionare l'endoscopio secondo necessità.
9. Applicare una leggera pressione sul velo con una microsonda (ad esempio, una spatola metallica) inserita accanto all'endoscopio per disaccoppiare il palato molle e l'epiglottide per visualizzare la laringe a distanza (Figura 4D). Evitare di utilizzare la punta dell'endoscopio per il disaccoppiamento, poiché la pressione applicata può causare danni ai tessuti molli o piegare/danneggiare permanentemente l'asta dell'endoscopio.
   NOTA: A differenza degli esseri umani, la laringe murina non è direttamente visibile da una prospettiva transorale. Invece, l'epiglottide è intrappolata meccanicamente sotto una membrana mucosa sovrastante il velo, il che provoca la formazione di uno spazio ipofaringeo senza uscita. L'applicazione di una leggera pressione sul velo rilascia l'epiglottide dalla membrana velare per dare una visione parziale della laringe.
10. Osservare le deglutizioni evocate durante il disaccoppiamento velum/epiglottide.
    1. Identificare le deglutizioni come bruschi e brevi spostamenti posteriori della lingua verso il palato duro. Questo movimento avviene tipicamente in sincronia con un breve movimento mandibolare/depressione, fornendo così un surrogato per l'identificazione della deglutizione quando la lingua posteriore non è facilmente visibile nel campo visivo dell'endoscopio.
    2. Identificare anche le deglutizioni tramite l'attività di scoppio EMG della lingua in combinazione con brevi episodi di apnea nella registrazione elettrofisiologica, entrambi che si verificano in sincronia con eventi di chiusura glottica nel video endoscopico.
       1. In caso di deglutizione rapida e ripetitiva indicativa di anestesia insufficiente (cioè troppo leggera), ridosare e attendere ~5-10 minuti prima di procedere. Attendere almeno 20 minuti dopo la precedente iniezione di mantenimento della ketamina per evitare l'eccessiva sedazione e l'abolizione della deglutizione.
       2. Considerare la profondità dell'anestetico ottimale quando vengono evocate solo poche deglutizioni durante il disaccoppiamento velare-epiglotto.
       3. Se la deglutizione viene abolita, l'anestesia è troppo profonda per valutare la protezione delle vie aeree laringee. In questo caso, attendere 5-10 minuti per il metabolismo della ketamina prima di procedere con la visualizzazione ravvicinata della laringe.

3. Registrazione video ravvicinata e senza ostacoli del movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione evocata

NOTA: È possibile anche la registrazione elettrofisiologica sincrona della respirazione, della deglutizione e della coordinazione deglutizione-respirazione.

1. Far avanzare lentamente l'endoscopio tra il velo e l'epiglottide mantenendo la laringe al centro del campo visivo (Figura 5A-C).
   NOTA: La punta dell'endoscopio passerà facilmente attraverso l'apertura velare-epiglottica senza forzare. In caso contrario, interrompere la procedura per evitare potenziali danni all'animale. È possibile visualizzare la laringe a distanza, con la punta dell'endoscopio nell'ipofaringe. Tuttavia, questo approccio richiede in genere la retrazione manuale dell'epiglottide, del velo e/o della lingua per una migliore visualizzazione della laringe. Tuttavia, parti della laringe in genere rimangono oscurate alla vista e i dispositivi di retrazione possono limitare il movimento laringeo, che può essere scambiato per disfunzione.
2. Continuare ad avanzare l'endoscopio per ottenere una visione ravvicinata senza ostacoli di tutte le dimensioni ventrale-dorsali e laterali della laringe in un unico campo visivo (Figura 5C).
   NOTA: La commessura ventrale può essere ostruita dall'epiglottide, in particolare nei topi più giovani/più piccoli. In questi casi, il tentativo di manipolare in modo più aggressivo la punta dell'endoscopio per visualizzare la commessura ventrale può limitare il movimento laringeo, che può essere scambiato per disfunzione. Può anche bloccare il flusso d'aria laringeo con conseguente asfissia.
3. Osservare il movimento oscillatorio della laringe mentre il roditore inspira (allargamento della glottide) ed espira (restringimento della glottide) durante ogni ciclo respiratorio.
   NOTA: La velocità e l'entità del movimento laringeo/glottidale possono variare con la profondità dell'anestesia; Tuttavia, un gap glottidale (cioè lo spazio d'aria tra gli aritenoidi sinistro/destro e le corde vocali) rimane tipicamente visibile durante tutto il ciclo respiratorio nei roditori sani.
   1. Se si nota un marcato restringimento glottico, regolare la posizione dell'endoscopio per garantire un flusso d'aria senza ostacoli attraverso le vie aeree superiori. Ad esempio, evitare di esercitare pressione sul velo, che può causare l'ostruzione dei tessuti molli delle vie aeree nasali. Evitare inoltre di inserire la punta dell'endoscopio nello spazio glottidale, che può bloccare il flusso d'aria laringeo portando all'asfissia. Se in rari casi la respirazione cessa, eseguire diverse compressioni toraciche medio-sternali (usando un dito) o ventilazione a pressione positiva (usando una "sacca di rianimazione" in miniatura) dopo aver rimosso l'endoscopio.
4. Videoregistrare il movimento respiratorio laringeo per 30-60 s a scopo di valutazione post hoc.
5. Con la laringe ancora in vista ravvicinata, regolare leggermente la punta dell'endoscopio all'interno dell'ingresso laringeo per applicare la stimolazione meccanica alla mucosa sovrastante il velo e/o l'epiglottide ed evocare la deglutizione in roditori anestetizzati in modo ottimale.
   1. Utilizzare regolazioni di livello micro della punta dell'endoscopio (ad es. ~1 mm in qualsiasi direzione) per prevenire lesioni alla mucosa e/o ostruzione delle vie aeree.
   2. Fai attenzione alle deglutizioni evocate, che possono essere facilmente identificate come eventi di chiusura glottica improvvisa che si verificano in sincronia con la depressione visibile della mascella, l'attività di scoppio EMG della lingua e l'apnea breve (<1/2 s) visibile nel tratto respiratorio.
      NOTA: Possono verificarsi eventi di chiusura glottica senza movimento concomitante della mascella; Tuttavia, la chiusura glottica è in genere incompleta per questi casi. Sospettiamo che questi possano essere altri riflessi protettivi delle vie aeree (ad esempio, il riflesso dell'adduttore laringeo) che emergono quando l'anestesia inizia a svanire; tuttavia, si tratta di eventi rari/incoerenti che richiedono ulteriori indagini.
   3. Ripetere fino a quando non vengono evocate 5-10 rondini e viene registrato un video per animale. Se la deglutizione viene abolita, rimuovere l'endoscopio e attendere 5-10 minuti affinché si verifichi il metabolismo della ketamina prima di procedere.
6. Ritrarre con cautela, ma non rimuovere, l'endoscopio nell'orofaringe e centrare l'ipofaringe nel campo visivo per visualizzare l'epiglottide e il velo.
7. Riaccoppiare il velo e l'epiglottide per riprendere la respirazione nasale utilizzando un micro-tampone per applicare una leggera pressione contro la base della lingua per evocare la deglutizione e il reintrappolamento dell'epiglottide sotto la membrana velare. Se il riaccoppiamento non avviene entro pochi tentativi, procedere con il recupero in anestesia senza riaccoppiamento per evitare il rischio di lesioni laringee.
8. Interrompere la registrazione endoscopica (ed elettrofisiologica).
9. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina per inumidire la lingua e gli incisivi centrali e riportare la lingua nella sua posizione anatomica all'interno della cavità orale.
10. Staccare le barre auricolari e rimuovere la sonda di temperatura, il sensore respiratorio e gli elettrodi EMG dal roditore per procedere con il recupero dell'anestesia.

4. Recupero dell'anestesia

1. Posizionare l'animale in una gabbia di recupero preriscaldata (cioè la stessa della gabbia di induzione) sulla "stazione di riscaldamento" per riprendersi dall'anestesia.
2. Riapplicare il lubrificante per gli occhi per evitare che si secchi.
3. Somministrare soluzione salina riscaldata SC per l'idratazione dei liquidi: fino a 5 ml per i ratti e fino a 0,5 ml per i topi.
4. Somministrare atipamezolo SC per l'inversione della xilazina e per aumentare l'impulso respiratorio: 1-2 mg/kg per ratti e topi.
   1. Iniziare con 2 mg/kg di atipamezolo, immediatamente seguito da una stimolazione manuale lungo la schiena e lo stomaco del roditore per accelerare il recupero.
      NOTA: Utilizzando questo approccio, il movimento spontaneo della testa inizia in genere entro 1-3 minuti. Tuttavia, il ritorno allo stato ambulatoriale richiede in genere una media di 2 ore (da 1 a 5 ore) dopo la laringoscopia in anestesia KX, a causa delle differenze individuali.
   2. Fornire ulteriore atipamezolo alla dose di 1 mg/kg (almeno 15 minuti dopo la prima iniezione) se il movimento spontaneo del corpo sta diminuendo invece di aumentare entro i primi 15-30 minuti dal recupero dell'anestesia, nonostante fornisca una frequente stimolazione manuale.
   3. Procedere con la somministrazione di doxapram (5 mg/kg IP per ratti e topi) se l'attività spontanea continua a diminuire. Ridosare con questo agente di "salvataggio di emergenza" a intervalli di 10-15 minuti (fino a cinque dosi) fino a quando non emerge un movimento spontaneo. Se i roditori rimangono moribondi, sopprimere gli animali utilizzando metodi di eutanasia approvati (ad esempio, un'overdose di ketamina seguita da un metodo secondario come la decapitazione).
5. Monitorare attentamente i roditori in via di guarigione a intervalli di 15-20 minuti per rilevare cambiamenti avversi nello stato respiratorio, nella mobilità e nella termoregolazione e fornire l'intervento necessario (ad esempio, stimolazione manuale, ossigeno supplementare, coperta termica, iniezioni di atipamezolo o doxapram). Fornire un monitoraggio più frequente per i roditori che richiedono un intervento.
   1. Fornire ossigeno supplementare (ad es. 1-2 L/min in una camera di induzione riscaldata, senza ISO) per intervalli di 10 minuti, se necessario per i roditori con tempi di recupero dell'anestesia KX prolungati. In alternativa, applicare una stimolazione frequente lungo le superfici dorsali e ventrali dell'animale per normalizzare i livelli di SpO₂ (>94%).
   2. Posiziona i compagni di gabbia in via di recupero nella stessa gabbia di recupero (fino a due roditori per gabbia) per promuovere una maggiore attività spontanea e un recupero più rapido.
6. Riportano i roditori nella loro gabbia domestica riscaldata quando sono in grado di muoversi spontaneamente all'interno della gabbia di recupero.
   1. Rimetti la borraccia standard per cibo e acqua nella gabbia di casa. Non fornire sistemazioni speciali per l'accesso a cibo/acqua mentre l'anestesia sta ancora svanendo per ridurre al minimo il rischio di soffocamento/aspirazione.
   2. Osservare l'attività della gabbia domestica e rimuovere eventuali ostacoli che impediscono la deambulazione (ad es. capanna, tubo in PVC).
   3. Posizionare la gabbia domestica per metà sopra e per metà fuori dalla stazione di riscaldamento per le successive 12-16 ore (cioè durante la notte).
      NOTA: L'interruzione anticipata del calore supplementare può causare mortalità a causa dell'ipotermia.
7. Esegui i controlli sanitari standard la mattina successiva. Riportare gli animali con la ripresa dell'attività normale/basale, delle funzioni corporee (ad esempio, termoregolazione, mangiare, bere, urinare, defecare) e del peso stabile (ad esempio, mantenere o aumentare) le condizioni standard del vivaio con il monitoraggio quotidiano della salute di routine. Nel raro caso in cui i roditori abbiano diminuito l'attività, le funzioni corporee o il peso corporeo, continua il calore supplementare per un altro giorno.
   NOTA: Per i ratti, è comune che la colorazione della porfirina appaia improvvisamente intorno a entrambi gli occhi ~3-6 ore nel periodo di recupero dell'anestesia. La colorazione si risolve tipicamente entro 24 ore.

5. Quantificazione oggettiva del movimento laringeo durante la respirazione rispetto alla deglutizione

1. Utilizza un software di editing video con una funzione di analisi fotogramma per fotogramma per visualizzare i video dell'endoscopia.
   1. Identificare almeno un episodio rappresentativo di respirazione spontanea di 10-20 s per animale.
   2. Identificare 3-5 eventi di deglutizione rappresentativi per animale.
   3. Assicurarsi che gli episodi/eventi di respirazione e deglutizione selezionati soddisfino i seguenti criteri di analisi: laringe centrata nel campo visivo della telecamera con tutte le strutture/bordi laringei visibili (cioè non oscurati dal velo, dall'epiglottide o dalle secrezioni salivari in eccesso), illuminazione sufficiente (cioè in grado di vedere tutte le strutture/bordi laringei) e senza artefatti di movimento della telecamera (cioè l'endoscopio non si muove).
2. Analizzare gli episodi/eventi di respirazione e deglutizione identificati utilizzando approcci soggettivi e/o oggettivi.
   1. Per l'analisi soggettiva: utilizza una scala Likert per valutare soggettivamente il movimento laringeo durante la visualizzazione in tempo reale e fotogramma per fotogramma utilizzando un software di editing video. Per seguire questo protocollo, utilizzare una scala Likert espansa che va da -2 a +2, dove i valori negativi indicano il movimento laringeo nella direzione opposta a quella prevista. Stimare la protezione delle vie aeree laringee durante la deglutizione, dove 0 = nessuna riduzione della dimensione della fessura glottidale (cioè, nessuna protezione delle vie aeree laringee), 1 = una certa riduzione della fessura glottidale (cioè, protezione incompleta delle vie aeree) e 2 = completa adduzione degli aritenoidi, con solo una piccola fessura glottidale ventrale tra le corde vocali (cioè, protezione completa delle vie aeree), con valori negativi che indicano un movimento laringeo paradosso.
      NOTA: Una scala Likert che va da 0 a 2 è comunemente usata negli studi sui roditori, dove 0 = nessun movimento, 1 = un po' di movimento e 2 = movimento normale 17,18,19,20,21,22. Tuttavia, questa scala non tiene conto del movimento laringeo paradossale che spesso si verifica a seguito di lesioni ricorrenti del nervo laringeo (RLN)¹⁰.
   2. Per un'analisi obiettiva: identificare quattro fotogrammi video chiave: 1) il fotogramma a riposo che precede direttamente l'inizio dell'adduzione laringea (cioè il fotogramma prima dell'addotto delle corde vocali), 2) il fotogramma in cui le corde vocali hanno completato l'adduzione, 3) il fotogramma immediatamente precedente l'abduzione delle corde vocali (questo può sovrapporsi a #2) e 4) il fotogramma in cui le corde vocali sono state completamente abdotte e sono tornate in posizione di riposo per riprendere a respirare. Usa il timestamp di questi quattro fotogrammi chiave per calcolare la durata dell'adduzione delle corde vocali (dal fotogramma 1 al fotogramma 2), dalla chiusura glottica (dal fotogramma 2 al fotogramma 3), dall'abduzione delle corde vocali (dal fotogramma 3 al fotogramma 4) e dalla durata totale della deglutizione (dal fotogramma 1 al fotogramma 4). In alternativa, utilizzare altri software commerciali esistenti²³ per misurare l'angolo glottidale (cioè tra gli aritenoidi dorsalmente o le corde vocali ventralmente) durante la massima abduzione e la massima adduzione utilizzando immagini fisse 17,18,24. Chiedi ad almeno due revisori addestrati di eseguire questo processo in modo indipendente in modo cieco, identificare le discrepanze tra i revisori e raggiungere un consenso congiunto per ogni discrepanza.
      NOTA: In precedenza abbiamo eseguito questa analisi manuale fotogramma per fotogramma degli eventi di temporizzazione della chiusura glottica (ad esempio, durante i riflessi protettivi delle vie aeree) utilizzando software di editing video commerciali nei roditori e negli esseri umani¹⁴. Tuttavia, questo approccio è inefficiente e fornisce solo una quantificazione limitata della dinamica del movimento laringeo. Attualmente utilizziamo un software di tracciamento laringeo costruito internamente per eseguire una quantificazione oggettiva più ampia del movimento laringeo durante la respirazione e dei riflessi protettivi delle vie aeree 22,25,26,27,28,29,30. Il software è dotato di funzionalità di tracciamento automatizzato fotogramma per fotogramma per la quantificazione oggettiva della distanza (ampiezza) e della temporizzazione (frequenza) del movimento laringeo sinistro rispetto a quello destro. Utilizziamo questi parametri per ricavare una varietà di misurazioni basate sul movimento per rilevare/quantificare la disfunzione laringea (ad esempio, angolo glottidale massimo/minimo/intervallo, simmetria del movimento laringeo e sincronia) durante la respirazione, la deglutizione e altri riflessi protettivi delle vie aeree (ad esempio, riflesso dell'adduttore laringeo). Questo software è ancora in fase di perfezionamento e non è ancora disponibile in commercio/al pubblico.

L'uso efficace di questo protocollo di laringoscopia murina consente una visualizzazione ravvicinata della laringe durante la respirazione spontanea e la deglutizione evocata in condizioni di salute e malattia, come mostrato nella Figura 6. Inoltre, questo protocollo può essere ripetuto più volte negli stessi roditori per consentire lo studio della funzione/disfunzione laringea nel tempo. Come mostrato nella Figura 7, abbiamo ...

Abbiamo sviluppato con successo un protocollo di laringoscopia specifico per la topologia che consente la visualizzazione ravvicinata del movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione. È importante sottolineare che il protocollo può essere eseguito nel tempo negli stessi animali per studiare l'impatto di varie condizioni patologiche in particolare sulla funzione laringea. Questo protocollo è stato sviluppato nell'ultimo decennio e ha subito modifiche sostanziali e risol...

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo lavoro è stato finanziato in parte da due sovvenzioni NIH: 1) una sovvenzione R01 multi-PI (TL e NN) (HL153612) dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) e 2) una sovvenzione R03 (TL, DC0110895) dal National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD). Lo sviluppo del nostro software di tracciamento del movimento laringeo personalizzato è stato parzialmente finanziato da una sovvenzione della Coulter Foundation (TL & Filiz Bunyak). Ringraziamo Kate Osman, Chloe Baker, Kennedy Hoelscher e Zola Stephenson per aver fornito un'eccellente cura ai nostri roditori da laboratorio. Ringraziamo anche Roderic Schlotzhauer e Cheston Callais della MU Physics Machine Shop per il loro contributo alla progettazione e alla fabbricazione della nostra piattaforma endoscopica personalizzata e per le modifiche strategiche agli endoscopi commerciali e ai micromanipolatori per soddisfare le nostre esigenze di ricerca. Il nostro software personalizzato di tracciamento del movimento laringeo è stato sviluppato in collaborazione con il Dr. Filiz Bunyak e il Dr. Ali Hamad (MU Electrical Engineering and Computer Science Department). Ringraziamo anche Jim Marnatti di Karl Storz Endoscopy per averci fornito indicazioni sulla scelta dell'otoscopio. Infine, vorremmo ringraziare numerosi ex studenti/tirocinanti del Lever Lab i cui contributi hanno influenzato lo sviluppo del nostro attuale protocollo di laringoscopia murina: Marlena Szewczyk, Cameron Hinkel, Abigail Rovnak, Bridget Hopewell, Leslie Shock, Ian Deninger, Chandler Haxton, Murphy Mastin e Daniel Shu.