לרינגוסקופיה זעיר פולשנית של עכברים להדמיה מקרוב של תנועת הגרון במהלך נשימה ובליעה

פרוטוקול זה מתאר גישת לרינגוסקופיה טרנס-אוראלית סדרתית לעכברים וחולדות המאפשרת הדמיית וידאו מקרוב וללא הפרעה של הגרון במהלך הנשימה והבליעה באמצעות משטר הרדמה אופטימלי וטכניקות מניפולציה אנדוסקופיות מכווננות היטב.

הגרון הוא איבר חיוני ביונקים עם שלושה תפקידים עיקריים - נשימה, בליעה וקול. ידוע כי מגוון רחב של הפרעות פוגעות בתפקוד הגרון, מה שגורם לקשיי נשימה (קוצר נשימה), ליקוי בבליעה (דיספגיה) ו/או ליקוי קול (דיספוניה). דיספגיה, במיוחד, עלולה להוביל לדלקת ריאות שאיפה ותחלואה נלווית, אשפוזים חוזרים ותמותה מוקדמת. למרות ההשלכות החמורות הללו, הטיפולים הקיימים לתפקוד לקוי של הגרון מכוונים בעיקר להתערבויות כירורגיות והתנהגותיות שלמרבה הצער אינן משחזרות בדרך כלל את תפקוד הגרון התקין, ובכך מדגישות את הצורך הדחוף בפתרונות חדשניים.

כדי לגשר על הפער הזה, פיתחנו גישה אנדוסקופית ניסיונית לחקירת תפקוד לקוי של הגרון במודלים של עכברים (כלומר, עכברים וחולדות). עם זאת, אנדוסקופיה במכרסמים היא מאתגרת למדי בשל גודלם הקטן ביחס לטכנולוגיית האנדוסקופ הנוכחית, הבדלים אנטומיים בדרכי הנשימה העליונות והצורך בהרדמה כדי לגשת בצורה אופטימלית לגרון. כאן, אנו מתארים גישה חדשה של לרינגוסקופיה טרנס-אוראלית המאפשרת הדמיית וידאו מקרוב וללא הפרעה של תנועת הגרון בעכברים וחולדות. השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים ניהול הרדמה מדויק (למניעת מנת יתר שמבטלת את הבליעה ו/או מסתכנת בתמותה הקשורה למצוקה נשימתית) ובקרת מיקרומניפולטור של האנדוסקופ (להקלטת וידאו יציבה של תנועת הגרון על ידי חוקר יחיד לכימות לאחר מכן).

חשוב לציין, ניתן לבצע את הפרוטוקול לאורך זמן באותם בעלי חיים כדי לחקור את ההשפעה של מצבים פתולוגיים שונים במיוחד על תפקוד הגרון. יתרון חדש של פרוטוקול זה הוא היכולת לדמיין הגנה על דרכי הנשימה במהלך הבליעה, דבר שאינו אפשרי בבני אדם עקב היפוך אפיגלוטי מעל כניסת הגרון החוסם את הגלוטיס מהעין. לכן מכרסמים מספקים הזדמנות ייחודית לחקור באופן ספציפי את המנגנונים של הגנה נורמלית לעומת פתולוגית על דרכי הנשימה של הגרון למטרה הסופית של גילוי טיפולים לשיקום יעיל של תפקוד גרון תקין.

הגרון הוא איבר סחוסי הממוקם בצומת דרכי הנשימה והעיכול בגרון, שם הוא מתפקד כמנגנון שסתום לשליטה מדויקת על זרימת וכיוון האוויר (כלומר, במהלך נשימה וקול) לעומת מזון ונוזל (כלומר, בזמן בליעה). ידוע על מגוון רחב של הפרעות המשפיעות על הגרון, כולל מולדות (למשל, גרון, היצרות תת-גלוטית), ניאופלסטית (למשל, פפילומטוזיס גרון, קרצינומה של תאי קשקש), נוירולוגיות (למשל, שיתוק גרון אידיופטי שבץ מוחי, מחלת פרקינסון, טרשת אמיוטרופית צידית) ויאטרוגנית (למשל, פציעה לא מכוונת במהלך ניתוח ראש או צוואר). ללא קשר לאטיולוגיה, תפקוד לקוי של הגרון גורם בדרך כלל לשלישיית תסמינים של קוצר נשימה (קשיי נשימה), דיספוניה (ליקוי קול) ודיספגיה (ליקוי בליעה) המשפיעים לרעה על הרווחה הכלכלית והחברתית של האדם 1,2,3,4.

יתר על כן, דיספגיה, במיוחד אצל אנשים שבריריים מבחינה רפואית, עלולה להוביל לדלקת ריאות שאיפה (עקב בריחת מזון או נוזל דרך גרון לא סגור לחלוטין לריאות) ותחלואה נלווית, אשפוזים חוזרים ותמותה מוקדמת ^5,6. למרות ההשלכות החמורות הללו, הטיפולים הקיימים לתפקוד לקוי של הגרון מכוונים בעיקר להתערבויות כירורגיות והתנהגותיות שבדרך כלל אינן משחזרות את תפקוד הגרון התקין 1,2,7,8,9,10, ובכך מדגישות את הצורך הדחוף בפתרונות חדשניים. לקראת מטרה זו, פיתחנו גישה אנדוסקופית ניסיונית לחקירת תפקוד לקוי של הגרון במודלים של עכברים (כלומר, עכברים וחולדות).

ברפואה האנושית, תקן הזהב להערכת תפקוד לקוי של הגרון הוא הדמיה אנדוסקופית, המכונה לרינגוסקופיה^11,12. בדרך כלל, אנדוסקופ גמיש מועבר דרך האף כדי לבחון את הגרון, במיוחד את קפלי הקול ומבני הגרון הסופרגלוטיים והתת-גלוטיים הסמוכים. ניתן להשתמש באנדוסקופ קשיח גם כדי לדמיין את הגרון דרך חלל הפה. כל אחת מהגישות מאפשרת בדיקה גסה של אנטומיה של הגרון וניתן להשתמש בה כדי להעריך את הניידות והתפקוד של הגרון במהלך נשימה, פונציה ומגוון רפלקסים המגנים על דרכי הנשימה כגון שיעול ורפלקס מקרב הגרון 13,14,15,16. במהלך הבליעה, לעומת זאת, הגרון מוסתר לחלוטין על ידי האפיגלוטיס כשהוא מתהפך כדי לכסות את הכניסה לגרון, ומגן עליו מפני נתיב בולוס המזון/נוזל הנבלע. כתוצאה מכך, הדמיה ישירה של תנועת הגרון במהלך הבליעה אינה אפשרית בבני אדם ולכן יש להסיק אותה בעקיפין באמצעות גישות אבחון אחרות (למשל, פלואורוסקופיה, אלקטרומיוגרפיה, אלקטרוגלוטוגרפיה).

מאמר זה מתאר פרוטוקול לרינגוסקופיה חדשני לעכברים וחולדות המאפשר הדמיה מקרוב וללא הפרעה של הנשימה והגנה על דרכי הנשימה במהלך בליעה בהרדמה קלה. הפרוטוקול תואם למגוון מערכות אנדוסקופיה זמינות מסחרית בשילוב עם פלטפורמה מותאמת אישית לשיתוק המכרסם המורדם לאורך כל ההליך. חשוב לציין, עיצובים/תצורות רבות של פלטפורמות אנדוסקופיה אכן אפשריים, בהתאם למשאבים הזמינים ולאג'נדה המחקרית של כל מעבדה. כוונתנו כאן היא לספק הנחיות לחוקרים לשקול בהקשר של המחקר שלהם. יתר על כן, אנו שואפים להדגים כיצד פרוטוקול לרינגוסקופיה זה יכול להוביל לשפע של נתונים אובייקטיביים שעשויים לעורר תובנות חדשות לגבי הבנתנו את תפקוד הגרון והתחדשותו.

ההשפעה המשולבת של כל השלבים המתוארים בפרוטוקול לרינגוסקופיה עכברי זה מביאה לבדיקה זעיר פולשנית של גרון העכברים הבוגר שניתן לחזור עליה באותם בעלי חיים כדי לזהות ולאפיין תפקוד לקוי של הגרון לאורך זמן בתגובה לפגיעה יאטרוגנית, התקדמות המחלה ו/או התערבות טיפולית ביחס להגנה על דרכי הנשימה. יש לציין כי פרוטוקול זה אינו מעריך את תפקוד הגרון הקשור לקול.

פרוטוקול לרינגוסקופיה של עכברים עוקב אחר פרוטוקול מאושר של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הוא פותח לשימוש עם למעלה מ-100 עכברי C57BL/6J בוגרים ולמעלה מ-50 חולדות ספראג דולי בוגרות, בערך מינים שווים ובני 6 שבועות עד 12 חודשים לשני המינים. יש צורך בפיתוח פרוטוקול נוסף להתאמה למכרסמים צעירים/קטנים יותר. בעלי החיים שוכנו בקבוצה (עד ארבעה עכברים או שתי חולדות בכלוב, בהתבסס על מין והמלטה). תנאי הוויווריום הסטנדרטיים כללו כלוב סטטי עם ויסות קפדני של טמפרטורת הסביבה (20-26 מעלות צלזיוס), לחות (30%-70%) ומחזור אור סטנדרטי של 12 שעות. כל בעלי החיים קיבלו חומרי העשרה טריים (למשל, צריף/צינור, חטיפים דנטליים, נסטלט) בהחלפת כלובים שבועית. ניתנה גישה בלתי מוגבלת למזון ולמים, למעט במהלך הגבלת מזון קצרה (עד 4-6 שעות) לפני הרדמה, כמתואר להלן. צוות וטרינרי ומחקר עקבו אחר בעלי החיים מדי יום.

1. הרדמה לבעלי חיים שאינה מבטלת את הבליעה

1. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (למשל, כפפות, מסכה) כדי למזער את החשיפה לאלרגנים בזמן עבודה עם מכרסמים.
2. הגבל מזון לכל כלוב מכרסמים עד 4-6 שעות לפני ההרדמה כדי למזער את החזקת המזון בחלל הפה ובלוע, מה שעלול להפריע להדמיה אנדוסקופית ו/או לגרום לשאיבת מזון במהלך ההליך.
   הערה: אגירת מזון בחלל הפה היא ממצא נורמלי במכרסמים ללא דיספגיה אם הם לא הוגבלו במזון.
3. הכינו "תחנת חימום" לאינדוקציה/התאוששות של בעלי החיים.
   1. יש לחמם מראש כרית חימום במחזור מים ל-37 מעלות צלזיוס על משטח ספסל.
   2. בחר כלובי אינדוקציה/התאוששות בגודל מתאים עבור המין הנבדק. לדוגמה, כלובי קופסאות נעליים של עכברים עם מכסים עליונים של מסנן הם בגודל מתאים לאינדוקציה/התאוששות של עכברים וחולדות. השתמש בכלוב אינדוקציה/התאוששות טרי עבור כל בעל חיים שנבדק; השתמש בכלוב יחיד גם ככלוב האינדוקציה וגם ככלוב ההתאוששות לאותה חיה.
   3. רפדו את רצפת כלוב האינדוקציה/התאוששות בשכבה קלה של חומר סופג (למשל, שבבי אספן, מגבת נייר, כרית גור) לחום וספיגת הפרשות הגוף במהלך השראת ההרדמה וההתאוששות.
   4. הנח את הכלובים המוכנים (עם מכסים עליונים מסננים) במלואם על כרית החימום למשך 30-60 דקות לפני השראת ההרדמה.
      הערה: מיקרו-סביבה זו מספקת חום משלים מספיק כדי לקדם חילוף חומרים יציב בהרדמה במהלך האינדוקציה וההתאוששות.
4. הנח את כלוב הבית של בעל החיים באמצע הדרך על כרית החימום שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות לפני השראת ההרדמה.
   הערה: מתן חום משלים לפני ההליך עשוי לזרז את השראת ההרדמה ולמנוע מנת יתר בשוגג עקב חילוף חומרים איטי/מושהה בהרדמה מהיפותרמיה.
5. הכן הרדמת קטמין-קסילזין (KX) על סמך המין ומשקל הגוף.
   1. לעכברים: תערובת של 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו-11 מ"ג/ק"ג קסילזין מספיקה לרינגוסקופיה טרנס-אוראלית בעכברי רקע C57BL/6 בוגרים משני המינים. התאם את המינונים לזני עכברים אחרים ולגילאים אחרים.
   2. לחולדות: תערובת של 60 מ"ג/ק"ג קטמין ו-6 מ"ג/ק"ג קסילזין מספיקה לרינגוסקופיה טרנס-אוראלית בחולדות ספראג דולי בוגרות משני המינים. התאם את המינונים לזנים אחרים של חולדות ולגילאים אחרים.
6. מחממים מראש את חומרי ההרדמה המלאים במזרק בתחנת החימום של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע אובדן חום בבעלי החיים המתרחש בעת הזרקת נוזלים קרים.
7. הזריק למכרסם את מינון ה-KX המחושב באמצעות מזרק בגודל מתאים (למשל, 1 מ"ל) ומחט (למשל, 26 G1/2).
   1. לעכברים: יש לתת זריקה תת עורית אחת (SC).
      הערה: מניסיוננו, זריקות SC בעכברים מפחיתות / מבטלות תמותה הקשורה להרדמה בהשוואה לזריקות תוך-צפקיות (IP).
   2. לחולדות: תן זריקת SC או IP אחת. אם מעדיפים, יש להרגיע חולדות עם איזופלורן (ISO) (3-5%) בתא אינדוקציה מיד לפני הזרקת KX.
      הערה: תנועת גוף ספונטנית עשויה להתחדש לתקופה קצרה (בדרך כלל <דקה אחת) עד שה-KX נכנס לתוקף.
8. מתן גליקופירולאט (חומר אנטיכולינרגי ) מיד לאחר הזרקת KX כדי להפחית הפרשות רוק עודפות שעלולות לעכב את ההדמיה של הגרון במהלך אנדוסקופיה טרנסאורלית ו/או לחסום מכנית את דרכי הנשימה העליונות במהלך התאוששות ההרדמה.
   הערה: המינון ומסלול האספקה זהים עבור עכברים וחולדות (0.01-0.02 מ"ג/ק"ג SC), וההשפעה היא כמעט מיידית ונמשכת מספר שעות.
9. לאחר הזרקת גליקופירולאט, הניחו את המכרסם המורדם בכלוב האינדוקציה שחומם מראש בתחנת החימום וכסו את הכלוב בווילון כירורגי כדי לספק סביבה חשוכה הממזערת את הגירוי החזותי למשך 10 דקות, ללא הפרעה.
   1. הפסק את ההליך אם המכרסם נשאר אמבולטורי 10 דקות לאחר מינון ה-KX הראשוני.
      הערה: ניסיונות לספק הרדמה נוספת (תחזוקת KX או קטמין) ככל הנראה יהיו חסרי תועלת.
10. לאחר 10 דקות, יש לתת מינון תחזוקה של קטמין (1/4 מהמינון הראשוני אם הרפלקסים בגפיים האחוריות מופחתים או 1/2 מהמינון הראשוני אם רפלקסים בגפיים האחוריות נמרצים; SC לעכברים ו- SC / IP לחולדות) לשמירה על הרדמה.
11. מרחו משחה עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית וטראומה נלווית במהלך הליך הלרינגוסקופיה.
12. העבר את המכרסם המורדם לפלטפורמת אנדוסקופיה מותאמת אישית כדי להתחיל בהליך הלרינגוסקופיה.
    הערה: תכננו את פלטפורמת האנדוסקופיה שלנו (איור 1) כך שיהיו לה פונקציות מרובות לשימוש עם מגוון גישות כירורגיות ואלקטרופיזיולוגיות של מכרסמים שאינן דורשות בהכרח אנדוסקופיה. ככזה, הוא בנוי יתר על המידה לשימוש אנדוסקופי גרידא. במידת הצורך, נדגיש תכונות/רכיבים החיוניים לפרוטוקול לרינגוסקופיה זה.
13. מנקודה זו ואילך, בדוק את הרפלקסים של הגפיים האחוריות כל 15-20 דקות לאורך כל ההליך וספק מנות תחזוקה נוספות של קטמין לפי הצורך, במרווחים של לפחות 20 דקות זה מזה. מכיוון שמדובר בהליך קצר יחסית (בדרך כלל <45 דקות בהרדמה), לעתים רחוקות נדרש קטמין נוסף לאחר מנת התחזוקה הראשונית.

2. מעבר טרנסאורלי של האנדוסקופ כדי לדמיין את הגרון

1. לפני הרדמת החיה, הכינו אנדוסקופ בגודל מתאים עם יכולת הקלטת וידאו.
   הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי באוטוסקופ בדרגה אפס עם קוטר פיר של 1.9 מ"מ ואורך פיר של 10 ס"מ עם מעטפת מתכת מותאמת אישית (איור 2), שהוא האנדוסקופ המייצג המשמש לאורך פרוטוקול זה.
   1. חבר את האנדוסקופ למקור אור ולמערכת הקלטת אנדוסקופיה לצפייה בזמן אמת והקלטת וידאו במינימום של 30 פריימים לשנייה (fps).
   2. מיקוד ואיזון לבן של המצלמה לאיכות תמונה אופטימלית.
   3. חבר את האנדוסקופ למיקרומניפולטור.
      הערה: למעקב אחר תנועת הגרון, אנו מאבטחים את האנדוסקופ למיקרומניפולטור בפלטפורמת האנדוסקופיה כדי לאפשר בקרת אנדוסקופ מדויקת לצילום וידאו יציב.
2. אבטח את המכרסם בשכיבה גבית על פלטפורמה מחוממת. ייצב ושיתק את הראש על ידי אבטחתו באמצעות מוטות אוזניים.
   1. ודא שראש המכרסם יכול להסתובב בחופשיות למעלה/למטה (אך לא מצד לצד) במוטות האוזניים מבלי להחליק החוצה. דרגת חופש זו מאפשרת החדרה טרנסאורלית והתקדמות האנדוסקופ כדי להגיע לגרון.
3. אם רצוי רישום אלקטרופיזיולוגי סינכרוני של תיאום נשימה, בליעה ובליעה-נשימה במהלך אנדוסקופיה, המשך ביישום חיישנים מתאימים למטרה זו (איור 3).
   1. הצמד חיישן נשימה לבטן בקו האמצע, מיד לתהליך הקסיפואיד, באמצעות סרט כירורגי.
   2. לגלח ולנקות/לחטא את העור במגבון אלכוהול לפני הכנסת אלקטרודות המחט למניעת זיהום.
   3. השתמש במחט 22 גרם כדי לנקב פתח קטן דרך העור לפני החדרת אלקטרודת המחט כדי למנוע נזק למחט אלקטרומיוגרפיה (EMG).
   4. הכנס אלקטרודת מחט EMG קונצנטרית סטרילית (למשל, 25 מ"מ x 0.3 מ"מ/30 גרם) דרך העור התת-מנטלי בקו האמצע לבסיס הלשון (למשל, שריר גניוגלוסוס או גניוהואיד, תלוי בעומק החדרת המחט).
   5. הכנס אלקטרודה טחונה (למשל, נירוסטה 27 גרם) תת עורית בירך (משני הצדדים).
   6. חבר את חיישן הנשימה ואלקטרודות מחט EMG למערכת הקלטה אלקטרופיזיולוגית (למשל, ביו-מגבר ומערכת רכישת נתונים עם לכידת וידאו סינכרוני) וודא אותות אלקטרופיזיולוגיה נקיים בשני הערוצים לפני שתמשיך.
   7. עטפו את אתרי חיבור האלקטרודות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני רעש חשמלי ולשפר את יחס האות לרעש בהקלטות האלקטרופיזיולוגיות המתאימות.
   8. התאם את מיקום חיישן הנשימה ואת עומק האלקטרודה של מחט EMG לפי הצורך כדי להשיג אותות אלקטרופיזיולוגיה נקיים בשני הערוצים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בקצב דגימה של 1k לנשימה ובקצב דגימה של 20k ומסנן מעבר פס (למשל, 150-3,000 הרץ) עבור EMG.
4. כסו את פלג הגוף העליון של המכרסם (וחיישן הנשימה) בשמיכה שקופה כדי להקל על ויסות החום תוך מתן אפשרות להדמיה של תנועת הבטן במהלך הנשימה. השאירו את הגפיים האחוריות והבטן התחתונה חשופות באופן חופשי לגישה במהלך בדיקות רפלקס ומינון תחזוקה חוזר של קטמין. ודא שהשמיכה אינה מגבילה את תנועת הבטן במהלך הנשימה.
5. המשך עם אנדוסקופיה טרנסאורלית (איור 4).
   1. פתח את פיו של המכרסם על ידי הכנסת אפליקטור מחודד עם קצה כותנה מאחורי החותכות המרכזיות, בניצב ללסת. סובב את צמר הגפן על פני השטח הגבי של הלשון כדי לבלוט אותו מעט מהפה.
6. בעזרת אחיזת אצבע קלה, משכו בעדינות את הלשון מעט מהפה לצד אחד של החותכות המרכזיות תוך החדרת קצה האנדוסקופ לחלל הפה (איור 4A,B).
   1. הפעל את מקור האור לאחר הכנסת קצה האנדוסקופ לפה כדי למנוע פגיעה פוטנציאלית בעיני המכרסם.
   2. הכנס את האנדוסקופ לרוחב לחותכות באותו צד של הלשון הנסוגה. החותכות המרכזיות מונעות את החדרת האנדוסקופ בקו האמצע, ובכך מחייבות גישת החדרה רוחבית זו.
7. הפעל את מערכות הרישום של אנדוסקופיה (ואלקטרופיזיולוגיה). תיעוד רציף לאורך כל ההליך כדי להבטיח נתונים מספיקים לניתוח פוסט הוק או תיעוד בזמנים נבחרים, בהתאם לצרכי המחקר.
8. קדם בזהירות את האנדוסקופ כדי לדמיין את האורופרינקס, היזהר לא לגרד את החך הקשה או להפעיל לחץ עודף על הלשון שעלול לגרום לפציעה.
   1. הסר חלקיקי מזון גלויים ו/או הפרשות רוק עודפות באמצעות ספוגית בגודל מתאים (למשל, מיקרו-מברשת בגודל 1.5 מ"מ) כדי למזער את הסיכון לשאיפה ככל שההליך מתקדם.
   2. המשך להתקדם/להתאים את מיקום האנדוסקופ עד שההיפופרינקס מרוכז בתוך שדה הראייה על המוניטור וניתן לזהות מבנים אנטומיים מרכזיים (איור 4C). בשלב זה, כל המבנים צריכים להיראות מיושרים אנטומית/סימטריים בתוך שדה הראייה של המצלמה; אחרת, מקם מחדש את האנדוסקופ לפי הצורך.
   3. שימו לב לתנועה מעוררת של הלסת/לשון במהלך התקדמות האנדוסקופ. אם נעדר, המשך ללא מינון חוזר של קטמין. אם קיים, יש לתת מנת תחזוקה שנייה של קטמין (1/4 עד 1/2 מהמינון הראשוני של קטמין) ולהמתין כ-5 דקות כדי להיכנס לתוקף לפני שתמשיך. מינון חוזר רק אם עברו לפחות 20 דקות מאז ההזרקה הקודמת כדי למנוע הרגעת יתר וביטול הבליעה.
   4. בדוק את לשון המכרסם כל 5 דקות לאורך כל ההליך לאיתור שינוי צבע כהה, המעיד על איסכמיה. כדי להימנע מכך, מקם מחדש את האנדוסקופ לפי הצורך.
9. הפעל לחץ קל על הקליפה עם מיקרו-בדיקה (למשל, מרית מתכת) המוחדרת לצד האנדוסקופ כדי לנתק את החך הרך והאפיגלוטיס כדי לדמיין את הגרון מרחוק (איור 4D). הימנע משימוש בקצה האנדוסקופ לניתוק, מכיוון שהלחץ המופעל עלול לגרום לנזק לרקמות רכות או לכופף/לפגוע לצמיתות בציר האנדוסקופ.
   הערה: בניגוד לבני אדם, גרון העכברים אינו נראה ישירות מנקודת מבט טרנסאורלית. במקום זאת, האפיגלוטיס נלכד מכנית מתחת לקרום רירי המכסה את הקלף, מה שגורם להיווצרות חלל היפופרינגיאלי ללא מוצא. הפעלת לחץ קל על הוולום משחררת את האפיגלוטיס מהקרום הקטיפה כדי לתת מבט חלקי על הגרון.
10. שימו לב לסנוניות מעוררות במהלך ניתוק וולום/אפיגלוטיס.
    1. זהה סנוניות כתזוזות לשון אחוריות פתאומיות וקצרות לכיוון החך הקשה. תנועה זו מתרחשת בדרך כלל בסנכרון עם תנועה/דיכאון קצר של הלסת התחתונה, ובכך מספקת תחליף לזיהוי בליעה כאשר הלשון האחורית אינה נראית בקלות בשדה הראייה של האנדוסקופ.
    2. זהה גם סנוניות באמצעות פעילות התפוצצות EMG בלשון בשילוב עם אפיזודות דום נשימה קצרות בהקלטת האלקטרופיזיולוגיה, שניהם מתרחשים בסנכרון עם אירועי סגירה גלוטית בסרטון האנדוסקופיה.
       1. במקרה של בליעה חוזרת ומהירה המעידה על הרדמה לא מספקת (כלומר, קלה מדי), יש למנות מחדש ולהמתין ~5-10 דקות לפני שתמשיך. יש להמתין לפחות 20 דקות לאחר הזרקת התחזוקה הקודמת של קטמין כדי למנוע הרגעת יתר וביטול הבליעה.
       2. קחו בחשבון את עומק ההרדמה כאופטימלי כאשר רק כמה סנוניות מתעוררות במהלך ניתוק קטיפה-אפיגלוטי.
       3. אם הבליעה מבוטלת, ההרדמה עמוקה מדי להערכת הגנה על דרכי הנשימה של הגרון. במקרה זה, המתן 5-10 דקות לחילוף החומרים של קטמין לפני שתמשיך בהדמיה מקרוב של הגרון.

3. הקלטת וידאו תקריב ללא הפרעה של תנועת הגרון במהלך הנשימה ומעוררת בליעה

הערה: הקלטה אלקטרופיזיולוגית סינכרונית של נשימה, בליעה ותיאום בליעה-נשימה היא גם אופציה.

1. קדם לאט את האנדוסקופ בין הוולום לאפיגלוטיס תוך שמירה על הגרון במרכז שדה הראייה (איור 5A-C).
   הערה: קצה האנדוסקופ יעבור בקלות דרך הפתח הוולרי-אפיגלוטי ללא כוח. אחרת, בטל את ההליך כדי למנוע נזק פוטנציאלי לבעל החיים. אפשר לדמיין את הגרון מרחוק, עם קצה האנדוסקופ בהיפופרינקס. עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל נסיגה ידנית של האפיגלוטיס, הוולום ו/או הלשון לצורך הדמיה משופרת של הגרון. עם זאת, חלקים מהגרון בדרך כלל נשארים מוסתרים מהעין, והתקני הנסיגה יכולים להגביל את תנועת הגרון, מה שעלול להתפרש בטעות כתפקוד לקוי.
2. המשך לקדם את האנדוסקופ כדי לקבל מבט מקרוב ללא הפרעה על כל הממדים הגחוניים-גביים והרוחביים של הגרון בשדה ראייה יחיד (איור 5C).
   הערה: הקומיסורה הגחונית עלולה להיות חסומה על ידי האפיגלוטיס, במיוחד בעכברים צעירים/קטנים יותר. במקרים אלה, ניסיון לתפעל בצורה אגרסיבית יותר את קצה האנדוסקופ כדי לדמיין את הגחון יכול להגביל את תנועת הגרון, שעלולה להתפרש בטעות כתפקוד לקוי. זה עלול גם לחסום את זרימת האוויר בגרון וכתוצאה מכך לחנק.
3. שימו לב לתנועה התנודה של הגרון כאשר המכרסם שואף (התרחבות גלוטלית) ונושף (היצרות גלוטלית) במהלך כל מחזור נשימה.
   הערה: קצב ועוצמת תנועת הגרון/גלוטל עשויים להשתנות בהתאם לעומק ההרדמה; עם זאת, פער גלוטאלי (כלומר, מרווח אוויר בין האריטנואידים השמאליים/ימניים לקפלי הקול) נשאר בדרך כלל גלוי לאורך כל מחזור הנשימה במכרסמים בריאים.
   1. אם נצפתה היצרות גלוטית ניכרת, כוונן את מיקום האנדוסקופ כדי להבטיח זרימת אוויר ללא הפרעה דרך דרכי הנשימה העליונות. לדוגמה, הימנע מהפעלת לחץ על הקליפה, מה שעלול לגרום לחסימת רקמות רכות בדרכי הנשימה של האף. הימנע גם מהכנסת קצה האנדוסקופ לחלל הגלוטל, מה שעלול לחסום את זרימת האוויר בגרון ולהוביל לחנק. אם במקרים נדירים, הנשימה נפסקת, יש לבצע מספר לחיצות חזה באמצע החזה (באמצעות אצבע אחת) או אוורור בלחץ חיובי (באמצעות "שקית החייאה" מיניאטורית) לאחר הסרת האנדוסקופ.
4. הקלטת וידאו של תנועת נשימת הגרון למשך 30-60 שניות למטרות הערכה פוסט-הוק.
5. כאשר הגרון עדיין במבט מקרוב, כוונן מעט את קצה האנדוסקופ בתוך כניסת הגרון כדי להפעיל גירוי מכני על הרירית המכסה את הוולום ו/או האפיגלוטיס, ולעורר בליעה במכרסמים מורדמים בצורה אופטימלית.
   1. השתמש בהתאמות ברמת המיקרו של קצה האנדוסקופ (כלומר, ~1 מ"מ לכל כיוון) כדי למנוע פגיעה ברירית ו/או חסימת דרכי הנשימה.
   2. שימו לב לסנוניות מעוררות, שניתן לזהות בקלות כאירועי סגירה גלוטית פתאומית המתרחשים בסנכרון עם דיכאון בלסת הנראית לעין, פעילות התפוצצות EMG בלשון ודום נשימה קצר (<1/2 שניות) הנראה בעקבות הנשימה.
      הערה: עלולים להתרחש אירועי סגירה גלוטית ללא תנועת לסת מקבילה; עם זאת, סגירה גלוטית בדרך כלל אינה שלמה במקרים אלה. אנו חושדים שאלו עשויים להיות רפלקסים אחרים להגנה על דרכי הנשימה (למשל, רפלקס מקרב גרון) המתעוררים כאשר ההרדמה מתחילה להתפוגג; עם זאת, מדובר בהתרחשויות נדירות/לא עקביות הדורשות חקירה נוספת.
   3. חזור על הפעולה עד לעורר 5-10 סנוניות ולהקליט וידאו לכל חיה. אם הבליעה מבוטלת, הסר את האנדוסקופ והמתן 5-10 דקות עד שיתרחש חילוף החומרים של קטמין לפני שתמשיך.
6. החזר בזהירות, אך אל תסיר, את האנדוסקופ לתוך האורופרינקס ומרכז את ההיפופרינקס בשדה הראייה כדי לדמיין את האפיגלוטיס והוולום.
7. חבר מחדש את הוולום והאפיגלוטיס לחידוש נשימת האף על ידי שימוש במיקרו-ספוגית כדי להפעיל לחץ קל על בסיס הלשון כדי לעורר בליעה ולכידה מחדש של האפיגלוטיס מתחת לקרום הקטיפה. אם צימוד מחדש לא מתרחש תוך מספר ניסיונות, המשך בהתאוששות מהרדמה ללא צימוד מחדש כדי למנוע סיכון לפגיעה בגרון.
8. הפסק את רישום האנדוסקופיה (והאלקטרופיזיולוגיה).
9. השתמש בצמר גפן ספוג במי מלח כדי להרטיב את הלשון והחותכות המרכזיות ולהחזיר את הלשון למקומה האנטומי בתוך חלל הפה.
10. נתק את מוטות האוזניים והסר את בדיקת הטמפרטורה, חיישן הנשימה ואלקטרודות EMG מהמכרסם כדי להמשיך בהתאוששות ההרדמה.

4. התאוששות מהרדמה

1. הנח את החיה בכלוב התאוששות מחומם מראש (כלומר, זהה לכלוב האינדוקציה) על "תחנת החימום" כדי להתאושש מההרדמה.
2. יש למרוח שוב חומר סיכה לעיניים כדי למנוע התייבשות.
3. יש לתת תמיסת מלח מחוממת SC לנוזלים: עד 5 מ"ל לחולדות ועד 0.5 מ"ל לעכברים.
4. מתן atipamezole SC להיפוך קסילזין ולהגברת הדחף הנשימתי: 1-2 מ"ג/ק"ג לחולדות ועכברים.
   1. יש להתחיל עם 2 מ"ג/ק"ג אטיפמזול, ומיד לאחר מכן גירוי ידני לאורך הגב והקיבה של המכרסם כדי להאיץ את ההתאוששות.
      הערה: בגישה זו, תנועת ראש ספונטנית מתחילה בדרך כלל תוך 1-3 דקות. עם זאת, החזרה למצב אמבולטורי אורכת בדרך כלל שעתיים בממוצע (נע בין שעה ל-5 שעות) לאחר לרינגוסקופיה בהרדמת KX, עקב הבדלים אינדיבידואליים.
   2. מתן טיפמזול נוסף במינון של 1 מ"ג/ק"ג (לפחות 15 דקות לאחר ההזרקה הראשונה) אם תנועת הגוף הספונטנית פוחתת במקום לעלות במהלך 15-30 הדקות הראשונות של התאוששות ההרדמה, למרות מתן גירוי ידני תכוף.
   3. המשך במתן דוקספרם (5 מ"ג/ק"ג IP לחולדות ועכברים) אם הפעילות הספונטנית ממשיכה לרדת. מינון חוזר עם חומר "הצלת חירום" זה במרווחים של 10-15 דקות (עד חמש מנות) עד להופעת תנועה ספונטנית. אם המכרסמים נשארים גוססים, המתת חסד של בעלי החיים בשיטות המתת חסד מאושרות (למשל, מנת יתר של קטמין ואחריה שיטה משנית כגון עריפת ראשים).
5. עקוב מקרוב אחר מכרסמים מתאוששים במרווחים של 15-20 דקות כדי לזהות שינויים שליליים במצב הנשימה, הניידות והוויסות החום ולספק התערבות לפי הצורך (למשל, גירוי ידני, חמצן משלים, שמיכה תרמית, אטיפמזול או זריקות דוקספרם). ספק ניטור תכוף יותר למכרסמים הדורשים התערבות.
   1. ספק חמצן משלים (למשל, 1-2 ליטר לדקה בתא אינדוקציה מחומם, ללא ISO) למשך 10 דקות לפי הצורך למכרסמים עם זמני התאוששות ממושכים מהרדמת KX. לחלופין, הפעל גירוי תכוף לאורך משטחי הגב והגחון של החיה כדי לנרמל את רמות SpO₂ (>94%).
   2. הניחו חברים לכלוב מתאוששים באותו כלוב התאוששות (עד שני מכרסמים בכלוב) כדי לקדם פעילות ספונטנית מוגברת והתאוששות מהירה יותר.
6. החזירו מכרסמים לכלוב הבית המחומם שלהם כאשר הם מסוגלים לנוע באופן ספונטני סביב כלוב ההתאוששות.
   1. החזירו את בקבוק המזון והמים הסטנדרטי לכלוב הביתי. אל תספק התאמות מיוחדות לגישה למזון/מים בזמן שההרדמה עדיין מתפוגגת כדי למזער את הסיכון לחנק/שאיפה.
   2. התבונן בפעילות הכלוב הביתי והסר את כל המכשולים המעכבים את האמבולציה (למשל, צריף, צינור PVC).
   3. מקם את כלוב הבית חצי דולק, חצי מחוץ לתחנת החימום למשך 12-16 השעות הבאות (כלומר, לילה).
      הערה: הפסקת חימום משלים מוקדם יותר עלולה לגרום לתמותה עקב היפותרמיה.
7. בצע בדיקות בריאות סטנדרטיות למחרת בבוקר. החזר בעלי חיים עם חידוש פעילות רגילה/בסיסית, תפקודי גוף (למשל, ויסות חום, אכילה, שתייה, מתן שתן, עשיית צרכים) ומשקל יציב (כלומר, שמירה או עלייה) לתנאי ויווריום סטנדרטיים עם ניטור בריאות יומיומי שגרתי. במקרה הנדיר שבו למכרסמים יש ירידה בפעילות, בתפקודי הגוף או במשקל הגוף, המשיכו בתוספת חום ליום נוסף.
   הערה: עבור חולדות, נפוץ שכתמי פורפירין מופיעים לפתע סביב שתי העיניים ~ 3-6 שעות לתוך תקופת ההחלמה מההרדמה. הצביעה נפתרת בדרך כלל תוך 24 שעות.

5. כימות אובייקטיבי של תנועת הגרון בזמן נשימה לעומת בליעה

1. השתמש בתוכנת עריכת וידאו עם תכונת ניתוח מסגרת אחר מסגרת כדי לצפות בסרטוני האנדוסקופיה.
   1. זהה לפחות אפיזודה מייצגת אחת של 10-20 שניות של נשימה ספונטנית לכל בעל חיים.
   2. זהה 3-5 אירועי בליעה מייצגים לכל בעל חיים.
   3. ודא שאפיזודות/אירועי הנשימה והבליעה שנבחרו עומדים בקריטריוני הניתוח הבאים: הגרון מרוכז בשדה הראייה של המצלמה כאשר כל המבנים/גבולות הגרון נראים לעין (כלומר, לא מוסתר על ידי הקלף, האפיגלוטיס או הפרשות רוק עודפות), תאורה מספקת (כלומר, מסוגל לראות את כל המבנים/גבולות הגרון), וללא חפץ תנועה של המצלמה (כלומר, האנדוסקופ אינו זז).
2. לנתח את אירועי הנשימה והבליעה שזוהו באמצעות גישות סובייקטיביות ו/או אובייקטיביות.
   1. לניתוח סובייקטיבי: השתמש בסולם Likert כדי לנקד באופן סובייקטיבי את תנועת הגרון במהלך צפייה בזמן אמת ופריים אחר פריים באמצעות תוכנת עריכת וידאו. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בסולם ליקרט מורחב הנע בין -2 ל-+2, כאשר ערכים שליליים מצביעים על תנועת גרון בכיוון ההפוך מהצפוי. הערך את ההגנה על דרכי הנשימה של הגרון במהלך הבליעה, כאשר 0 = אין הפחתה בגודל הפער הגלוטאלי (כלומר, אין הגנה על דרכי הנשימה של הגרון), 1 = הפחתה מסוימת של פער הגלוטאלי (כלומר, הגנה לא מלאה על דרכי הנשימה), ו-2 = הוספה מלאה של האריטנואידים, עם פער גחוני קטן בלבד בין קפלי הקול (כלומר, הגנה מלאה על דרכי הנשימה), כאשר ערכים שליליים מצביעים על תנועת גרון פרדוקסלית.
      הערה: סולם ליקרט הנע בין 0 ל-2 נמצא בשימוש נפוץ במחקרי מכרסמים, כאשר 0 = ללא תנועה, 1 = תנועה מסוימת ו-2 = תנועה רגילה 17,18,19,20,21,22. עם זאת, סולם זה אינו לוקח בחשבון תנועת גרון פרדוקסלית המתרחשת לעתים קרובות בעקבות פגיעה חוזרת בעצב הגרון (RLN)¹⁰.
   2. לניתוח אובייקטיבי: זהה ארבע מסגרות וידאו מרכזיות - 1) מסגרת המנוחה הקודמת ישירות להתחלת התקרבות הגרון (כלומר, המסגרת שלפני התקרבות קפלי הקול), 2) המסגרת שבה קפלי הקול השלימו את ההתקרבות, 3) המסגרת הקודמת לחטיפת קפלי הקול (זה עשוי לחפוף עם #2), ו-4) המסגרת שבה קפלי הקול נחטפו לחלוטין ומוחזרים למצב מנוחה כדי לחדש את הנשימה. השתמש בחותמת הזמן של ארבע מסגרות מפתח אלה כדי לחשב את משך התקרבות קיפול הקול (מסגרת 1 למסגרת 2), סגירה גלוטית (מסגרת 2 למסגרת 3), חטיפת קפל הקול (מסגרת 3 למסגרת 4) ומשך הבליעה הכולל (מסגרת 1 למסגרת 4). לחלופין, השתמש בתוכנה מסחרית קיימת^{אחרת 23} כדי למדוד את זווית הגלוטל (כלומר, בין האריטנואידים בגב או בקפלי הקול בגחון) במהלך חטיפה מקסימלית ותוספת מקסימלית באמצעות תמונות מסגרת סטילס 17,18,24. בקש משני סוקרים מיומנים לפחות לבצע תהליך זה באופן עצמאי בצורה עיוורת, לזהות פערים בין סוקרים ולהגיע להסכמה משותפת עבור כל אי התאמה.
      הערה: בעבר ביצענו ניתוח ידני זה מסגרת אחר מסגרת של אירועי תזמון סגירה גלוטית (כלומר, במהלך רפלקסים מגנים על דרכי הנשימה) באמצעות תוכנת עריכת וידאו מסחרית במכרסמים ובבני אדם¹⁴. עם זאת, גישה זו אינה יעילה ומספקת רק כימות מוגבל של דינמיקת תנועת הגרון. כיום אנו משתמשים בתוכנת מעקב גרון שנבנתה בבית כדי לבצע כימות אובייקטיבי נרחב יותר של תנועת הגרון במהלך נשימה ורפלקסים מגנים על דרכי הנשימה 22,25,26,27,28,29,30. התוכנה כוללת יכולת מעקב אוטומטית מסגרת אחר מסגרת לכימות אובייקטיבי של מרחק תנועת גרון בצד שמאל לעומת ימין (משרעת) ותזמון (תדירות). אנו משתמשים בפרמטרים אלה כדי לגזור מגוון מדידות מבוססות תנועה כדי לזהות/לכמת תפקוד לקוי של הגרון (למשל, מקסימום/מינימום/טווח, סימטריית תנועת גרון וסנכרון) במהלך נשימה, בליעה ורפלקסים אחרים המגנים על דרכי הנשימה (למשל, רפלקס מקרב גרון). תוכנה זו עדיין עוברת שיפורים ועדיין אינה זמינה מסחרית/ציבורית.

שימוש מוצלח בפרוטוקול לרינגוסקופיה זה של עכברים מביא להדמיה מקרוב של הגרון במהלך נשימה ספונטנית ומעורר בליעה בתנאים בריאים וחולים, כפי שמוצג באיור 6. יתר על כן, ניתן לחזור על פרוטוקול זה מספר פעמים באותם מכרסמים כדי לאפשר חקירה של תפקוד/תפקוד לקוי של הגרו...

פיתחנו בהצלחה פרוטוקול לרינגוסקופיה ספציפי למורן הניתן לשכפול המאפשר הדמיה מקרוב של תנועת הגרון במהלך נשימה ובליעה. חשוב לציין, ניתן לבצע את הפרוטוקול לאורך זמן באותם בעלי חיים כדי לחקור את ההשפעה של מצבים פתולוגיים שונים במיוחד על תפקוד הגרון. פרוטוקול זה פותח בעשור ה?...

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי שני מענקי NIH: 1) מענק Multi-PI (TL ו-NN) R01 (HL153612) מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI), ו-2) מענק R03 (TL, DC0110895) מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD). פיתוח התוכנה המותאמת אישית שלנו למעקב אחר תנועת הגרון מומן בחלקו על ידי מענק של קרן קולטר (TL & Filiz Bunyak). אנו מודים לקייט אוסמן, קלואי בייקר, קנדי הולשר וזולה סטיבנסון על הטיפול המצוין במכרסמי המעבדה שלנו. אנו מודים גם לרודריק שלוצהאואר וצ'סטון קאלייס מחנות מכונות הפיזיקה של MU על קלט העיצוב והייצור של פלטפורמת האנדוסקופיה המותאמת אישית שלנו ושינויים אסטרטגיים באנדוסקופים מסחריים ומיקרומניפולטורים כדי לענות על צרכי המחקר שלנו. תוכנת מעקב תנועת הגרון המותאמת אישית שלנו פותחה בשיתוף פעולה עם ד"ר פיליז בוניאק וד"ר עלי חמד (המחלקה להנדסת חשמל ומדעי המחשב ב-MU). אנו מודים גם לג'ים מרנטי מאנדוסקופיה של קארל סטורץ על מתן הדרכה בבחירת אוטוסקופ. לבסוף, ברצוננו להכיר במספר רב של סטודנטים/מתלמדים קודמים במעבדת Lever שתרומתם השפיעה על פיתוח פרוטוקול לרינגוסקופיה עכברי הנוכחי שלנו: מרלנה שבצ'יק, קמרון הינקל, אביגיל רובנק, ברידג'ט הופוול, לסלי שוק, איאן דנינגר, צ'נדלר הקסטון, מרפי מאסטין ודניאל שו.