يصف هذا البروتوكول شاشة القامع بسيطة وفعالة لتحديد الطفرات القامع في المسوخ التي لها عيب في النمو في الخميرة الانشطارية. تستخدم طرق الطفرات التقليدية المواد الكيميائية السامة أو الأشعة فوق البنفسجية التي يمكن أن تولد طفرات متعددة في الخلية. على العكس من ذلك، يمكن لهذا البروتوكول إثراء متحولة القامع واحد في الخلايا الفردية دون استخدام الأساليب المحفزة للطفرات.
ابدأ هذا الإجراء مع بناء السلالات والإعداد كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام السائلة إلى كل بئر من 96 بئر البوليسترين microplate. مع قضيب عقيم ، خذ كمية صغيرة من كل من المستعمرات المعدة وتعليق كل مستعمرة في آبار فردية تحتوي على الوسائط السائلة.
وتشمل بئر فارغة لكل صف على لوحة تحتوي على 200 ميكرولترات من نفس وسائل الإعلام. الآن إعداد البروتوكول على قارئ لوحة الكشف عن البرمجيات المتصلة قارئ microplate الآلي. تعيين درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية وتعيين برنامج الحركية لمدة 24 ساعة مع تردد القراءة من دقيقتين.
وينتج عن ذلك 721 قراءة إجمالية على مدار 24 ساعة في البئر. تعيين اهتزاز إلى اهتزاز مداري سريع مستمر. قم بتعيين القراءات البصرية لقياس التشتت الضوئي عند طول موجة 600 نانومتر لقياس الكثافة البصرية وتعيين الضوء على القراءة من أسفل اللوحة.
بعد 24 ساعة، قم بتسجيل قراءات الكثافة البصرية الفارغة النهائية واستخدم الصيغة في بروتوكول النص لتحديد الحجم اللازم لتمييع كل عينة من العينات وصولاً إلى كثافة بصرية قدرها 0.1. لمعالجة دفعة وحدة تخزين التخفيف التي سيتم استخدامها من كل بئر تجريبية، قم بتصدير البيانات من برنامج قارئ اللوحة واستخدم برنامج جدول بيانات لإدراج نفس الصيغة كدالة. كل 24 ساعة، استخدم نفس الوسائط التي يستخدمها اليوم صفر لتمييع كل عينة من العينات إلى كثافة بصرية قدرها 0.1 باستخدام الصيغة.
تأكد من استخدام الصيغة لتمييع جميع الآبار وصولا الى كثافة بصرية قدرها 0.1. وهذا يشمل الآبار التي ربما بدأت تظهر بعض الانتعاش في عيب نموها. حفظ جميع منحنيات النمو التي تم إنشاؤها يوميا.
لاحظ أي مستعمرة فردية تظهر زيادة معدل النمو الحكم عليها من قبل كثافة بصرية نهائية أعلى بكثير من بقية الفوج مع نفس الخلفية الوراثية أو من قبل منحنى النمو الذي يشبه ذلك من المستعمرات من النوع البري. هذا الفحص عادة ما يستغرق حوالي سبعة إلى 14 يوما. تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة.
من اليوم الأخير من اختبار قارئ لوحة، وبعض الثقافات السائلة لديها معدل النمو تعافى بشكل ملحوظ يفترض من خلال الحصول على طفرة القامع التي يمكن أن تخفف من النمط الظاهري من طفرة الوالدين. لتخزين الثقافات المستردة بشكل ظاهري، نقل وخلط 250 ميكرولترات من الثقافة السائلة إلى أنبوب التبريد الذي يحتوي على 250 ميكرولترات من 50٪ الجلسرين. فلاش تجميد الخلايا في النيتروجين السائل وحفظ السلالات في ناقص 80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
للتأكد من أن الطفرة القامع هو عنصر وراثي وراثي، استخدم أساليب عبور الجينية القياسية لعبور الخلايا P متحولة المفضلة لديك مع الخلايا المفضلة لديك طفرات S. عندما يتم خلط اثنين من الخلايا الهابلويد مع نوع التزاوج مجانية ويتعرضون لتجويع النيتروجين، فإنها يمكن أن تولد zygote أن sporulates لتشكيل رباعي من أربعة جراثيم. المواد الوراثية الأبوية سوف فصل خلال الداء اليميني اتباع قواعد علم الوراثة مندلي.
بعد التغظ، يمكن تشريح الجراثيم الفردية من نفس رباعيات وتشكيل أربع مستعمرات فردية كما لوحظ عموديا على لوحة. وضع بالتساوي جراثيم واحدا تلو الآخر على لوحة باستخدام microneedle. بعد تشريحها، ترك الخلايا لتنمو في حاضنة 30 درجة مئوية لبضعة أيام حتى تظهر المستعمرات.
إذا كانت الطفرة القامع هو عنصر وراثي وراثي، ينبغي أن ينتج هذا الصليب رباعيات التي اثنين من المستعمرات لديها النمط الظاهري المرض من سلالة الوالدين ومستعمرتين لديها معدل نمو الانتعاش من سلالة القامع. اختيار ثلاث مستعمرات مع النمط الظاهري القامع وثلاث مستعمرات مع النمط الظاهري الوالدين من نفس الصليب الجينية والمضي قدما مع استخراج الحمض النووي الجينومي وتسلسل الخطوات كما هو مفصل في بروتوكول النص. ثم قم بإجراء تحليل المعلوماتية الحيوية لتحديد الطفرات القامع كما هو مفصل في النص.
تم تسجيل منحنيات النمو للمستعمرات الفردية في الوقت الأولي لمدة ستة أيام مع المراقبة المستمرة باستخدام قارئ اللوحة. كما هو متوقع، مستعمرات نوع البرية تظهر أي تغييرات ملحوظة في منحنيات نموها طوال التجربة. وتجدر الإشارة إلى أن أربع مستعمرات ذات خلفية حذف elf1 ومستعمرة حذف واحدة من fal1 تظهر تحولاً كبيراً في النمو من النمو البطيء إلى بعض مستويات النمو المختلفة المماثلة لتلك التي في مستعمرات الأنواع البرية.
بشكل كبير، تظهر جميع المسوخ clr6 انتعاش الظاهري ثابت ينمو بمعدل أسرع بحلول نهاية الفحص. تم إعادة بناء اثنين من التغييرات غير مترادفة التي تم تحديدها ، طفرة cue2 وطفرة rpl2702 في المختبر باستخدام بروتوكولات قياسية لطفرات الموقع الموجهة. تم عبور Cue2 elf1 المسوخ المزدوجة وrpl2702 elf1 mutants المزدوجة مع سلالة متحولة حذف elf1 المجانية.
وأظهرت الجينية العبور أن الطفرات القامع التي تم تحديدها ناجحة في قمع النمط الظاهري بطيئة النمو من elf1 حذف متحولة وقابلة للوراثة. خلال التخفيف اليومي من لوحة 96-جيدا، من المهم أن تمييع جميع الآبار إلى نفس التركيز من أجل تجنب انتعاش النمو الاصطناعي. هذه الطريقة تسمح لعزل الطفرات القامع في طريقة إنتاجية عالية تسريع اكتشاف مئات الجينات التي لم تتميز بشكل جيد في الخميرة الانشطار والكائنات الدقيقة الأخرى.
يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل القامع لجميع الكائنات الحية الدقيقة التي لديها طفرة تسبب عيب في النمو والتي يمكن زراعتها إلى عدد كبير من السكان في الثقافة السائلة. تحديد الطفرات القامع في الخميرة الانشطارية يمكن أن يكون لها آثار محتملة في العثور على الجينات المسببة للأمراض في مسارات متداخلة خاصة عندما يتعلق الأمر بمسارات عالية الحفظ من الخميرة إلى البشر.
