Minimalinvasive murine Laryngoskopie zur Nahaufnahme der Kehlkopfbewegung beim Atmen und Schlucken

Dieses Protokoll beschreibt eine serielle transorale Laryngoskopie für Mäuse und Ratten, die eine ungehinderte Videodarstellung des Kehlkopfes während des Atmens und Schluckens aus nächster Nähe unter Verwendung eines optimierten Anästhesieregimes und fein abgestimmter endoskopischer Manipulationstechniken ermöglicht.

Der Kehlkopf ist ein essentielles Organ bei Säugetieren mit drei Hauptfunktionen - Atmen, Schlucken und Vokalisieren. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von Erkrankungen die Kehlkopffunktion beeinträchtigt, was zu Atembeschwerden (Dyspnoe), Schluckstörungen (Dysphagie) und/oder Stimmstörungen (Dysphonie) führt. Insbesondere Dysphagie kann zu einer Aspirationspneumonie und der damit verbundenen Morbidität, wiederholten Krankenhausaufenthalten und einer frühen Mortalität führen. Trotz dieser schwerwiegenden Folgen zielen die bestehenden Behandlungen der Kehlkopfdysfunktion weitgehend auf chirurgische und verhaltensbezogene Eingriffe ab, die leider in der Regel nicht zur Wiederherstellung der normalen Kehlkopffunktion führen, was den dringenden Bedarf an innovativen Lösungen unterstreicht.

Um diese Lücke zu schließen, haben wir einen experimentellen endoskopischen Ansatz entwickelt, um die Kehlkopfdysfunktion in Mausmodellen (d.h. Maus und Ratte) zu untersuchen. Die Endoskopie bei Nagetieren ist jedoch aufgrund ihrer geringen Größe im Vergleich zur aktuellen Endoskoptechnologie, der anatomischen Unterschiede in den oberen Atemwegen und der Notwendigkeit einer Anästhesie, um den Kehlkopf optimal zu erreichen, eine ziemliche Herausforderung. In dieser Arbeit beschreiben wir einen neuartigen transoralen Laryngoskopie-Ansatz, der eine ungehinderte Videodarstellung der Kehlkopfbewegung bei Mäusen und Ratten aus nächster Nähe ermöglicht. Zu den kritischen Schritten im Protokoll gehören ein präzises Anästhesiemanagement (um eine Überdosierung zu verhindern, die das Schlucken überflüssig macht und/oder eine durch Atemnot verursachte Mortalität riskiert) und die Mikromanipulatorsteuerung des Endoskops (für eine stabile Videoaufzeichnung der Kehlkopfbewegung durch einen einzelnen Forscher zur anschließenden Quantifizierung).

Wichtig ist, dass das Protokoll im Laufe der Zeit an denselben Tieren durchgeführt werden kann, um die Auswirkungen verschiedener pathologischer Zustände speziell auf die Kehlkopffunktion zu untersuchen. Ein neuartiger Vorteil dieses Protokolls ist die Möglichkeit, den Atemwegsschutz während des Schluckens sichtbar zu machen, was beim Menschen aufgrund der epiglottischen Inversion über dem Kehlkopfeinlass, die die Sicht auf die Stimmritze behindert, nicht möglich ist. Nagetiere bieten daher eine einzigartige Gelegenheit, die Mechanismen des normalen und pathologischen Schutzes der Kehlkopf-Atemwege spezifisch zu untersuchen, um letztendlich Behandlungen zur effektiven Wiederherstellung der normalen Kehlkopffunktion zu finden.

Der Kehlkopf ist ein knorpeliges Organ, das sich an der Schnittstelle des Atmungs- und des Verdauungstrakts im Rachen befindet, wo es als Ventilmechanismus fungiert, um den Fluss und die Richtung von Luft (d. h. beim Atmen und Vokalisieren) gegenüber Nahrung und Flüssigkeit (d. h. beim Schlucken) präzise zu steuern. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von Erkrankungen den Kehlkopf betreffen, darunter angeborene (z. B. Laryngomalazie, subglottische Stenose), neoplastische (z. B. Kehlkopfpapillomatose, Plattenepithelkarzinom), neurologische (z. B. idiopathische Kehlkopflähmung, Schlaganfall, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose) und iatrogene (z. B. unbeabsichtigte Verletzung bei Kopf- oder Halsoperationen). Unabhängig von der Ätiologie führt eine Kehlkopfdysfunktion typischerweise zu einer Symptomtrias aus Dyspnoe (Atembeschwerden), Dysphonie (Stimmbehinderung) und Dysphagie (Schluckstörungen), die sich negativ auf das wirtschaftliche und soziale Wohlergehen einer Person auswirken 1,2,3,4.

Darüber hinaus kann Dysphagie, insbesondere bei medizinisch fragilen Personen, zu einer Aspirationspneumonie (aufgrund von Nahrung oder Flüssigkeit, die durch einen unvollständig verschlossenen Kehlkopf in die Lunge entweicht) und damit verbundener Morbidität, wiederholten Krankenhausaufenthalten und früher Mortalität führen ^5,6. Trotz dieser schwerwiegenden Folgen zielen die bestehenden Behandlungen der Kehlkopfdysfunktion weitgehend auf chirurgische und verhaltensbezogene Eingriffe ab, die in der Regel nicht die normale Kehlkopffunktion wiederherstellen 1,2,7,8,9,10, was den dringenden Bedarf an innovativen Lösungen unterstreicht. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir einen experimentellen endoskopischen Ansatz entwickelt, um die Kehlkopfdysfunktion in Mausmodellen (d.h. Maus und Ratte) zu untersuchen.

In der Humanmedizin ist der Goldstandard für die Beurteilung der Kehlkopfdysfunktion die endoskopische Visualisierung, die sogenannte Laryngoskopie ^11,12. Typischerweise wird ein flexibles Endoskop durch die Nase geführt, um den Kehlkopf zu untersuchen, insbesondere die Stimmlippen und die angrenzenden supraglottischen und subglottischen Kehlkopfstrukturen. Ein starres Endoskop kann auch verwendet werden, um den Kehlkopf über die Mundhöhle sichtbar zu machen. Beide Ansätze ermöglichen eine grobe Untersuchung der Kehlkopfanatomie und können zur Beurteilung der Beweglichkeit und Funktion des Kehlkopfes während der Atmung, der Phonation und einer Vielzahl von Atemwegsschutzreflexen wie Husten und dem Kehlkopfadduktorenreflex verwendet werden 13,14,15,16. Während des Schluckens wird der Kehlkopf jedoch vollständig von der Epiglottis verdeckt, da sie sich umdreht, um den Kehlkopfeingang zu bedecken und ihn vor dem Weg des Schluckens des Nahrungs-/Flüssigkeitsbolus zu schützen. Dies hat zur Folge, dass eine direkte Visualisierung der Kehlkopfbewegung während des Schluckens beim Menschen nicht möglich ist und daher indirekt mit anderen diagnostischen Ansätzen (z.B. Durchleuchtung, Elektromyographie, Elektroglottographie) abgeleitet werden muss.

In dieser Arbeit wird ein innovatives Laryngoskopie-Protokoll für Mäuse und Ratten beschrieben, das eine ungehinderte Nahaufnahme der Atmung und des Atemwegsschutzes beim Schlucken unter leichter Narkose ermöglicht. Das Protokoll ist mit einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Endoskopiesystemen in Kombination mit einer kundenspezifischen Plattform kompatibel, um das anästhesierte Nagetier während des gesamten Eingriffs zu immobilisieren. Wichtig ist, dass zahlreiche Designs/Konfigurationen von Endoskopie-Plattformen in der Tat möglich sind, abhängig von den verfügbaren Ressourcen und der Forschungsagenda des jeweiligen Labors. Unsere Absicht ist es, Forschern eine Orientierungshilfe zu geben, die sie im Rahmen ihrer Forschung berücksichtigen sollten. Darüber hinaus wollen wir zeigen, wie dieses Laryngoskopie-Protokoll zu einer Fülle objektiver Daten führen kann, die neue Einblicke in unser Verständnis der Kehlkopfdysfunktion und -regeneration ermöglichen können.

Die kombinierte Wirkung aller in diesem murinen Laryngoskopieprotokoll beschriebenen Schritte führt zu einer minimalinvasiven Untersuchung des adulten murinen Kehlkopfes, die bei denselben Tieren wiederholt werden kann, um eine Kehlkopfdysfunktion im Laufe der Zeit als Reaktion auf iatrogene Verletzung, Krankheitsprogression und/oder Behandlungsintervention in Bezug auf den Atemwegsschutz zu erkennen und zu charakterisieren. Bemerkenswert ist, dass dieses Protokoll die vokalisationsbezogene Kehlkopffunktion nicht bewertet.

Das murine Laryngoskopie-Protokoll folgt einem genehmigten Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH). Es wurde für die Verwendung mit über 100 adulten C57BL/6J-Mäusen und über 50 erwachsenen Sprague Dawley-Ratten entwickelt, die ungefähr gleichen Geschlechts sind und für beide Spezies 6 Wochen bis 12 Monate alt sind. Für die Anpassung an jüngere/kleinere Nagetiere ist eine zusätzliche Protokollentwicklung erforderlich. Die Tiere wurden in Gruppen untergebracht (bis zu vier Mäuse oder zwei Ratten pro Käfig, je nach Geschlecht und Wurf). Zu den Standardbedingungen des Vivariums gehörten ein statischer Käfig mit strenger Regulierung der Umgebungstemperatur (20-26 °C), der Luftfeuchtigkeit (30 %-70 %) und ein standardmäßiger 12-Stunden-Lichtzyklus. Alle Tiere erhielten bei wöchentlichen Käfigwechseln frisches Anreicherungsmaterial (z. B. Hütte/Rohr, Zahnbehandlungen, Nestchen). Es wurde unbegrenzter Zugang zu Nahrung und Wasser gewährt, außer während einer kurzen (bis zu 4-6 Stunden) Nahrungseinschränkung vor der Narkose, wie unten beschrieben. Veterinär- und Forschungspersonal überwachte die Tiere täglich.

1. Tieranästhesie, die das Schlucken nicht abschafft

1. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Maske), um die Allergenexposition bei der Arbeit mit Nagetieren zu minimieren.
2. Beschränken Sie jeden Nagetierkäfig bis zu 4-6 Stunden vor der Anästhesie, um die Rückhaltung von Nahrung in der Mundhöhle und im Rachen zu minimieren, was die endoskopische Visualisierung beeinträchtigen und/oder zu einer Nahrungsaspiration während des Eingriffs führen kann.
   HINWEIS: Nahrungsretention in der Mundhöhle ist ein normaler Befund bei Nagetieren ohne Dysphagie, wenn sie nicht auf Nahrung beschränkt wurden.
3. Bereiten Sie eine "Wärmestation" für die Einweisung/Bergung der Tiere vor.
   1. Erwärmen Sie ein wasserzirkulierendes Heizkissen auf einer Tischplatte auf 37 °C.
   2. Auswahl von Induktions-/Rückgewinnungskäfigen in geeigneter Größe für die zu prüfende Tierart. Zum Beispiel sind Maus-Schuhkartonkäfige mit Filterdeckeln für die Induktion/Rückgewinnung von Mäusen und Ratten angemessen dimensioniert. Für jedes zu prüfende Tier ist ein frischer Induktions-/Auffangkäfig zu verwenden; Verwenden Sie einen einzelnen Käfig sowohl als Induktions- als auch als Auffangkäfig für dasselbe Tier.
   3. Legen Sie den Boden des Induktions-/Erholungskäfigs mit einer leichten Schicht aus saugfähigem Material (z. B. Eselsspäne, Papiertuch, Welpenpolster) aus, um Wärme und Absorption von Körpersekreten während der Anästhesieeinleitung und -erholung zu gewährleisten.
   4. Legen Sie die vorbereiteten Käfige (mit Filterdeckeln) vor der Narkoseeinleitung 30-60 Minuten lang vollständig auf das Heizkissen.
      HINWEIS: Diese Mikroumgebung bietet ausreichend zusätzliche Wärme, um einen stabilen Anästhesiestoffwechsel während der Induktion und Genesung zu fördern.
4. Stellen Sie den Heimkäfig des Tieres vor der Narkoseeinleitung etwa 30 Minuten lang halb auf das vorgeheizte 37 °C-Heizkissen.
   HINWEIS: Die Bereitstellung von zusätzlicher Wärme vor dem Eingriff kann die Induktion der Anästhesie beschleunigen und eine versehentliche Überdosierung aufgrund eines verlangsamten/verzögerten Anästhesiestoffwechsels durch Unterkühlung verhindern.
5. Bereiten Sie eine Ketamin-Xylazin (KX)-Anästhesie basierend auf der Spezies und dem Körpergewicht vor.
   1. Für Mäuse: Eine Mischung aus 90 mg/kg Ketamin und 11 mg/kg Xylazin ist ausreichend für die transorale Laryngoskopie bei adulten C57BL/6-Hintergrundmäusen beiderlei Geschlechts. Passen Sie die Dosen für andere Mausstämme und Altersgruppen an.
   2. Für Ratten: Eine Mischung aus 60 mg/kg Ketamin und 6 mg/kg Xylazin ist ausreichend für die transorale Laryngoskopie bei erwachsenen Sprague Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts. Passen Sie die Dosen für andere Rattenstämme und -alter an.
6. Erwärmen Sie die mit Spritzen gefüllten Narkosemittel auf der 37 °C warmen Warmhaltestation, um Wärmeverluste bei den Tieren zu vermeiden, die bei der Injektion kalter Flüssigkeiten entstehen.
7. Injizieren Sie dem Nagetier die berechnete KX-Dosis mit einer Spritze geeigneter Größe (z. B. 1 ml) und einer Nadel (z. B. 26 G1/2).
   1. Bei Mäusen: Verabreichen Sie eine einzelne subkutane (SC) Injektion.
      HINWEIS: Nach unserer Erfahrung reduzieren/beseitigen SC-Injektionen bei Mäusen die anästhesiebedingte Mortalität im Vergleich zu intraperitonealen (IP) Injektionen.
   2. Bei Ratten: Verabreichen Sie eine einzelne SC- oder IP-Injektion. Falls gewünscht, sedieren Sie Ratten mit Isofluran (ISO) (3-5%) in einer Induktionskammer unmittelbar vor der KX-Injektion.
      HINWEIS: Spontane Körperbewegungen können für einen kurzen Zeitraum (in der Regel <1 min) wieder aufgenommen werden, bis der KX wirkt.
8. Verabreichen Sie Glycopyrrolat (Anticholinergikum) unmittelbar nach der KX-Injektion, um überschüssige Speichelsekrete zu reduzieren, die die Visualisierung des Kehlkopfes während der transoralen Endoskopie behindern und/oder die oberen Atemwege während der Anästhesieerholung mechanisch blockieren können.
   HINWEIS: Die Dosierung und der Verabreichungsweg sind für Mäuse und Ratten identisch (0,01-0,02 mg/kg SC), und die Wirkung tritt nahezu sofort ein und hält mehrere Stunden an.
9. Nach der Glykopyrrolat-Injektion legen Sie das anästhesierte Nagetier in den vorgeheizten Induktionskäfig auf der Wärmestation und decken Sie den Käfig mit einem chirurgischen Abdecktuch ab, um eine abgedunkelte Umgebung zu schaffen, die die visuelle Stimulation für 10 Minuten ungestört minimiert.
   1. Beenden Sie das Verfahren, wenn das Nagetier 10 Minuten nach der anfänglichen KX-Dosis gehfähig bleibt.
      HINWEIS: Versuche, eine zusätzliche Anästhesie (entweder KX- oder Ketamin-Erhaltung) durchzuführen, werden wahrscheinlich vergeblich sein.
10. Nach 10 Minuten ist eine Erhaltungsdosis Ketamin zu verabreichen (1/4 der Anfangsdosis, wenn die Reflexe der Hintergliedmaßen vermindert sind, oder 1/2 der Anfangsdosis, wenn die Reflexe der Hintergliedmaßen lebhaft sind; SC für Mäuse und SC/IP für Ratten), um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
11. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut und ein damit verbundenes Trauma während der Laryngoskopie zu verhindern.
12. Übertragen Sie das anästhesierte Nagetier auf eine benutzerdefinierte Endoskopieplattform, um mit der Laryngoskopie zu beginnen.
    HINWEIS: Wir haben unsere Endoskopie-Plattform (Abbildung 1) so konzipiert, dass sie über mehrere Funktionen verfügt, die mit einer Vielzahl von chirurgischen und elektrophysiologischen Ansätzen für Nagetiere verwendet werden können, die nicht unbedingt eine Endoskopie erfordern. Als solches ist es für den rein endoskopischen Einsatz überdimensioniert. Gegebenenfalls werden wir Merkmale/Komponenten hervorheben, die für dieses Laryngoskopie-Protokoll unerlässlich sind.
13. Von diesem Zeitpunkt an überprüfen Sie die Reflexe der hinteren Gliedmaßen während des gesamten Eingriffs alle 15-20 Minuten und geben Sie bei Bedarf zusätzliche Ketamin-Erhaltungsdosen, die mindestens 20 Minuten voneinander entfernt sind. Da es sich um ein relativ kurzes Verfahren handelt (typischerweise <45 Minuten unter Narkose), ist nach der anfänglichen Erhaltungsdosis selten zusätzliches Ketamin erforderlich.

2. Transorale Passage des Endoskops zur Visualisierung des Kehlkopfes

1. Bereiten Sie vor der Betäubung des Tieres ein Endoskop in geeigneter Größe mit Videoaufzeichnungsfunktion vor.
   HINWEIS: Wir verwenden routinemäßig ein Null-Grad-Otoskop mit einem Schaftdurchmesser von 1,9 mm und einer Schaftlänge von 10 cm mit einer kundenspezifischen Metallhülle (Abbildung 2), das repräsentative Endoskop, das in diesem Protokoll verwendet wird.
   1. Schließen Sie das Endoskop an eine Lichtquelle und ein Endoskopie-Aufzeichnungssystem an, um eine Echtzeitbetrachtung und Videoaufzeichnung mit mindestens 30 Bildern pro Sekunde (fps) zu ermöglichen.
   2. Fokussieren und Weißabgleich der Kamera für eine optimale Bildqualität.
   3. Befestigen Sie das Endoskop an einem Mikromanipulator.
      HINWEIS: Für die Verfolgung der Kehlkopfbewegung befestigen wir das Endoskop an einem Mikromanipulator auf der Endoskopieplattform, um eine präzise Endoskopsteuerung für eine stabile Videoaufnahme zu ermöglichen.
2. Sichern Sie den Nager in Rückenlage auf einer beheizten Plattform. Stabilisieren und fixieren Sie den Kopf, indem Sie ihn mit Ohrstangen sichern.
   1. Stellen Sie sicher, dass sich der Kopf des Nagetiers in den Ohrbügeln frei nach oben/unten drehen kann (aber nicht von einer Seite zur anderen), ohne herauszurutschen. Dieser Freiheitsgrad erleichtert das transorale Einführen und Vorschieben des Endoskops bis zum Kehlkopf.
3. Wenn während der Endoskopie eine synchrone elektrophysiologische Aufzeichnung von Atmung, Schlucken und Schluckatmungskoordination gewünscht wird, setzen Sie hierfür geeignete Sensoren ein (Abbildung 3).
   1. Befestigen Sie einen Atemsensor mit chirurgischem Klebeband am Bauch in der Mittellinie, unmittelbar kaudal des Xyphoidfortsatzes.
   2. Rasieren und reinigen/desinfizieren Sie die Haut mit einem Alkoholtupfer, bevor Sie die Nadelelektroden einführen, um eine Infektion zu vermeiden.
   3. Verwenden Sie eine 22-G-Nadel, um eine kleine Öffnung durch die Haut zu stechen, bevor Sie die Nadelelektrode einführen, um eine Beschädigung der Elektromyographie (EMG) zu vermeiden.
   4. Führen Sie eine sterile konzentrische EMG-Nadelelektrode (z. B. 25 mm x 0,3 mm/30 G) durch die submentale Haut an der Mittellinie in den Zungenansatz ein (z. B. Musculus genioglossus oder Musculus geniohyoidus, abhängig von der Einstichtiefe der Nadel).
   5. Führen Sie eine Masseelektrode (z. B. 27 G Edelstahl) subkutan an der Hüfte (beidseitig) ein.
   6. Schließen Sie den Atemsensor und die EMG-Nadelelektroden an ein elektrophysiologisches Aufzeichnungssystem an (z. B. Bioverstärker und Datenerfassungssystem mit synchroner Videoaufnahme) an und überprüfen Sie saubere elektrophysiologische Signale in beiden Kanälen, bevor Sie fortfahren.
   7. Umwickeln Sie die Elektrodenverbindungsstellen mit Aluminiumfolie, um elektrisches Rauschen abzuschirmen und das Signal-Rausch-Verhältnis in den entsprechenden elektrophysiologischen Aufzeichnungen zu verbessern.
   8. Passen Sie die Position des Atemsensors und die Elektrodentiefe der EMG-Nadel nach Bedarf an, um saubere elektrophysiologische Signale in beiden Kanälen zu erhalten. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie eine Abtastrate von 1 k für die Atmung und eine Abtastrate von 20 k und einen Bandpassfilter (z. B. 150-3.000 Hz) für EMG.
4. Decken Sie den Oberkörper (und den Atemsensor) des Nagetiers mit einer transparenten Decke ab, um die Wärmeregulierung zu erleichtern und gleichzeitig die Visualisierung der Bauchbewegungen während der Atmung zu ermöglichen. Lassen Sie die Hinterbeine und den Unterbauch frei für den Zugang während der Reflexkontrollen und der erneuten Ketamin-Erhaltungsdosis. Stellen Sie sicher, dass die Decke die Bauchbewegung während der Atmung nicht einschränkt.
5. Fahren Sie mit der transoralen Endoskopie fort (Abbildung 4).
   1. Öffnen Sie das Maul des Nagetiers, indem Sie einen spitz zulaufenden Applikator mit Wattespitze senkrecht zum Kiefer hinter die mittleren Schneidezähne einführen. Drehen Sie das Wattestäbchen auf der dorsalen Oberfläche der Zunge, so dass es leicht aus dem Mund herausragt.
6. Ziehen Sie die Zunge mit einem leichten Fingergriff vorsichtig leicht aus dem Mund zu einer Seite der mittleren Schneidezähne, während Sie die Endoskopspitze in die Mundhöhle einführen (Abbildung 4A,B).
   1. Schalten Sie die Lichtquelle ein, nachdem Sie die Endoskopspitze in den Mund eingeführt haben, um eine mögliche Schädigung der Augen des Nagetiers zu vermeiden.
   2. Führen Sie das Endoskop seitlich der Schneidezähne auf der gleichen Seite wie die eingezogene Zunge ein. Die mittleren Schneidezähne verhindern das Einführen des Endoskops an der Mittellinie, so dass dieser laterale Einführzugang notwendig wird.
7. Starten Sie die Endoskopie- (und Elektrophysiologie-) Aufzeichnungssysteme. Zeichnen Sie während des gesamten Verfahrens kontinuierlich auf, um genügend Daten für die Post-hoc-Analyse zu gewährleisten, oder zeichnen Sie je nach Bedarf der Studie zu ausgewählten Zeiten auf.
8. Schieben Sie das Endoskop vorsichtig vor, um den Oropharynx sichtbar zu machen, und achten Sie darauf, nicht gegen den harten Gaumen zu kratzen oder übermäßigen Druck auf die Zunge auszuüben, der zu Verletzungen führen kann.
   1. Entfernen Sie sichtbare Speisereste und/oder überschüssige Speichelsekrete mit einem Tupfer in geeigneter Größe (z. B. einer 1,5-mm-Mikrobürste), um das Aspirationsrisiko im weiteren Verlauf des Eingriffs zu minimieren.
   2. Fahren Sie mit dem Verschieben/Einstellen der Endoskopposition fort, bis der Hypopharynx innerhalb des Sichtfelds auf dem Monitor zentriert ist und wichtige anatomische Strukturen erkennbar sind (Abbildung 4C). Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Strukturen anatomisch ausgerichtet/symmetrisch im Sichtfeld der Kamera erscheinen; Andernfalls positionieren Sie das Endoskop nach Bedarf neu.
   3. Achten Sie auf evozierte Kiefer-/Zungenbewegungen während des Vorschiebens des Endoskops. Wenn nicht vorhanden, fahren Sie ohne weitere Ketamin-Neudosierung fort. Falls vorhanden, verabreichen Sie eine zweite Ketamin-Erhaltungsdosis (1/4 bis 1/2 der Anfangsdosis von Ketamin) und warten Sie etwa 5 Minuten, bis die Wirkung eintritt, bevor Sie fortfahren. Wiederholen Sie die Dosis nur, wenn seit der letzten Injektion mindestens 20 Minuten vergangen sind, um eine Übersedierung und Abschaffung des Schluckens zu vermeiden.
   4. Untersuchen Sie die Zunge des Nagetiers während des gesamten Eingriffs alle 5 Minuten auf dunkle Verfärbungen, die auf eine Ischämie hinweisen. Um dies zu vermeiden, positionieren Sie das Endoskop nach Bedarf neu.
9. Üben Sie mit einer Mikrosonde (z. B. einem Metallspatel), die neben das Endoskop eingeführt wird, leichten Druck auf das Velum aus, um den weichen Gaumen und den Epiglottis zu entkoppeln und den Kehlkopf aus der Ferne sichtbar zu machen (Abbildung 4D). Vermeiden Sie es, die Endoskopspitze zum Entkoppeln zu verwenden, da der ausgeübte Druck das Weichgewebe schädigen oder den Endoskopschaft dauerhaft verbiegen/beschädigen kann.
   HINWEIS: Im Gegensatz zum Menschen ist der murine Kehlkopf aus transoraler Perspektive nicht direkt sichtbar. Stattdessen wird die Epiglottis mechanisch unter einer Schleimhaut über dem Velum eingeklemmt, was zur Bildung eines hypopharyngealen Sackgassenraums führt. Durch leichten Druck auf das Velum wird die Epiglottis von der Velarmembran gelöst, so dass der Kehlkopf teilweise sichtbar wird.
10. Auf evozierte Schwalben während der Entkopplung von Velum/Epiglottis achten.
    1. Identifizieren Sie Schwalben als abrupte, kurze hintere Zungenverschiebungen in Richtung des harten Gaumens. Diese Bewegung tritt typischerweise synchron mit einer kurzen Unterkieferbewegung/-senkung auf und bietet somit ein Surrogat für die Identifizierung des Schluckens, wenn die hintere Zunge im Sichtfeld des Endoskops nicht ohne weiteres sichtbar ist.
    2. Identifizieren Sie auch Schlucken über die Zungen-EMG-Burst-Aktivität in Verbindung mit kurzen apnoischen Episoden in der elektrophysiologischen Aufzeichnung, die beide synchron mit den glottischen Verschlussereignissen im Endoskopievideo auftreten.
       1. Im Falle von schnellem, wiederholtem Schlucken, das auf eine unzureichende Anästhesie (d. h. zu leicht) hinweist, wiederholen Sie die Dosis und warten Sie ~5-10 Minuten, bevor Sie fortfahren. Warten Sie mindestens 20 Minuten nach der vorherigen Ketamin-Erhaltungsinjektion, um eine Übersedierung und Abschaffung des Schluckens zu vermeiden.
       2. Betrachten Sie die Narkosetiefe als optimal, wenn bei der velar-epiglottischen Entkopplung nur wenige Schlucke hervorgerufen werden.
       3. Wenn das Schlucken aufgehoben wird, ist die Anästhesie zu tief, um den Schutz der Kehlkopf-Atemwege zu beurteilen. Warten Sie in diesem Fall 5-10 Minuten, bis sich der Ketaminstoffwechsel eingestellt hat, bevor Sie mit der Nahdarstellung des Kehlkopfes fortfahren.

3. Ungehinderte Videoaufzeichnung der Kehlkopfbewegung während der Atmung und des evozierten Schluckens aus nächster Nähe

HINWEIS: Die synchrone elektrophysiologische Aufzeichnung von Atmung, Schlucken und Schluck-Atem-Koordination ist ebenfalls eine Option.

1. Schieben Sie das Endoskop langsam zwischen Velum und Epiglottis vor, während Sie den Kehlkopf in der Mitte des Sichtfeldes halten (Abbildung 5A-C).
   HINWEIS: Die Endoskopspitze lässt sich ohne Krafteinwirkung leicht durch die velar-epiglottische Öffnung führen. Andernfalls brechen Sie den Eingriff ab, um mögliche Schäden für das Tier zu vermeiden. Es ist möglich, den Kehlkopf aus der Ferne zu visualisieren, wobei sich die Endoskopspitze im Hypopharynx befindet. Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel eine manuelle Retraktion der Epiglottis, des Velums und/oder der Zunge, um die Visualisierung des Kehlkopfes zu verbessern. Teile des Kehlkopfes bleiben jedoch in der Regel unsichtbar, und die Retraktionsvorrichtungen können die Kehlkopfbewegung einschränken, was als Funktionsstörung missverstanden werden kann.
2. Schieben Sie das Endoskop weiter vor, um eine ungehinderte Nahansicht der gesamten ventral-dorsalen und lateralen Abmessungen des Kehlkopfes in einem einzigen Sichtfeld zu erhalten (Abbildung 5C).
   HINWEIS: Die ventrale Kommissur kann durch die Epiglottis blockiert sein, insbesondere bei jüngeren/kleineren Mäusen. In diesen Fällen kann der Versuch, die Endoskopspitze aggressiver zu manipulieren, um die ventrale Kommissur sichtbar zu machen, die Kehlkopfbewegung einschränken, was als Funktionsstörung missverstanden werden kann. Es kann auch den Kehlkopfluftstrom blockieren, was zum Ersticken führt.
3. Beobachten Sie die oszillatorische Bewegung des Kehlkopfes, während jedes Atemzyklus beim Einatmen (Glottumweitung) und Ausatmen (Glottumverengung).
   HINWEIS: Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Kehlkopf-/Glottalbewegung können mit der Anästhesietiefe variieren. Bei gesunden Nagetieren bleibt jedoch typischerweise ein Glottusspalt (d. h. der Luftraum zwischen den linken/rechten Arytenoiden und den Stimmlippen) während des gesamten Atmungszyklus sichtbar.
   1. Wenn eine ausgeprägte Glottenverengung festgestellt wird, passen Sie die Position des Endoskops an, um einen ungehinderten Luftstrom durch die oberen Atemwege zu gewährleisten. Vermeiden Sie zum Beispiel Druck auf das Velum, der zu einer Verstopfung der Nasenwege durch das Weichgewebe führen kann. Vermeiden Sie es auch, die Endoskopspitze in den Glottusraum einzuführen, da dies den Kehlkopfluftstrom blockieren und zum Ersticken führen kann. Wenn in seltenen Fällen die Atmung aussetzt, führen Sie nach dem Entfernen des Endoskops mehrere mittelsternale Thoraxkompressionen (mit einem Finger) oder eine Überdruckbeatmung (mit einem Miniatur-"Reanimationsbeutel") durch.
4. Aufzeichnung der Atembewegung des Kehlkopfes für 30-60 s für Post-hoc-Auswertungszwecke.
5. Während sich der Kehlkopf noch in Nahaufnahme befindet, passen Sie die Endoskopspitze im Kehlkopfeingang leicht an, um eine mechanische Stimulation auf die Schleimhaut über dem Velum und/oder der Epiglottis auszuüben und bei optimal betäubten Nagetieren das Schlucken hervorzurufen.
   1. Verwenden Sie Anpassungen der Endoskopspitze auf Mikroebene (d. h. ~1 mm in jede Richtung), um Schleimhautverletzungen und/oder Obstruktion der Atemwege zu vermeiden.
   2. Achten Sie auf evozierte Schlucken, die leicht als abrupte glottische Verschlussereignisse identifiziert werden können, die synchron mit der sichtbaren Kieferdepression, der EMG-Platzaktivität der Zunge und der kurzen (<1/2 s) Apnoe auftreten, die in der Atemwegsspur sichtbar ist.
      HINWEIS: Glottische Verschlussereignisse ohne gleichzeitig auftretende Kieferbewegung können auftreten; In diesen Fällen ist der glottische Verschluss jedoch in der Regel unvollständig. Wir vermuten, dass es sich dabei um andere Atemwegsschutzreflexe (z. B. Kehlkopfadduktorenreflex) handeln könnte, die entstehen, wenn die Anästhesie nachlässt; Es handelt sich jedoch um seltene/inkonsistente Vorkommnisse, die weitere Untersuchungen erfordern.
   3. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 5-10 Schwalben pro Tier hervorgerufen und ein Video aufgezeichnet wurden. Wenn das Schlucken aufgehoben ist, entfernen Sie das Endoskop und warten Sie 5-10 Minuten, bis der Ketaminstoffwechsel eingetreten ist, bevor Sie fortfahren.
6. Ziehen Sie das Endoskop vorsichtig in den Oropharynx ein, aber entfernen Sie es nicht und zentrieren Sie den Hypopharynx im Sichtfeld, um den Epiglottis und das Velum sichtbar zu machen.
7. Koppeln Sie das Velum und die Epiglottis wieder an, um die Nasenatmung wieder aufzunehmen, indem Sie mit einem Mikrotupfer leichten Druck auf den Zungengrund ausüben, um das Schlucken und erneute Einklemmen der Epiglottis unter der Velarmembran hervorzurufen. Wenn die Rekopplung nicht innerhalb weniger Versuche erfolgt, fahren Sie mit der Anästhesiewiederherstellung ohne erneute Kopplung fort, um das Risiko einer Kehlkopfverletzung zu vermeiden.
8. Stoppen Sie die Endoskopie (und Elektrophysiologie) Aufzeichnung.
9. Verwenden Sie ein in Kochsalzlösung getränktes Wattestäbchen, um die Zunge und die mittleren Schneidezähne zu befeuchten und die Zunge wieder in ihre anatomische Position in der Mundhöhle zu bringen.
10. Nehmen Sie die Ohrbügel ab und entfernen Sie den Temperaturfühler, den Atemsensor und die EMG-Elektroden vom Nagetier, um mit der Wiederherstellung der Anästhesie fortzufahren.

4. Wiederherstellung der Anästhesie

1. Setzen Sie das Tier in einen vorgewärmten Auffangkäfig (d. h. den gleichen wie den Induktionskäfig) auf die "Wärmestation", um sich von der Narkose zu erholen.
2. Tragen Sie erneut Augenschmiermittel auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
3. Verabreichen Sie erwärmte Kochsalzlösung SC zur Flüssigkeitshydratation: bis zu 5 ml für Ratten und bis zu 0,5 ml für Mäuse.
4. Verabreichen Sie Atipamezol SC zur Umkehrung von Xylazin und zur Erhöhung des Atemantriebs: 1-2 mg/kg bei Ratten und Mäusen.
   1. Beginnen Sie mit 2 mg/kg Atipamezol, unmittelbar gefolgt von einer manuellen Stimulation entlang des Rückens und des Magens des Nagetiers, um die Genesung zu beschleunigen.
      HINWEIS: Bei diesem Ansatz beginnt die spontane Kopfbewegung in der Regel innerhalb von 1-3 Minuten. Die Rückkehr in den ambulanten Status dauert jedoch aufgrund individueller Unterschiede in der Regel durchschnittlich 2 h (zwischen 1 und 5 h) nach einer Laryngoskopie unter KX-Anästhesie.
   2. Geben Sie zusätzliches Atipamezol in einer Dosierung von 1 mg/kg (mindestens 15 Minuten nach der ersten Injektion), wenn die spontane Körperbewegung innerhalb der ersten 15-30 Minuten nach der Narkoseerholung abnimmt, anstatt zuzunehmen, trotz häufiger manueller Stimulation.
   3. Fahren Sie mit der Verabreichung von Doxapram (5 mg/kg IP für Ratten und Mäuse) fort, wenn die Spontanaktivität weiterhin abnimmt. Wiederholen Sie die Dosis mit diesem "Notfallrettungsmittel" in Abständen von 10-15 Minuten (bis zu fünf Dosen), bis eine spontane Bewegung auftritt. Wenn Nagetiere tot bleiben, schläfern Sie die Tiere mit zugelassenen Euthanasiemethoden ein (z. B. eine Überdosis Ketamin, gefolgt von einer sekundären Methode wie Enthauptung).
5. Überwachen Sie sich erholende Nagetiere in Abständen von 15 bis 20 Minuten genau, um nachteilige Veränderungen des Atmungsstatus, der Beweglichkeit und der Thermoregulation zu erkennen und bei Bedarf einzugreifen (z. B. manuelle Stimulation, zusätzlicher Sauerstoff, Wärmedecke, Atipamezol oder Doxapram-Injektionen). Häufigere Überwachung von Nagetieren, die ein Eingreifen erfordern.
   1. Stellen Sie zusätzlichen Sauerstoff (z. B. 1-2 l/min in einer erwärmten Induktionskammer, ohne ISO) für 10-Minuten-Intervalle bereit, je nach Bedarf für Nagetiere mit langwierigen KX-Anästhesie-Erholungszeiten. Alternativ können Sie häufig entlang der dorsalen und ventralen Oberflächen des Tieres stimulieren, um den SpO2-Spiegel (>94%) zu normalisieren.
   2. Setzen Sie sich erholende Käfiggenossen in denselben Auffangkäfig (bis zu zwei Nagetiere pro Käfig), um eine erhöhte spontane Aktivität und eine schnellere Genesung zu fördern.
6. Bringen Sie Nagetiere in ihren beheizten Käfig zurück, wenn sie sich spontan im Auffangkäfig bewegen können.
   1. Bringen Sie die Standard-Futter- und Wasserflasche in den Käfig zurück. Stellen Sie keine besonderen Vorkehrungen für den Zugang zu Nahrung/Wasser bereit, während die Anästhesie noch nachlässt, um das Erstickungs-/Aspirationsrisiko zu minimieren.
   2. Beobachten Sie die Aktivität im Käfig und entfernen Sie alle Hindernisse, die das Gehen behindern (z. B. Hütte, PVC-Rohr).
   3. Stellen Sie den Heimkäfig für die nächsten 12-16 Stunden (d. h. über Nacht) halb auf, halb außerhalb der Wärmestation.
      HINWEIS: Ein früheres Absetzen der zusätzlichen Wärme kann aufgrund von Unterkühlung zum Tod führen.
7. Führen Sie am nächsten Morgen standardmäßige Zustandsprüfungen durch. Bringen Sie die Tiere mit der Wiederaufnahme der normalen/Ausgangsaktivität, der Körperfunktionen (z. B. Thermoregulation, Fressen, Trinken, Urinieren, Stuhlgang) und des stabilen Gewichts (d. h. Halten oder Zunehmen) mit routinemäßiger täglicher Gesundheitsüberwachung auf die Standard-Vivariumbedingungen zurück. In dem seltenen Fall, dass Nagetiere ihre Aktivität, ihre Körperfunktionen oder ihr Körpergewicht vermindert haben, setzen Sie die zusätzliche Wärme für einen weiteren Tag fort.
   HINWEIS: Bei Ratten ist es üblich, dass Porphyrin-Flecken um beide Augen herum ~3-6 Stunden nach Beginn der Anästhesie-Erholungsphase plötzlich auftreten. Die Verfärbung verschwindet in der Regel innerhalb von 24 Stunden.

5. Objektive Quantifizierung der Kehlkopfbewegung beim Atmen im Vergleich zum Schlucken

1. Verwenden Sie eine Videobearbeitungssoftware mit einer Bild-für-Bild-Analysefunktion, um die Endoskopievideos anzusehen.
   1. Identifizieren Sie mindestens eine repräsentative 10-20 s Episode der Spontanatmung pro Tier.
   2. Identifizieren Sie 3-5 repräsentative Schluckereignisse pro Tier.
   3. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Atem- und Schluckepisoden/-ereignisse die folgenden Analysekriterien erfüllen: der Kehlkopf zentriert im Sichtfeld der Kamera, wobei alle Kehlkopfstrukturen/-grenzen sichtbar sind (d. h. nicht durch das Velum, die Epiglottis oder überschüssige Speichelsekrete verdeckt sind), ausreichende Beleuchtung (d. h. in der Lage, alle Kehlkopfstrukturen/-grenzen zu sehen) und ohne Kamerabewegungsartefakt (d. h. das Endoskop bewegt sich nicht).
2. Analysieren Sie die identifizierten Atem- und Schluckepisoden/-ereignisse mit subjektiven und/oder objektiven Ansätzen.
   1. Für die subjektive Analyse: Verwenden Sie eine Likert-Skala, um die Kehlkopfbewegung während der Echtzeit- und Bild-für-Bild-Betrachtung mit Hilfe einer Videobearbeitungssoftware subjektiv zu bewerten. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie eine erweiterte Likert-Skala von -2 bis +2, wobei negative Werte eine Kehlkopfbewegung in die entgegengesetzte Richtung als erwartet anzeigen. Schätzen Sie den Schutz der Kehlkopf-Atemwege während des Schluckens, wobei 0 = keine Verringerung der Größe des Glottusspalts (d. h. kein Schutz der Kehlkopf-Atemwege), 1 = eine gewisse Verringerung des Glottusspalts (d. h. unvollständiger Atemwegsschutz) und 2 = vollständige Adduktion der Arytenoide mit nur einem kleinen ventralen Glottusspalt zwischen den Stimmlippen (d. h. vollständiger Atemwegsschutz), wobei negative Werte auf eine paradoxe Kehlkopfbewegung hinweisen.
      HINWEIS: Eine Likert-Skala von 0 bis 2 wird häufig in Nagetierstudien verwendet, bei der 0 = keine Bewegung, 1 = etwas Bewegung und 2 = normale Bewegung 17,18,19,20,21,22 ist. Diese Skala berücksichtigt jedoch nicht die paradoxe Kehlkopfbewegung, die häufig nach einer rezidivierenden Verletzung des Kehlkopfnervs (RLN) auftritt¹⁰.
   2. Für eine objektive Analyse: Identifizieren Sie vier Schlüsselbilder - 1) das Ruhebild, das der Initiierung der Kehlkopfadduktion unmittelbar vorausgeht (d. h. das Bild vor dem Stimmlippenaddukt), 2) das Bild, in dem die Stimmlippen die Adduktion abgeschlossen haben, 3) das Bild, das unmittelbar vor der Abduktion der Stimmlippen liegt (dies kann sich mit #2 überschneiden) und 4) das Bild, in dem die Stimmlippen vollständig abduziert sind und in eine Ruheposition zurückgebracht werden, um die Atmung wieder aufzunehmen. Verwenden Sie den Zeitstempel dieser vier Schlüsselbilder, um die Dauer der Stimmlippenadduktion (Bild 1 bis Bild 2), des glottischen Verschlusses (Bild 2 bis Bild 3), der Stimmlippenabduktion (Bild 3 bis Bild 4) und der Gesamtschluckdauer (Bild 1 bis Bild 4) zu berechnen. Alternativ kann eine andere vorhandene kommerzielle Software²³ verwendet werden, um den Glottalwinkel (d. h. zwischen den Arytenoiden dorsal oder den Stimmlippen ventral) während der maximalen Abduktion und der maximalen Adduktion unter Verwendung von Standbildern^{17, 18, 24} zu messen. Lassen Sie mindestens zwei geschulte Gutachter diesen Prozess unabhängig voneinander und verblindet durchführen, identifizieren Sie Diskrepanzen zwischen den Gutachtern und erzielen Sie für jede Diskrepanz einen gemeinsamen Konsens.
      HINWEIS: Wir haben diese manuelle Frame-by-Frame-Analyse von glottischen Verschlusszeitpunkten (d. h. während der Atemwegsschutzreflexe) zuvor mit kommerzieller Videobearbeitungssoftware bei Nagetieren und Menschen durchgeführt¹⁴. Dieser Ansatz ist jedoch ineffizient und ermöglicht nur eine begrenzte Quantifizierung der Kehlkopfbewegungsdynamik. Wir verwenden derzeit eine hauseigene Kehlkopf-Tracking-Software, um eine umfassendere objektive Quantifizierung der Kehlkopfbewegung während der Atmung und der Atemwegsschutzreflexe^{durchzuführen} 22,25,26,27,28,29,30. Die Software verfügt über eine automatisierte Frame-by-Frame-Tracking-Funktion zur objektiven Quantifizierung der links- und rechtsseitigen Kehlkopfbewegung, des Abstands (Amplitude) und des Timings (Frequenz). Wir verwenden diese Parameter, um eine Vielzahl von bewegungsbasierten Messungen abzuleiten, um Kehlkopfdysfunktionen (z. B. Glottalwinkel Maximum/Minimum/Bereich, Kehlkopfbewegungssymmetrie und Synchronität) während der Atmung, des Schluckens und anderer Atemwegsschutzreflexe (z. B. Kehlkopfadduktorenreflex) zu erkennen/quantifizieren. Diese Software befindet sich noch in der Verfeinerung und ist noch nicht kommerziell/öffentlich verfügbar.

Die erfolgreiche Anwendung dieses murinen Laryngoskopieprotokolls führt zu einer Nahsichtbarkeit des Kehlkopfes während der Spontanatmung und einem evozierten Schlucken unter gesunden und Krankheitsbedingungen, wie in Abbildung 6 gezeigt. Darüber hinaus kann dieses Protokoll mehrmals an denselben Nagetieren wiederholt werden, um die Kehlkopffunktion/-dysfunktion im Laufe der Zeit untersuchen zu können. Wie in Abbildung 7 gez...

Wir haben erfolgreich ein replizierbares murinspezifisches Laryngoskopieprotokoll entwickelt, das eine Nahaufnahme der Kehlkopfbewegung beim Atmen und Schlucken ermöglicht. Wichtig ist, dass das Protokoll im Laufe der Zeit an denselben Tieren durchgeführt werden kann, um die Auswirkungen verschiedener pathologischer Zustände speziell auf die Kehlkopffunktion zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde in den letzten zehn Jahren entwickelt und im Laufe der Zeit erheblich modifiziert und Feh...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Diese Arbeit wurde teilweise durch zwei NIH-Zuschüsse finanziert: 1) ein Multi-PI (TL und NN) R01 Stipendium (HL153612) des National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) und 2) ein R03-Stipendium (TL, DC0110895) des National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD). Die Entwicklung unserer kundenspezifischen Kehlkopfbewegungsverfolgungssoftware wurde teilweise durch einen Zuschuss der Coulter Foundation (TL & Filiz Bunyak) finanziert. Wir danken Kate Osman, Chloe Baker, Kennedy Hoelscher und Zola Stephenson für die hervorragende Pflege unserer Labornagetiere. Wir danken auch Roderic Schlotzhauer und Cheston Callais von der MU Physics Machine Shop für ihr Design, ihren Beitrag und die Herstellung unserer kundenspezifischen Endoskopie-Plattform sowie für strategische Modifikationen an kommerziellen Endoskopen und Mikromanipulatoren, um unseren Forschungsanforderungen gerecht zu werden. Unsere maßgeschneiderte Software zur Verfolgung von Kehlkopfbewegungen wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Filiz Bunyak und Dr. Ali Hamad (MU Electrical Engineering and Computer Science Department) entwickelt. Wir danken auch Jim Marnatti von Karl Storz Endoscopy für die Beratung bei der Auswahl des Otoskops. Abschließend möchten wir zahlreichen ehemaligen Studenten/Auszubildenden im Lever Lab danken, deren Beiträge die Entwicklung unseres aktuellen murinen Laryngoskopie-Protokolls beeinflusst haben: Marlena Szewczyk, Cameron Hinkel, Abigail Rovnak, Bridget Hopewell, Leslie Shock, Ian Deninger, Chandler Haxton, Murphy Mastin und Daniel Shu.