שיטות מעטות מאפשרות להעריך במהירות את הפונקציונליות של אבות hematopoietic. פרוטוקול זה מודד את ההשפעה של חלוקות התאים הראשונות על גורל התא ומחויבותו. פרוטוקול זה מאפשר למדוד בו זמנית חלוקה והתמיינות ברמת תא בודד ובתפוקה גבוהה ללא צורך במניפולציה מורכבת ונרחבת.
שיטה זו מתאימה לכל אוכלוסייה המטופויטית שניתן לשמור עליה בתרבית. כך שניתן ליישם אותו בקלות בביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה וביולוגיה התפתחותית. כדי להתחיל, aliquot 250 מיקרוליטר של CD34 + חלק שווה בארבעה צינורות פוליפרופילן 15 מיליליטר.
תייג את הצינורות כמתואר בכתב היד של הטקסט. Aliquot 250 מיקרוליטר של שבר CD34 לתוך עוד ארבעה צינורות פוליפרופילן 15 מיליליטר לתייג את הצינורות. הכן פתרונות CFSE גבוהים ונמוכים CSFE כמתואר בכתב היד של הטקסט.
הוסף 250 מיקרוליטר של התמיסה הגבוהה CFSE לצינור CF ו- CV, 250 מיקרוליטר של התמיסה הנמוכה CFSE לצינור VC, ו- 250 מיקרוליטר של מדיום הנשר המותאם של דולבקו, או DMEM, ללא נסיוב בקר עוברי, או FBS, לצינור VI. כדי להבטיח שילוב יעיל של תרחיף תאים בצבע התא, הטה את הצינור ב -90 מעלות והפקיד את תמיסות CFSE על דופן הצינור. לאחר מכן, החזק את הצינור במאונך וערבב שלוש או ארבע פעמים כדי להבטיח ערבוב מהיר של תמיסות CFSE עם התאים המרחפים מחדש.
לדגור על המתלה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות. לאחר הדגירה, להוסיף חמישה מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS ומניחים את הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. סובב את הצינורות ב 300 גרם במשך חמש דקות.
הסר את supernatant באמצעות שאיפה מבלי להפריע את הגלולה ולשטוף את הגלולה עם חמישה מיליליטר של PBS, ETDA. סובבו שוב את הצינורות והשליכו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב-40 מיקרוליטר של PBS, ETDA. כדי להכתים את תאי CD34+, הכינו תערובת אב של נוגדנים לתוך צינור יחיד של 0.5 מיליליטר.
הוסף שבעה מיקרוליטרים מתערובת האב של הנוגדנים לכל אחד מארבעת תנאי CD34+. השהה מחדש את התאים במאגר צביעה באמצעות כ -500 מיקרוליטר כל אחד עבור החרוזים בתאי CD34 + ומיליליטר אחד עבור צינורות CD34. למיון תאים, הגדר את אסטרטגיית ה- gating על-ידי יצירת דיאגרמות התוויית נקודות.
ראשית, דמיינו את התאים בתרשים נקודות FSCA לעומת SSCA ולחצו לחיצה כפולה על כלי ה-Polygon gating כדי לבחור את האוכלוסייה עם פיזור צד נמוך. תייג שער חדש זה שנוצר כתאים. בתרשים הנקודות הבא, FSCA לעומת FSCH, לחץ לחיצה ימנית על העלילה ובחר את תאי השער מהתפריט הנפתח על ידי לחיצה עליו.
השתמש באותו כלי gating כדי לבחור אוכלוסייה הדוקה באלכסון בין שני הצירים. תייג שער זה כתאים בודדים. בתרשים הנקודה השלישית, APC לעומת FSH-H, מציגים את האוכלוסייה תאים בודדים ומשערים את התאים שליליים לביטוי שושלת APC.
תייגו אוכלוסייה חדשה זו כשושלת שלילית. בחלקה הרביעית, CFSE לעומת CTV, מציגים את האוכלוסייה שלילי ויוצרים ארבעה שערים נפרדים, אחד לכל שילוב צבעים. שער VI מוצג כאן כדוגמה.
השתמש במגרשים החמישי והשישי כדי לזהות את אבות העניין. שער נדיב CD34 + CD38 אוכלוסייה ו CD34 + CD38 + בחלקה החמישית. לאחר מכן, בחר את אוכלוסיית CD34 + CD38 בחלקה השישית וצייר שלושה שערים עבור LMPP, HSC ו- MPP.
הפעל את CD34 + שברים, הקלטת לפחות 5, 000 אירועים בשער התא היחיד. התאימו את השער לכל שילוב צבעים, והציבו שער הדוק לבחירת אוכלוסייה הומוגנית. הכן את תבנית מיון הלוחות באמצעות פריסת מיון ניסוי.
הבארות בשם CD34-מכילות 5, 000 עד 10, 000 תאים ממוינים על CF, CV, VC, VI שער. הבארות בתפזורת מכילות 500 תאים ממוינים על השער CD34+CD38 - הבארות הבודדות מכילות רק אירוע אחד לכל שילוב צבע חלוקת תאים לכל באר, כך שבסך הכל ארבעה אירועים לכל באר. לאחר מכן, התחל עם מיון CD34-CF במצב טוהר תשואה.
לחץ על כפתור לרכוש ולאחר מכן על למיין לחצן. לחץ על Acquire, ולאחר מכן על הלחצן Sort וודא שסימן 0160 כציון טוהר. לבסוף, מיין את התאים המעניינים, תא אחד לכל באר, בטוהר תא בודד, וודא שסימנו את אפשרות מיון המדדים.
צנטריפוגו את הצלחת ב-300 גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנאטנט על ידי היפוך מהיר של הצלחת מתחת למכסה המנוע מעל מגבת נייר. הוסף שמונה מיקרוליטר של חיץ עומד לבארות A1 עד A4, ולאחר מכן הוסף שמונה מיקרוליטר של תערובת לבארות האחרות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חיץ צביעה לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.
צנטריפוגה ולהסיר את supernatant לפני resuspending את התאים ב 85 מיקרוליטר של חיץ צביעה. התחל את הניתוח על ציטומטר הזרימה במצב רכישה באמצעות התבנית הייעודית ולחץ על מותאם אישית. לאחר בחירת הפלואורופורים המעניינים מהרשימה, הגדר את הגדרת הלוח בהתאם לתבנית הלוח שתוקנה למספר הבארות המכילות תא אחד לפחות.
סמן את האפשרות Agitation ובחר 100 מיקרוליטר כמגבלת נפח הרכישה. לאחר מכן, הגדר את קצב הרכישה לא עדיף על מיקרוליטר אחד לשנייה, כמו מהירות נמוכה יותר משפר את הנפח הכולל מנותח לכל באר. לגידור מייצג, שרשרו את הבארות השונות בתפזורת בקובץ יחיד.
לאחר לחיצה על האפשרות Concatenate Populations, בחר All uncompensated parameters מתפריט Parameters, ולאחר מכן לחץ על Concatenate. העלה את הקובץ המשורשר לסביבת העבודה, ולאחר מכן החל את מטריצת הפיצוי באמצעות גרירה ושחרור. תוויות תאים עם CV ו- VC זקוקות לערך שעבר טרנספורמציה.
לחץ על Tools and Derive Parameter כדי לקבל את הערך שהומר. הדבק את הנוסחה שצוינה בתיבת הנוסחאות. החילו את הגאטינג על כל צבע בנפרד כתרשים היסטוגרמה.
עבור CF ו- VI, הגדר את CFSE-A ו- CTV-A על ציר X, בהתאמה. עבור CV ו- VC, הגדר את הפרמטר הנגזר החדש על ציר X, ולאחר מכן הגדר שערים המתאימים לכל שיא. החל את gating על כל תא בודד היטב.
הקפד להוסיף את הפרמטר הנגזר לכל באר מנותחת. אמת ידנית כל שער צבע עבור כל באר כדי לזהות אירועים שהוקצו באופן שגוי לשיא נתון. ניתוח ציטומטריית זרימה לאחר תרבית תאים דורש gating מדויק כדי לקבוע את הקרבה של כל תא בודד יחד עם פנוטיפ התא.
הגדרת שיא והקצאה הם היבטים מכריעים של ניתוח ציטומטריית זרימה. ההיסטוגרמות מציגות שתי דוגמאות למשפחות המפוזרות על פסגות מרובות, אחת משתי פסגות עוצמה דומות ואחת עם שתי פסגות עוצמה שונות. סוגים שונים של ייצוג נתונים ובדיקות סטטיסטיות מוצגים כאן עבור שני ניסויים נפרדים שבוצעו לאחר 72 שעות עבור HSCs ו- MPPs.
מפת החום של התמיינות HSC מייצגת משפחות תאים שונות, הן בגורלות התא והן בחלוקות התא. ההיסטוגרמה המשווה את גורלן של משפחות תאים נגזרות מ-HSCs ו-MPPs מוצגת כאן. עבור שני סוגי התאים, ההשוואה בין התנאי GT לבין התמיינות התנאים מוצגת יחד עם הבדיקות הסטטיסטיות שבוצעו עבור MPPs.
היסטוגרמות המשוות את אחוז משפחות התאים לדור ואת סוג הסימטריה או הא-סימטריה בגורל עבור החלוקה הראשונה מוצגות כאן. חלוקת הגורלות לדור עבור MPPs והבדלי התנאים מוצגים כאן. הליך זה דורש לבודד תאים בכמויות גדולות כדי להגדיר את אסטרטגיית gating המתאימה.
לכן עדיף להתחיל את מכתים עם לפחות 10, 000 תאים. שילוב שיטה זו עם מדידה רציפה, כמו תאים חיים שמדמיינים, יכול להיות חזק מאוד, שכן שניהם יחד יכולים לספק תיאור מפורט של האבות המוקדמים של הדינמיקה של התא. גישה זו פותחה לראשונה עבור ביולוגיה של תאי T על ידי מעבדות הופקינס.
גרסה זו, המותאמת לתאי גזע בדם, מתרחבת כעת לסרטן ולביולוגיה של תאי גזע.
