פרוטוקול זה מתאר מסך מדכא פשוט ויעיל לזיהוי מוטציות מדכאות במוטנטים שיש להם פגם גדילה בשמרים ביקוע. שיטות mutagenesis מסורתיות להשתמש בכימיקלים רעילים או UV שיכולים ליצור מוטציות מרובות בתא. לעומת זאת, פרוטוקול זה יכול להעשיר מוטציה מדכאת אחת בתאים בודדים מבלי להשתמש בשיטות גרימת מוטציה.
התחל הליך זה עם בניית זן והכנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיה נוזלית לכל באר של מיקרופלסטיק פוליסטירן 96 באר. עם מולך סטרילי, לקחת כמות קטנה של כל אחת מהמושבות מוכנות ולהשעות כל מושבה בארות בודדות המכילות את המדיה הנוזלית.
כלול באר ריקה עבור כל שורה בצלחת המכילה 200 מיקרוליטרים של אותה מדיה. כעת הגדר את הפרוטוקול בתוכנת זיהוי קורא הלוחות המחוברת לקורא מיקרופלסטיק אוטומטי. הגדר את הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס ולהגדיר תוכנית קינטית במשך 24 שעות עם תדירות קריאה של שתי דקות.
התוצאה היא 721 קריאות בסך הכל על פני תקופה של 24 שעות ל באר. הגדר את הרעידות לרעוד מסלול מהיר מתמשך. הגדר את הקריאות האופטיות כדי למדוד פיזור אור באורך גל של 600 ננומטר כדי למדוד צפיפות אופטית ולהגדיר את האור לקרוא מתחת לצלחת.
לאחר 24 שעות, רשום את קריאות הצפיפות האופטית הריקות הסופיות ולהשתמש בנוסחה בפרוטוקול הטקסט כדי לקבוע את עוצמת הקול הדרושה כדי לדלל כל אחת מהדגימות עד לצפיפות אופטית של 0.1. כדי לעבד באצווה את אמצעי האחסון לדילול שישמש מכל באר ניסיונית, יצא את הנתונים מתוכנה של קורא הלוחות והשתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להוסיף את אותה נוסחה כמו פונקציה. כל 24 שעות, השתמש באותה מדיה כמו יום אפס כדי לדלל כל אחת מהדגימות לצפיפות אופטית של 0.1 באמצעות הנוסחה.
הקפד להשתמש בנוסחה כדי לדלל את כל בארות עד צפיפות אופטית של 0.1. זה כולל את בארות שאולי התחילו להראות התאוששות מסוימת פגם הצמיחה שלהם. חסוך את כל עקומות הצמיחה הנוצרות מדי יום.
שים לב לכל מושבה בודדת המציגה קצב צמיחה מוגבר נשפט על ידי צפיפות אופטית סופית הגבוהה משמעותית משאר הקבוצה עם אותו רקע גנטי או על ידי עקומת גדילה הדומה לזו של מושבות מסוג בר. ההתרגם הזה נמשך בדרך כלל בין שבעה ל-14 ימים. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים.
מהיום האחרון של ההסתערות של קורא הלוחות, כמה תרבויות נוזליות יש שיעור צמיחה התאושש באופן ניכר ככל הנראה על ידי צובר מוטציה מדכאת שיכולה להקל על הפנוטיפ של המוטציה ההורית. כדי לאחסן את התרבויות התאושש פנוטיפית, להעביר ולערבב 250 microliters של תרבות נוזלית cryotube המכיל 250 microliters של 50% גליצרול. פלאש להקפיא את התאים בחנקן נוזלי ולשמור את הזנים מינוס 80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
כדי לאשר כי המוטציה מדכא הוא אלמנט תורשתי גנטית, להשתמש בשיטות חצייה גנטית סטנדרטית לחצות תאי P המוטנט האהובים עליך עם תאי S המוטנט האהובים עליך. כאשר שני תאים haploid עם סוג הזדווגות חינם מעורבבים וחשוף רעב חנקן, הם יכולים ליצור זיגוט כי sporulates כדי ליצור tetrad של ארבעה נבגים. החומרים הגנטיים ההוריים יפרידו במהלך מיוזיס בהתאם לכללי הגנטיקה המנדליאנית.
לאחר הנבג, נבגים בודדים מאותם tetrads ניתן לנתח וצור ארבע מושבות בודדות כפי שנצפה אנכית על צלחת. מניחים את הנבגים באופן שווה בזה אחר זה על הצלחת באמצעות מיקרונידל. לאחר הניתוח, להשאיר את התאים לגדול ב 30 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך כמה ימים עד מושבות להופיע.
אם המוטציה המדכאת היא יסוד תורשתי גנטית, צלב זה צריך להניב טטרדים שבהם לשתי מושבות יש את פנוטיפ החולי של הזן ההורי ושתי מושבות יש את קצב הצמיחה של זן המדכא. בחר שלוש מושבות עם פנוטיפ מדכא ושלוש מושבות עם פנוטיפ ההורים מאותו צלב גנטי ולהמשיך עם החילוץ DNA הגנומי וצעדי רצף כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן בצע ניתוח ביואינפורמטיקה לזיהוי המוטציות המדכאות כמפורט בטקסט.
עקומות צמיחה של מושבות בודדות נרשמו בנקודת הזמן הראשונית ובמשך שישה ימים עם ניטור רציף באמצעות קורא הלוחות. כצפוי, מושבות מסוג פראי לא מראות שינויים ניכרים בעקומות הגדילה שלהן לאורך כל הניסוי. יש לציין כי ארבע מושבות עם רקע המחיקה של האלף1 ומושבת מחיקה אחת של fal1 מראות שינוי דרמטי בצמיחה מצמיחה איטית לרמות צמיחה שונות הדומות לזו של מושבות מסוג פראי.
באופן דרמטי, כל המוטנטים clr6 מראים התאוששות פנוטיפית עקבית גדל בקצב מהיר יותר עד סוף ההתקנה. שניים מהשינויים הלא-נרדפים שזוהו, המוטציה cue2 והמוטציה rpl2702 שוחזרו במעבדה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור mutagenesis מכוון האתר. Cue2 שדון1 מוטנטים כפולים rpl2702 מוטציות כפולות elf1 נחצו עם זן מוטציה מחיקת שדון חינם1.
המעבר הגנטי הראה כי המוטציות המדכאות שזוהו מצליחות לדכא את הפנוטיפ הגדל באיטיות של מוטציית מחיקת שדון1 והן תורשתיות. במהלך הדילול היומי של צלחת 96 באר, חשוב לדלל את כל הבארים לאותו ריכוז על מנת למנוע התאוששות צמיחה מלאכותית. שיטה זו מאפשרת בידוד של מוטציות מדכאות באופן תפוקתי גבוה המזרז את הגילוי של מאות גנים שלא התאפיינו היטב בשמרים ביקוע ומיקרואורגניזמים אחרים.
שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד מדכאים עבור כל מיקרואורגניזמים שיש להם מוטציה הגורמת פגם בצמיחה וזה יכול להיות גדל לאוכלוסייה גדולה בתרבות הנוזלית. זיהוי מוטציות מדכאות בשמרים ביקוע יכול להיות השלכות פוטנציאליות במציאת גנים גורמי מחלות במסלולים חופפים במיוחד כשמדובר מסלולים שמורים מאוד מן השמרים לבני אדם.
