Laryngoscopie murine mini-invasive pour l’imagerie en gros plan du mouvement du larynx pendant la respiration et la déglutition

Ce protocole décrit une approche de laryngoscopie transorale en série pour les souris et les rats qui permet une imagerie vidéo en gros plan et sans obstruction du larynx pendant la respiration et la déglutition à l’aide d’un régime anesthésique optimisé et de techniques de manipulation endoscopique finement ajustées.

Le larynx est un organe essentiel chez les mammifères avec trois fonctions principales : respirer, avaler et vocaliser. Un large éventail de troubles sont connus pour altérer la fonction laryngée, ce qui entraîne des difficultés respiratoires (dyspnée), des troubles de la déglutition (dysphagie) et/ou des troubles de la voix (dysphonie). La dysphagie, en particulier, peut entraîner une pneumonie par aspiration et la morbidité associée, des hospitalisations récurrentes et une mortalité précoce. Malgré ces graves conséquences, les traitements existants pour la dysfonction laryngée visent en grande partie des interventions chirurgicales et comportementales qui, malheureusement, ne rétablissent généralement pas la fonction laryngée normale, soulignant ainsi le besoin urgent de solutions innovantes.

Pour combler cette lacune, nous avons développé une approche endoscopique expérimentale pour étudier la dysfonction laryngée chez des modèles murins (c’est-à-dire souris et rats). Cependant, l’endoscopie chez les rongeurs est assez difficile en raison de leur petite taille par rapport à la technologie actuelle des endoscopes, des différences anatomiques dans les voies respiratoires supérieures et de la nécessité pour l’anesthésie d’accéder de manière optimale au larynx. Ici, nous décrivons une nouvelle approche de laryngoscopie transorale qui permet une imagerie vidéo en gros plan et sans obstruction du mouvement du larynx chez les souris et les rats. Les étapes critiques du protocole comprennent une prise en charge précise de l’anesthésie (pour éviter un surdosage qui abolit la déglutition et/ou risque de mortalité liée à la détresse respiratoire) et le contrôle de l’endoscope par un micromanipulateur (pour un enregistrement vidéo stable du mouvement du larynx par un seul chercheur pour une quantification ultérieure).

Il est important de noter que le protocole peut être réalisé au fil du temps chez les mêmes animaux pour étudier l’impact de diverses conditions pathologiques spécifiquement sur la fonction laryngée. Un nouvel avantage de ce protocole est la possibilité de visualiser la protection des voies respiratoires pendant la déglutition, ce qui n’est pas possible chez l’homme en raison de l’inversion épiglottique sur l’entrée laryngée qui obstrue la glotte. Les rongeurs offrent donc une occasion unique d’étudier spécifiquement les mécanismes de la protection des voies respiratoires laryngées normales par rapport à la protection pathologique des voies respiratoires dans le but ultime de découvrir des traitements permettant de restaurer efficacement la fonction laryngée normale.

Le larynx est un organe cartilagineux situé à l’intersection des voies respiratoires et digestives de la gorge, où il fonctionne comme un mécanisme de soupape pour contrôler avec précision le flux et la direction de l’air (c’est-à-dire pendant la respiration et la vocalisation) par rapport aux aliments et aux liquides (c’est-à-dire pendant la déglutition). On sait qu’un large éventail de troubles affectent le larynx, notamment congénitaux (p. ex., laryngomalacie, sténose sous-glottique), néoplasiques (p. ex., papillomatose laryngée, carcinome épidermoïde), neurologiques (p. ex., paralysie laryngée idiopathique, accident vasculaire cérébral, maladie de Parkinson, sclérose latérale amyotrophique) et iatrogènes (p. ex., blessure accidentelle lors d’une chirurgie de la tête ou du cou). Quelle que soit l’étiologie, le dysfonctionnement laryngé entraîne généralement une triade de symptômes de dyspnée (difficulté à respirer), de dysphonie (trouble de la voix) et de dysphagie (troubles de la déglutition) qui ont un impact négatif sur le bien-être économique et social d’une personne1,2,3,4.

De plus, la dysphagie, en particulier chez les personnes médicalement fragiles, peut entraîner une pneumonie par aspiration (due à la fuite d’aliments ou de liquides par un larynx incomplètement fermé dans les poumons) et à la morbidité associée, à des hospitalisations récurrentes et à une mortalité précoce ^5,6. Malgré ces conséquences graves, les traitements existants pour la dysfonction laryngée visent en grande partie des interventions chirurgicales et comportementales qui ne restaurent généralement pas la fonction laryngée normale 1,2,7,8,9,10, soulignant ainsi le besoin urgent de solutions innovantes. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une approche endoscopique expérimentale pour étudier le dysfonctionnement laryngé chez des modèles murins (c’est-à-dire souris et rats).

En médecine humaine, l’étalon-or pour l’évaluation de la dysfonction laryngée est la visualisation endoscopique, appelée laryngoscopie^11,12. En règle générale, un endoscope flexible est inséré dans le nez pour examiner le larynx, en particulier les cordes vocales et les structures laryngées supraglottiques et sous-glottiques adjacentes. Un endoscope rigide peut également être utilisé pour visualiser le larynx via la cavité buccale. L’une ou l’autre approche permet un examen macroscopique de l’anatomie laryngée et peut être utilisée pour évaluer la mobilité et la fonction laryngées pendant la respiration, la phonation et une variété de réflexes de protection des voies respiratoires tels que la toux et le réflexe des adducteurs laryngés 13,14,15,16. Pendant la déglutition, cependant, le larynx est complètement obscurci par l’épiglotte car il s’inverse pour couvrir l’entrée du larynx, le protégeant ainsi du chemin du bolus alimentaire/liquide avalé. Par conséquent, la visualisation directe du mouvement du larynx pendant la déglutition n’est pas possible chez l’homme et doit donc être indirectement déduite à l’aide d’autres approches diagnostiques (p. ex., fluoroscopie, électromyographie, électroglottographie).

Cet article décrit un protocole innovant de laryngoscopie pour les souris et les rats qui permet une imagerie rapprochée et sans obstruction de la respiration et de la protection des voies respiratoires lors de la déglutition sous anesthésie légère. Le protocole est compatible avec une variété de systèmes d’endoscopie disponibles dans le commerce en combinaison avec une plate-forme personnalisée pour immobiliser le rongeur anesthésié tout au long de la procédure. Il est important de noter que de nombreuses conceptions/configurations de plateformes d’endoscopie sont en effet possibles, en fonction des ressources disponibles et du programme de recherche de chaque laboratoire. Notre intention ici est de fournir des conseils aux chercheurs à prendre en compte dans le contexte de leurs recherches. De plus, nous visons à démontrer comment ce protocole de laryngoscopie peut conduire à une multitude de données objectives qui pourraient susciter de nouvelles perspectives dans notre compréhension du dysfonctionnement et de la régénération du larynx.

L’effet combiné de toutes les étapes décrites dans ce protocole de laryngoscopie murine permet d’obtenir un examen peu invasif du larynx murin adulte qui peut être répété chez les mêmes animaux afin de détecter et de caractériser le dysfonctionnement laryngé au fil du temps en réponse à une lésion iatrogène, à la progression de la maladie et/ou à une intervention de traitement relative à la protection des voies respiratoires. Il convient de noter que ce protocole n’évalue pas la fonction laryngée liée à la vocalisation.

Le protocole de laryngoscopie murine suit un protocole approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et les directives des National Institutes of Health (NIH). Il a été conçu pour être utilisé avec plus de 100 souris C57BL/6J adultes et plus de 50 rats Sprague Dawley adultes, de sexes à peu près égaux et âgés de 6 semaines à 12 mois pour les deux espèces. L’élaboration d’un protocole supplémentaire est nécessaire pour s’adapter aux rongeurs plus jeunes ou plus petits. Les animaux ont été logés en groupe (jusqu’à quatre souris ou deux rats par cage, en fonction du sexe et de la portée). Les conditions standard du vivarium comprenaient des cages statiques avec une régulation stricte de la température ambiante (20-26 °C), de l’humidité (30 %-70 %) et un cycle d’éclairage standard de 12 h. Tous les animaux ont reçu des matériaux d’enrichissement frais (p. ex., cabane/tuyau, friandises dentaires, nid) lors du changement hebdomadaire de la cage. Un accès illimité à la nourriture et à l’eau a été fourni, sauf pendant une courte restriction alimentaire (jusqu’à 4 à 6 heures) avant l’anesthésie, comme décrit ci-dessous. Le personnel vétérinaire et de recherche suivait les animaux tous les jours.

1. Une anesthésie animale qui n’abolit pas l’ingestion

1. Portez un équipement de protection individuelle approprié (p. ex. gants, masque) pour minimiser l’exposition aux allergènes lorsque vous travaillez avec des rongeurs.
2. Limitez la nourriture de chaque cage de rongeurs jusqu’à 4 à 6 heures avant l’anesthésie pour minimiser la rétention de nourriture dans la cavité buccale et le pharynx, ce qui peut interférer avec la visualisation endoscopique et/ou entraîner une aspiration de nourriture pendant la procédure.
   REMARQUE : La rétention de nourriture dans la cavité buccale est un résultat normal chez les rongeurs sans dysphagie s’ils n’ont pas été restreints par la nourriture.
3. Préparez une « station de réchauffement » pour l’induction/récupération des animaux.
   1. Préchauffez un coussin chauffant à circulation d’eau à 37 °C sur une surface de paillasse.
   2. Choisir des cages d’induction ou de récupération de taille appropriée pour l’espèce testée. Par exemple, les cages de boîtes à chaussures pour souris avec couvercles supérieurs filtrants sont de taille appropriée pour l’induction et la récupération des souris et des rats. Utiliser une nouvelle cage d’induction/récupération pour chaque animal testé ; Utilisez une seule cage comme cage d’induction et de récupération pour le même animal.
   3. Tapisser le sol de la cage d’induction/récupération d’une légère couche de matériau absorbant (p. ex., copeaux de tremble, essuie-tout, coussin pour chiot) pour la chaleur et l’absorption des sécrétions corporelles pendant l’induction et la récupération de l’anesthésie.
   4. Placez les cages préparées (avec les couvercles supérieurs du filtre) entièrement sur le coussin chauffant pendant 30 à 60 minutes avant l’induction de l’anesthésie.
      REMARQUE : Ce microenvironnement fournit suffisamment de chaleur supplémentaire pour favoriser un métabolisme stable de l’anesthésie pendant l’induction et la récupération.
4. Placez la cage de l’animal à mi-chemin sur le coussin chauffant préchauffé à 37 °C pendant environ 30 minutes avant l’induction de l’anesthésie.
   REMARQUE : Fournir une chaleur supplémentaire avant l’intervention peut accélérer l’induction de l’anesthésie et prévenir une surdose accidentelle due à un métabolisme de l’anesthésie ralenti/retardé dû à l’hypothermie.
5. Préparez l’anesthésie à la kétamine-xylazine (KX) en fonction de l’espèce et du poids corporel.
   1. Pour les souris : Un mélange de 90 mg/kg de kétamine et de 11 mg/kg de xylazine est suffisant pour la laryngoscopie transorale chez les souris de fond adultes C57BL/6 des deux sexes. Ajustez les doses pour d’autres souches de souris et âges.
   2. Pour les rats : Un mélange de 60 mg/kg de kétamine et de 6 mg/kg de xylazine est suffisant pour la laryngoscopie transorale chez les rats Sprague Dawley adultes des deux sexes. Ajustez les doses pour d’autres souches et âges de rats.
6. Préchauffez les agents anesthésiques remplis de seringue sur la station de réchauffement à 37 °C pour éviter les pertes de chaleur chez les animaux qui se produisent lors de l’injection de fluides froids.
7. Injectez au rongeur la dose calculée de KX à l’aide d’une seringue (p. ex., 1 mL) et d’une aiguille (p. ex., 26 G1/2).
   1. Pour les souris : Administrer une seule injection sous-cutanée (SC).
      REMARQUE : D’après notre expérience, les injections SC chez la souris réduisent/abolissent la mortalité liée à l’anesthésie par rapport aux injections intrapéritonéales (IP).
   2. Pour les rats : Administrer une seule injection SC ou IP. Si vous le préférez, endormir les rats avec de l’isoflurane (ISO) (3-5 %) dans une chambre d’induction immédiatement avant l’injection de KX.
      REMARQUE : Les mouvements spontanés du corps peuvent reprendre pendant une brève période (généralement <1 min) jusqu’à ce que le KX fasse effet.
8. Administrer du glycopyrrolate (agent anticholinergique) immédiatement après l’injection de KX pour réduire les sécrétions salivaires excessives qui peuvent entraver la visualisation du larynx pendant l’endoscopie transorale et/ou obstruer mécaniquement les voies respiratoires supérieures pendant la récupération de l’anesthésie.
   REMARQUE : La posologie et la voie d’administration sont identiques pour les souris et les rats (0,01-0,02 mg / kg SC), et l’effet est presque immédiat et dure plusieurs heures.
9. Après l’injection de glycopyrrolate, placez le rongeur anesthésié dans la cage d’induction préchauffée de la station de réchauffement et couvrez la cage avec un champ chirurgical pour fournir un environnement sombre qui minimise la stimulation visuelle pendant 10 min, sans être dérangé.
   1. Mettre fin à la procédure si le rongeur reste ambulatoire 10 min après la dose initiale de KX.
      REMARQUE : Les tentatives d’administration d’une anesthésie supplémentaire (KX ou maintien à la kétamine) seront probablement futiles.
10. Après 10 min, administrer une dose d’entretien de kétamine (1/4 de la dose initiale si les réflexes des membres postérieurs sont diminués ou 1/2 de la dose initiale si les réflexes des membres postérieurs sont vifs ; SC pour les souris et SC/IP pour les rats) pour maintenir l’anesthésie.
11. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée et les traumatismes associés pendant la procédure de laryngoscopie.
12. Transférez le rongeur anesthésié vers une plateforme d’endoscopie personnalisée pour commencer la procédure de laryngoscopie.
    REMARQUE : Nous avons conçu notre plateforme d’endoscopie (Figure 1) de manière à ce qu’elle dispose de plusieurs fonctionnalités pour une utilisation avec une variété d’approches chirurgicales et électrophysiologiques chez les rongeurs qui ne nécessitent pas nécessairement d’endoscopie. En tant que tel, il est surconstruit pour une utilisation purement endoscopique. Le cas échéant, nous mettrons en évidence les caractéristiques/composants essentiels à ce protocole de laryngoscopie.
13. À partir de ce moment, vérifiez les réflexes des membres postérieurs toutes les 15 à 20 minutes tout au long de la procédure et fournissez des doses d’entretien supplémentaires de kétamine si nécessaire, espacées d’au moins 20 minutes. Comme il s’agit d’une procédure relativement courte (généralement <45 minutes sous anesthésie), un supplément de kétamine est rarement nécessaire après la dose d’entretien initiale.

2. Passage transoral de l’endoscope pour visualiser le larynx

1. Avant d’anesthésier l’animal, préparez un endoscope de taille appropriée avec capacité d’enregistrement vidéo.
   REMARQUE : Nous utilisons régulièrement un otoscope à zéro degré avec un diamètre de tige de 1,9 mm et une longueur de tige de 10 cm avec une gaine métallique personnalisée (figure 2), qui est l’endoscope représentatif utilisé tout au long de ce protocole.
   1. Connectez l’endoscope à une source lumineuse et à un système d’enregistrement endoscopique pour une visualisation en temps réel et un enregistrement vidéo à un minimum de 30 images par seconde (ips).
   2. Faites la mise au point et la balance des blancs de l’appareil photo pour une qualité d’image optimale.
   3. Fixez l’endoscope à un micromanipulateur.
      REMARQUE : Pour le suivi du mouvement laryngé, nous fixons l’endoscope à un micromanipulateur sur la plate-forme d’endoscopie afin de permettre un contrôle précis de l’endoscope pour une capture vidéo stable.
2. Fixez le rongeur en position dorsale sur une plate-forme chauffée. Stabilisez et immobilisez la tête en la fixant avec des barres d’oreille.
   1. Assurez-vous que la tête du rongeur peut pivoter librement vers le haut ou vers le bas (mais pas d’un côté à l’autre) dans les barres d’oreille sans glisser. Ce degré de liberté facilite l’insertion transorale et l’avancement de l’endoscope pour atteindre le larynx.
3. Si l’enregistrement électrophysiologique synchrone de la respiration, de la déglutition et de la coordination déglutition-respiration est souhaité pendant l’endoscopie, procéder à l’application de capteurs appropriés à cet effet (Figure 3).
   1. Fixez un capteur respiratoire à l’abdomen sur la ligne médiane, immédiatement caudale à l’apophyse xyphoïde, à l’aide de ruban chirurgical.
   2. Rasez-vous et nettoyez/désinfectez la peau avec une lingette imbibée d’alcool avant d’insérer les électrodes de l’aiguille pour prévenir l’infection.
   3. Utilisez une aiguille de 22 G pour percer une petite ouverture à travers la peau avant d’insérer l’électrode de l’aiguille pour éviter d’endommager l’aiguille d’électromyographie (EMG).
   4. Insérez une électrode d’aiguille EMG concentrique stérile (par exemple, 25 mm x 0,3 mm/30 G) à travers la peau sous-mentonnière à la ligne médiane jusqu’à la base de la langue (par exemple, le muscle génioglosse ou géniohyoïde, selon la profondeur d’insertion de l’aiguille).
   5. Insérez une électrode de terre (par exemple, en acier inoxydable 27 G) par voie sous-cutanée au niveau de la hanche (de chaque côté).
   6. Connectez le capteur respiratoire et les électrodes de l’aiguille EMG à un système d’enregistrement électrophysiologique (par exemple, un bioamplificateur et un système d’acquisition de données avec capture vidéo synchrone) et vérifiez les signaux électrophysiologiques propres dans les deux canaux avant de continuer.
   7. Enveloppez les sites de connexion des électrodes avec une feuille d’aluminium pour les protéger contre le bruit électrique et améliorer le rapport signal/bruit dans les enregistrements électrophysiologiques correspondants.
   8. Ajustez l’emplacement du capteur respiratoire et la profondeur de l’électrode de l’aiguille EMG au besoin pour obtenir des signaux électrophysiologiques propres dans les deux canaux. Pour suivre ce protocole, utilisez une fréquence d’échantillonnage de 1 k pour la respiration et une fréquence d’échantillonnage de 20 k et un filtre passe-bande (par exemple, 150-3 000 Hz) pour l’EMG.
4. Couvrez le torse du rongeur (et le capteur respiratoire) avec une couverture transparente pour faciliter la thermorégulation tout en permettant de visualiser les mouvements abdominaux pendant la respiration. Laissez les membres postérieurs et le bas-ventre librement exposés pour y accéder lors des contrôles réflexes et du redosage d’entretien de la kétamine. Assurez-vous que la couverture ne limite pas les mouvements abdominaux pendant la respiration.
5. Procéder à l’endoscopie transorale (figure 4).
   1. Ouvrez la bouche du rongeur en insérant un applicateur effilé à bout de coton derrière les incisives centrales, perpendiculairement à la mâchoire. Faites pivoter le coton-tige sur la surface dorsale de la langue pour qu’il dépasse légèrement de la bouche.
6. À l’aide d’une légère prise du doigt, tirez doucement la langue vers l’extérieur de la bouche vers un côté des incisives centrales tout en insérant l’extrémité de l’endoscope dans la cavité buccale (figures 4A, B).
   1. Allumez la source lumineuse après avoir inséré l’embout de l’endoscope dans la bouche pour éviter d’endommager les yeux du rongeur.
   2. Insérez l’endoscope latéralement aux incisives du même côté que la langue rétractée. Les incisives centrales empêchent l’insertion de l’endoscope sur la ligne médiane, ce qui nécessite cette approche d’insertion latérale.
7. Démarrez les systèmes d’enregistrement d’endoscopie (et d’électrophysiologie). Enregistrez en continu tout au long de la procédure afin de garantir des données suffisantes pour l’analyse a posteriori ou enregistrez à certains moments, en fonction des besoins de l’étude.
8. Avancez soigneusement l’endoscope pour visualiser l’oropharynx, en prenant soin de ne pas gratter le palais dur ou d’appliquer une pression excessive sur la langue qui pourrait causer des blessures.
   1. Retirez toutes les particules alimentaires visibles et/ou les sécrétions salivaires en excès à l’aide d’un écouvillon de taille appropriée (p. ex., une microbrosse de 1,5 mm) afin de minimiser le risque d’aspiration au fur et à mesure que la procédure progresse.
   2. Continuez à avancer/ajuster la position de l’endoscope jusqu’à ce que l’hypopharynx soit centré dans le champ de vision du moniteur et que les structures anatomiques clés soient identifiables (Figure 4C). À ce stade, toutes les structures doivent apparaître anatomiquement alignées/symétriques dans le champ de vision de la caméra ; Sinon, repositionnez l’endoscope au besoin.
   3. Surveillez le mouvement évoqué de la mâchoire et de la langue pendant l’avancement de l’endoscope. En l’absence de kétamine, procéder sans autre redosage de kétamine. Le cas échéant, administrer une deuxième dose d’entretien de kétamine (1/4 à 1/2 de la dose initiale de kétamine) et attendre environ 5 minutes pour faire effet avant de continuer. Ne redosez que si au moins 20 minutes se sont écoulées depuis l’injection précédente pour éviter la sédation excessive et l’abolition de la déglutition.
   4. Examinez la langue du rongeur toutes les 5 minutes tout au long de la procédure pour détecter une décoloration foncée, ce qui indique une ischémie. Pour éviter cela, repositionnez l’endoscope au besoin.
9. Appliquez une légère pression sur le vélum à l’aide d’une microsonde (p. ex., une spatule métallique) insérée à côté de l’endoscope pour découpler le palais mou et l’épiglotte afin de visualiser le larynx à distance (figure 4D). Évitez d’utiliser l’embout de l’endoscope pour le découplage, car la pression appliquée peut endommager les tissus mous ou plier/endommager de façon permanente la tige de l’endoscope.
   REMARQUE : Contrairement aux humains, le larynx murin n’est pas directement visible d’un point de vue transoral. Au lieu de cela, l’épiglotte est piégée mécaniquement sous une membrane muqueuse recouvrant le vélum, ce qui entraîne la formation d’un espace hypopharyngé en cul-de-sac. L’application d’une légère pression sur le vélum libère l’épiglotte de la membrane vélaire pour donner une vue partielle du larynx.
10. Observer les hirondelles évoquées lors du découplage vélum/épiglotte.
    1. Identifiez les hirondelles comme des déplacements brusques et brefs de la langue postérieure vers le palais dur. Ce mouvement se produit généralement en synchronisation avec un bref mouvement mandibulaire/dépression, fournissant ainsi un substitut pour l’identification de la déglutition lorsque la langue postérieure n’est pas facilement visible dans le champ de vision de l’endoscope.
    2. Identifiez également les déglutitions via l’activité d’éclatement EMG de la langue en conjonction avec de brefs épisodes apnéiques dans l’enregistrement électrophysiologique, les deux se produisant en synchronisation avec des événements de fermeture glottique dans la vidéo d’endoscopie.
       1. Dans le cas d’une déglutition répétitive rapide indiquant une anesthésie insuffisante (c’est-à-dire trop légère), redosez et attendez ~5 à 10 minutes avant de continuer. Attendre au moins 20 minutes après l’injection d’entretien de kétamine précédente pour éviter la sursédation et l’abolition de la déglutition.
       2. Considérez que la profondeur de l’anesthésique est optimale lorsque seules quelques gorgées sont évoquées lors du découplage vélaire-épiglottique.
       3. Si la déglutition est abolie, l’anesthésie est trop profonde pour évaluer la protection des voies respiratoires laryngées. Dans ce cas, attendez 5 à 10 minutes pour le métabolisme de la kétamine avant de procéder à la visualisation rapprochée du larynx.

3. Enregistrement vidéo en gros plan et sans obstruction du mouvement du larynx pendant la respiration et de la déglutition évoquée

REMARQUE : L’enregistrement électrophysiologique synchrone de la respiration, de la déglutition et de la coordination avale-respiration est également une option.

1. Avancez lentement l’endoscope entre le vélum et l’épiglotte tout en maintenant le larynx au centre du champ de vision (Figure 5A-C).
   REMARQUE : La pointe de l’endoscope passera facilement à travers l’ouverture vélaire-épiglottique sans force. Sinon, interrompez la procédure pour éviter de nuire à l’animal. Il est possible de visualiser le larynx à distance, avec l’embout de l’endoscope dans l’hypopharynx. Cependant, cette approche nécessite généralement une rétraction manuelle de l’épiglotte, du vélum et/ou de la langue pour une meilleure visualisation du larynx. Cependant, des parties du larynx restent généralement cachées et les dispositifs de rétraction peuvent restreindre le mouvement du larynx, ce qui peut être confondu avec un dysfonctionnement.
2. Continuez à avancer l’endoscope pour obtenir une vue rapprochée non obstruée de l’ensemble des dimensions ventrale-dorsale et latérale du larynx dans un seul champ de vision (figure 5C).
   REMARQUE : La commissure ventrale peut être obstruée par l’épiglotte, en particulier chez les souris plus jeunes/plus petites. Dans ces cas, tenter de manipuler plus agressivement l’extrémité de l’endoscope pour visualiser la commissure ventrale peut restreindre le mouvement du larynx, ce qui peut être confondu avec un dysfonctionnement. Il peut également bloquer le flux d’air laryngé, entraînant une asphyxie.
3. Observez le mouvement oscillatoire du larynx lorsque le rongeur inspire (élargissement de la glotte) et expire (rétrécissement de la glotte) au cours de chaque cycle respiratoire.
   REMARQUE : La vitesse et l’amplitude du mouvement laryngé/glottal peuvent varier avec la profondeur de l’anesthésique ; Cependant, un espace glottal (c’est-à-dire un espace d’air entre les aryténoïdes gauche/droit et les cordes vocales) reste généralement visible tout au long du cycle respiratoire chez les rongeurs sains.
   1. Si un rétrécissement glottique marqué est noté, ajustez la position de l’endoscope pour assurer un flux d’air non obstrué dans les voies respiratoires supérieures. Par exemple, évitez d’appliquer une pression sur le vélum, ce qui peut provoquer une obstruction des tissus mous des voies respiratoires nasales. Évitez également d’insérer l’embout de l’endoscope dans l’espace glottal, ce qui peut bloquer le flux d’air laryngé et entraîner une asphyxie. Si, dans de rares cas, la respiration cesse, effectuez plusieurs compressions thoraciques médio-sternales (à l’aide d’un doigt) ou une ventilation en pression positive (à l’aide d’un « sac de réanimation » miniature) après avoir retiré l’endoscope.
4. Enregistrement vidéo du mouvement respiratoire du larynx pendant 30 à 60 s à des fins d’évaluation post-hoc.
5. Avec le larynx toujours en vue de près, ajustez légèrement l’extrémité de l’endoscope à l’intérieur de l’entrée laryngée pour appliquer une stimulation mécanique à la muqueuse recouvrant le vélum et/ou l’épiglotte, et évoquer l’ingestion chez les rongeurs anesthésiés de manière optimale.
   1. Utilisez des ajustements au micro-niveau de l’embout de l’endoscope (c’est-à-dire ~1 mm dans n’importe quelle direction) pour prévenir les lésions de la muqueuse et/ou l’obstruction des voies respiratoires.
   2. Surveillez les déglutitions évoquées, qui peuvent être facilement identifiées comme des événements de fermeture glottique abrupte survenant en synchronisation avec une dépression visible de la mâchoire, une activité d’éclatement de l’EMG de la langue et une apnée brève (<1/2 s) visible dans la trace respiratoire.
      REMARQUE : Des événements de fermeture glottique sans mouvement concomitant de la mâchoire peuvent se produire ; Cependant, la fermeture glottique est généralement incomplète dans ces cas. Nous soupçonnons qu’il peut s’agir d’autres réflexes de protection des voies respiratoires (par exemple, le réflexe des adducteurs laryngés) qui émergent lorsque l’anesthésie commence à s’estomper ; Cependant, il s’agit d’événements rares/incohérents qui nécessitent une enquête plus approfondie.
   3. Répétez l’opération jusqu’à ce que 5 à 10 hirondelles soient évoquées et que la vidéo soit enregistrée par animal. Si l’ingestion est abolie, retirez l’endoscope et attendez 5 à 10 minutes que le métabolisme de la kétamine se produise avant de continuer.
6. Rétractez soigneusement, mais ne retirez pas, l’endoscope dans l’oropharynx et centrez l’hypopharynx dans le champ de vision pour visualiser l’épiglotte et le vélum.
7. Couplez le vélum et l’épiglotte pour la reprise de la respiration nasale en utilisant un micro-écouvillon pour appliquer une légère pression contre la base de la langue afin d’évoquer la déglutition et le repiégeage de l’épiglotte sous la membrane vélaire. Si le recouplage ne se produit pas en quelques tentatives, procédez à la récupération de l’anesthésie sans recouplage pour éviter de risquer une lésion laryngée.
8. Arrêtez l’enregistrement de l’endoscopie (et de l’électrophysiologie).
9. Utilisez un coton-tige imbibé de sérum physiologique pour humidifier la langue et les incisives centrales et remettez la langue dans sa position anatomique dans la cavité buccale.
10. Détachez les barres auriculaires et retirez la sonde de température, le capteur respiratoire et les électrodes EMG du rongeur pour procéder à la récupération de l’anesthésie.

4. Récupération de l’anesthésie

1. Placez l’animal dans une cage de récupération préchauffée (c’est-à-dire la même que la cage d’induction) sur la « station de réchauffement » pour récupérer de l’anesthésie.
2. Réappliquez du lubrifiant pour les yeux pour éviter le dessèchement.
3. Administrer une solution saline SC réchauffée pour l’hydratation des fluides : jusqu’à 5 mL pour les rats et jusqu’à 0,5 mL pour les souris.
4. Administrer l’atipamézole SC pour l’inversion de la xylazine et pour augmenter la force respiratoire : 1-2 mg/kg pour les rats et les souris.
   1. Commencez par 2 mg/kg d’atipamezole, immédiatement suivi d’une stimulation manuelle le long du dos et de l’estomac du rongeur pour accélérer la récupération.
      REMARQUE : En utilisant cette approche, le mouvement spontané de la tête commence généralement en 1 à 3 minutes. Cependant, le retour à l’état ambulatoire prend généralement en moyenne 2 h (allant de 1 h à 5 h) après une laryngoscopie sous anesthésie KX, en raison des différences individuelles.
   2. Fournir de l’atipamézole supplémentaire dosé à 1 mg/kg (au moins 15 min après la première injection) si les mouvements spontanés du corps diminuent au lieu d’augmenter dans les 15 à 30 premières minutes de récupération de l’anesthésie, malgré une stimulation manuelle fréquente.
   3. Procéder à l’administration de doxapram (5 mg/kg IP pour les rats et les souris) si l’activité spontanée continue de diminuer. Administrez à nouveau cet agent de « sauvetage d’urgence » à des intervalles de 10 à 15 minutes (jusqu’à cinq doses) jusqu’à ce qu’un mouvement spontané apparaisse. Si les rongeurs restent moribonds, euthanasier les animaux à l’aide de méthodes d’euthanasie approuvées (p. ex., une surdose de kétamine suivie d’une méthode secondaire comme la décapitation).
5. Surveillez de près les rongeurs en convalescence à des intervalles de 15 à 20 minutes pour détecter les changements indésirables dans l’état respiratoire, la mobilité et la thermorégulation et intervenez au besoin (p. ex., stimulation manuelle, oxygène supplémentaire, couverture thermique, atipamezole ou injections de doxapram). Assurer une surveillance plus fréquente des rongeurs nécessitant une intervention.
   1. Fournir de l’oxygène supplémentaire (p. ex., 1 à 2 L/min dans une chambre d’induction chauffée, sans ISO) à des intervalles de 10 minutes, au besoin pour les rongeurs dont le temps de récupération de l’anesthésie KX est prolongé. Alternativement, appliquez une stimulation fréquente le long des surfaces dorsale et ventrale de l’animal pour normaliser les niveaux de SpO₂ (>94 %).
   2. Placez les compagnons de la cage de récupération dans la même cage de récupération (jusqu’à deux rongeurs par cage) pour favoriser une activité spontanée accrue et une récupération plus rapide.
6. Remettez les rongeurs dans leur cage domestique chauffée lorsqu’ils sont capables de se déplacer spontanément dans la cage de récupération.
   1. Remettez la nourriture standard et la bouteille d’eau dans la cage de la maison. Ne fournissez pas d’aménagements spéciaux pour l’accès à la nourriture ou à l’eau pendant que l’anesthésie s’estompe encore afin de minimiser le risque d’étouffement ou d’aspiration.
   2. Observez l’activité de la cage domestique et enlevez tous les obstacles qui entravent la marche (p. ex., cabane, tuyau en PVC).
   3. Placez la cage domestique à moitié sur la station de réchaud, à moitié hors de la station de réchauffement pendant les 12 à 16 prochaines heures (c’est-à-dire toute la nuit).
      REMARQUE : L’arrêt plus précoce de la chaleur supplémentaire peut entraîner la mortalité par hypothermie.
7. Effectuez des vérifications de l’état standard le lendemain matin. Ramener les animaux dont l’activité normale ou de base reprend, les fonctions corporelles (p. ex., thermorégulation, manger, boire, uriner, déféquer) et le poids stable (c.-à-d. maintenir ou augmenter) aux conditions normales du vivarium avec une surveillance quotidienne régulière de la santé. Dans les rares cas où les rongeurs ont une diminution de l’activité, des fonctions corporelles ou du poids corporel, continuez la chaleur supplémentaire pendant un autre jour.
   REMARQUE : Pour les rats, il est courant que la coloration à la porphyrine apparaisse soudainement autour des deux yeux ~3 à 6 h après le début de la période de récupération de l’anesthésie. La coloration disparaît généralement dans les 24 heures.

5. Quantification objective du mouvement du larynx pendant la respiration par rapport à la déglutition

1. Utilisez un logiciel de montage vidéo doté d’une fonction d’analyse image par image pour visionner les vidéos d’endoscopie.
   1. Identifier au moins un épisode représentatif de respiration spontanée de 10 à 20 secondes par animal.
   2. Identifiez 3 à 5 événements d’hirondelle représentatifs par animal.
   3. S’assurer que les épisodes/événements de respiration et de déglutition sélectionnés répondent aux critères d’analyse suivants : le larynx centré dans le champ de vision de la caméra avec toutes les structures/bords du larynx visibles (c’est-à-dire non masqués par le vélum, l’épiglottis ou les sécrétions salivaires en excès), un éclairage suffisant (c’est-à-dire capable de voir toutes les structures/limites du larynx) et sans artefact de mouvement de la caméra (c’est-à-dire que l’endoscope ne bouge pas).
2. Analyser les épisodes/événements de respiration et de déglutition identifiés à l’aide d’approches subjectives et/ou objectives.
   1. Pour une analyse subjective : utilisez une échelle de Likert pour évaluer subjectivement le mouvement du larynx pendant la visualisation en temps réel et image par image à l’aide d’un logiciel de montage vidéo. Pour suivre ce protocole, utilisez une échelle de Likert étendue allant de -2 à +2, où les valeurs négatives indiquent un mouvement du larynx dans la direction opposée à celle attendue. Estimer la protection des voies respiratoires laryngées pendant la déglutition, où 0 = aucune réduction de la taille de l’espace glottal (c’est-à-dire aucune protection des voies respiratoires laryngées), 1 = une certaine réduction de l’espace glottal (c’est-à-dire une protection incomplète des voies respiratoires) et 2 = adduction complète des aryténoïdes, avec seulement un petit espace glottal ventral entre les cordes vocales (c’est-à-dire une protection complète des voies respiratoires), les valeurs négatives indiquant un mouvement paradoxal du larynx.
      REMARQUE : Une échelle de Likert allant de 0 à 2 est couramment utilisée dans les études sur les rongeurs, où 0 = aucun mouvement, 1 = un certain mouvement et 2 = mouvement normal 17,18,19,20,21,22. Cependant, cette échelle ne prend pas en compte le mouvement paradoxal du larynx qui se produit souvent à la suite d’une lésion récurrente du nerf laryngé (RLN)¹⁰.
   2. Pour une analyse objective : Identifiez quatre images vidéo clés - 1) l’image de repos précédant directement le début de l’adduction laryngée (c’est-à-dire l’image avant l’adduction des cordes vocales), 2) l’image dans laquelle les cordes vocales ont terminé l’adduction, 3) l’image précédant immédiatement l’abduction des cordes vocales (cela peut chevaucher #2), et 4) l’image où les cordes vocales ont complètement abducté et sont ramenées à une position de repos pour reprendre la respiration. Utilisez l’horodatage de ces quatre images clés pour calculer la durée de l’adduction des cordes vocales (de l’image 1 à l’image 2), de la fermeture glottique (de l’image 2 à l’image 3), de l’abduction des cordes vocales (de l’image 3 à l’image 4) et de la durée totale de la déglutition (de l’image 1 à l’image 4). Alternativement, utilisez d’autres logiciels commerciaux^{existants 23} pour mesurer l’angle glottal (c’est-à-dire entre les aryténoïdes dorsalement ou les cordes vocales ventralement) pendant l’abduction maximale et l’adduction maximale à l’aide d’images fixes 17,18,24. Demandez à au moins deux examinateurs formés d’effectuer ce processus de manière indépendante et à l’aveugle, de repérer les écarts entre les examinateurs et de parvenir à un consensus conjoint pour chaque écart.
      REMARQUE : Nous avons précédemment effectué cette analyse manuelle image par image des événements de synchronisation de la fermeture glottique (c’est-à-dire pendant les réflexes de protection des voies respiratoires) à l’aide d’un logiciel de montage vidéo commercial chez les rongeurs et les humains¹⁴. Cependant, cette approche est inefficace et ne fournit qu’une quantification limitée de la dynamique du mouvement laryngé. Nous utilisons actuellement un logiciel de suivi du larynx construit en interne pour effectuer une quantification objective plus poussée du mouvement du larynx pendant la respiration et les réflexes de protection des voies respiratoires 22,25,26,27,28,29,30. Le logiciel dispose d’une capacité de suivi automatisé image par image pour la quantification objective de la distance (amplitude) et du moment (fréquence) du mouvement du larynx gauche ou droit. Nous utilisons ces paramètres pour dériver une variété de mesures basées sur le mouvement afin de détecter/quantifier le dysfonctionnement laryngé (par exemple, l’angle glottal maximum/minimum/amplitude métrique, la symétrie du mouvement laryngé et la synchronie) pendant la respiration, la déglutition et d’autres réflexes de protection des voies respiratoires (par exemple, le réflexe d’adducteur laryngé). Ce logiciel est encore en cours de perfectionnement et n’est pas encore disponible dans le commerce/public.

L’utilisation réussie de ce protocole de laryngoscopie murine permet de visualiser en gros plan le larynx pendant la respiration spontanée et d’évoquer la déglutition dans des conditions saines et pathologiques, comme le montre la figure 6. De plus, ce protocole peut être répété plusieurs fois chez les mêmes rongeurs pour permettre l’investigation de la fonction ou du dysfonctionnement du larynx au fil du temps. Comme le montre

Nous avons réussi à développer un protocole de laryngoscopie reproductible spécifique à la souris qui permet de visualiser en gros plan le mouvement du larynx pendant la respiration et la déglutition. Il est important de noter que le protocole peut être réalisé au fil du temps chez les mêmes animaux pour étudier l’impact de diverses conditions pathologiques spécifiquement sur la fonction laryngée. Ce protocole a été développé au cours de la dernière décennie et a fai...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Ce travail a été financé en partie par deux subventions des NIH : 1) une subvention R01 (HL153612) multi-PI (TL et NN) du National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), et 2) une subvention R03 (TL, DC0110895) du National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD). Le développement de notre logiciel personnalisé de suivi du mouvement du larynx a été partiellement financé par une subvention de la Fondation Coulter (TL & Filiz Bunyak). Nous remercions Kate Osman, Chloe Baker, Kennedy Hoelscher et Zola Stephenson d’avoir fourni d’excellents soins à nos rongeurs de laboratoire. Nous remercions également Roderic Schlotzhauer et Cheston Callais de l’atelier d’usinage de physique de MU pour leur contribution à la conception et à la fabrication de notre plateforme d’endoscopie personnalisée et les modifications stratégiques apportées aux endoscopes et micromanipulateurs commerciaux afin de répondre à nos besoins en matière de recherche. Notre logiciel personnalisé de suivi du mouvement du larynx a été développé en collaboration avec le Dr Filiz Bunyak et le Dr Ali Hamad (Département de génie électrique et d’informatique de l’Université du Missouri). Nous remercions également Jim Marnatti de Karl Storz Endoscopy pour ses conseils sur le choix de l’otoscope. Enfin, nous tenons à souligner les nombreux anciens étudiants/stagiaires du Lever Lab dont les contributions ont éclairé le développement de notre protocole actuel de laryngoscopie murine : Marlena Szewczyk, Cameron Hinkel, Abigail Rovnak, Bridget Hopewell, Leslie Shock, Ian Deninger, Chandler Haxton, Murphy Mastin et Daniel Shu.