תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע ICT (2016R1A2B2006354).

1. הכנת מדיה
<ol><li>להכין תמצית שמרים עם תוספי מזון (כן), כן ללא אדנין (כן נמוך אייד), בינוני הביקוע גלוטמט (PMG12), וכן PMG ללא אדנין (PMG-אייד) על ידי ערבוב המרכיבים כפי שמתואר בטבלה 1. כן-אייד (איד נמוכה) ו לוחות PMG איד יש את כל המרכיבים אותו, אבל אדנין מושמט מן האחרון.<ol>
<li>השתמש המניה מלח (50 x) הבאות: 52.5 g/L MgCl2·6H2O 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 גרם/ליטר אשלגן כלורי, 2 g/L נה2כך4 ב מים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>השתמש ויטמין הבאים (1, 000 x) מניות: 1 g/L pantothenate 10 גרם/ליטר nicotinic חומצה, אינוסיטול 10 גרם/ליטר, ביוטין 10 mg/L במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>השתמש המינרל הבאים (10, 000 x) מניות: חומצה בורית 5 g/L, MnSO 4 g/L4,4·7H ZnSO 4 g/L2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, MoO 0.4 g/L3, 1 g/L קי, 0.4 g/L CuSO4·5H2O , 10 גרם/ליטר חומצת לימון במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C. הערה: בינוני נוזלי כן יכולה להיעשות על-ידי השמטת את אגר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אוטוקלב המדיום לקרר אותו אל מתחת 60 ° C תוך כדי ערבוב עם בר stir, בקצב של 200 סל ד.</li>
	<li>עבור לוחות כן + G418 (geneticin), להוסיף 1 מ"ל/L G418 פתרון מניות המדיום. כן.<ol>
<li>להשתמש את G418 הבאים (1, 000 x) מניות: 100 מ"ג/מ"ל G418 במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר, aliquot 1.5 mL צנטריפוגה צינורות, חנות ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מערבבים עוד 5-10 דקות, aliquot התקשורת 90-מ מ פטרי (1 ליטר של aliquots בינוני עד בערך 40 פטרי. חנות את הלוחיות ב 4 º C.</li>
</ol>2. שיבוט של rpt4 + ו שלה 5' / 3' UTRs
<ol><li>לבצע PCR עם תחל p1 ו- p2 (איור 1 א') באמצעות ביקוע שמרים הדנ א (gDNA) כמו התבנית הנפח הכולל של 50 µL (~ 1 µg ה-DNA, האנזים U 20, 1 x תגובת מאגר), ולאחר החלת את מחזורי התגובה המתוארות בטבלה 2 כדי להגביר 3,315-בסיס פרגמנט זוג (bp) הכוללת rpt4 + ו שלה 5' / 3' UTRs. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות של ערכת טיהור13 לפי הוראות היצרן (איור 1 א').</li>
	<li>לעכל את וקטור KS(-) pBlueScript14 ו את מקטע ה-DNA מוגבר המכיל rpt4 + עם שלה 5' / 3' UTRs עם BamH1 ו Xho1 ב הנפח הכולל של 20 µL (DNA ~ 1 µg, אנזים U 20, 1 x עיכול מאגר) ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך 16-18 h (איור 1B).</li>
	<li>ג'ל לטהר את הווקטור מעוכל (1.2% agarose ג'ל) והכנס את הדנ א על ידי ביצוע מבוסס-טה agarose בג'ל (100 וולט, 1 h), excising הלהקות הדנ א של גודל הרצוי לבודד את ה-DNA עם ערכת חילוץ ג'ל15.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את וקטור והוספה הדנ א באמצעות T4 DNA ליגאז על-ידי ביצוע תגובה מצדו 20-µL המכיל 50-100 ננוגרם של וקטור ה-DNA, ~ 3-fold טוחנת עודף של ה-DNA של הוספה, 400 U T4 DNA ליגאז 1 x מאגר מצדו. דגירה תערובת זו ב 18 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
	<li>להפוך את ה-DNA מחוברים µL 100 של e. coli DH5α על-ידי החלת הלם חום עבור 70 s-42 ° C. להוסיף 1 מ"ל של ליברות, תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס להתאוששות. לבצע צנטריפוגה (13,800 x g), למחוק את הצלחת supernatant, כל טרנספורמציה e. coli תאים על צלחות LB-אמפיצילין (LA), של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.</li>
	<li>לבחור 4-8 מושבות עם קיסמים ולגדול בן לילה ב 37 ° C 3 מ ל LA בינוני.</li>
	<li>לבודד את פלסמידים עם פלסמיד טיהור ערכת16 בשימוש על פי הפרוטוקול של היצרן ולבצע digestions אנליטית אנזים הגבלה עם 5 µL של פלסמיד מבודד, 5 U של כל אנזים הגבלה (BamH1 , Xho1) ו- 1 x מאגר ההגבלה. דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים עבור 3 ח' אשר השיבוט על-ידי קביעת רצף המועמד פלסמידים.</li>
</ol>3. החדרת מוטציה שקטה (Xho1 הגבלת האתר)
<ol><li>עיצוב זוג תחל 33-bp (p3 ו- p4) המכילים את השינוי הרצוי ברצף אחרת משלימים.</li>
	<li>לבצע PCR עם אמינות גבוהה פולימראז17 (איור 1C) בהנפח הכולל של 25 µL (10 ng של פלסמיד משובטים, 2 µL pmol פריימר מיקס 10, אנזים U 2, 1 x תגובת מאגר) באמצעות אופניים הפרמטרים המפורטים בטבלה3.</li>
	<li>לעכל את פלסמיד תבנית עם Dpnאני בהנפח הכולל של µL 20 (20 U אנזים, 1 x עיכול מאגר) ב- 37 מעלות צלזיוס ב מים אמבט 1 h.</li>
	<li>לשנות, להפיץ, לבודד, רצף של פלסמיד המכיל את מוטציה שקטה, כמתואר בצעדים 2.5-2.7. הערה: מוטציה שקטה יכולה גם הציג באמצעות שיטת השיבוט המאפשר חיבור שברי DNA מרובים התגובה יחיד18.</li>
</ol>4. אקראי מוטגנזה מכוונת של rpt4 + מאת PCR לשגיאות
<ol><li>לבצע PCR לשגיאות, באמצעות פלסמיד את המוטציה שקט (אתרXho1 ) התבנית, תחל p5 ו- p6, הנפח הכולל של 50 µL (כמות תבנית מוגדרת בשלב 4.1.1, 2 µL 10 pmol פריימר מיקס, אנזים U 2.5, מאגר התגובה x 1) , ואת פולימראז מיוחד אשר נועד ליצור שגיאת גבוה שיעור19 (איור 1D). לבצע PCR כפי שמתואר בטבלה 2.<ol>
<li>השתמש µg 4-5 של תבנית פלסמיד לשלוט תדירות מוטציה ל bp 1/kb (kilobase). הערה: ריכוז גבוה (> 500 ng/µL) של פלסמיד, אשר ניתן לקבל באמצעות ערכת הכנה מיני20, נדרש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשתמש בג'ל כדי לאשר מוצר ה-PCR של 2670 bp (1.2% agarose ג'ל). ג'ל לטהר המוצר PCR כפי שמתואר בשלב 2.5.</li>
</ol>5. הכנה של פיוז'ן PCR קטעים (קאן, 3' UTR)
<ol><li>לבצע PCR באמצעות pFA6a-KANMX621 תבנית, תחל p7 ו p8, התנאים המפורטים בטבלה 4 כדי לקבל השבר סמן (קאן). ג'ל לטהר השבר 1,480-bp וכתוצאה מכך כפי שמתואר בשלב 2.5 (איור 1E).<ol>
<li>בדוק אם stop codon של הגן שמיועד מוטציה ובאזור קידוד של גנים סמוכים שלה מופרדים על-ידי יותר מ-500 bp. לא ניתן להשתמש המחסל אנדוגני כאשר אזור זה הוא פחות מ 500 bp; במקום זאת, המחסל ADH אמור לשמש במקום המחסל אנדוגני. השינויים פרוטוקול נדרש להשתמש המחסל ADH מוצגים בטבלה 5. הערה: שינויים אלה חל רק כאשר המחסל ADH , אשר זמין פלסמיד pFA6a-3HA-KANMX6, משמש במקום המחסל אנדוגני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע PCR עם משובטים rpt4 +-שמכיל וקטור p9 תבנית ואת צבעי בסיס, p10 ב הנפח הכולל של 50 µL (20 ng את פלסמיד משובטים, 2 µL pmol פריימר מיקס 10, אנזים U 2, 1 x תגובת מאגר), להשתמש בתנאים המוצגים טבלה 6. ג'ל לטהר שהושג 506-bp 3' UTR השבר (איור 1E).</li>
</ol>6. דור של הבונה השינוי על ידי היתוך PCR (איור 1E)
<ol><li>להכין את השברים 3 (mutagenized rpt4 +קאן, את 3' UTR) ב- 50 ng/µL.</li>
	<li>לבצע היתוך ש-PCR של השלושה קטעים באמצעות תחל p11 ו- p12, כפי שמתואר בטבלה 7. (הפרוטוקול עבור פיוז'ן PCR הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי22). לטהר המוצר העיקרי של ה-PCR 4,398-bp.<ol>
<li>השתמש rpt4 +: KAN:3'UTR קטעים ביחס של 1:3:1 לקבלת תוצאות אופטימליות. הערה: הסכום הכולל של ה-DNA הוספה לא יעלה על 500 ng. הכמות המומלצת של rpt4 +: KAN:3'UTR הוא 50 ng:150 ng:50 ng. האזור mutagenized הוא כ- 1.6 קילו, אז המספר המינימלי של מושבות שמרים זה היה חשבון על כל השילובים האפשריים של כל בסיס להיות מוטציה לשלושה האחרים הוא 1,600 x 3 = 4,800 מושבות. כי התגובה טרנספורמציה אחת מניבה בדרך כלל המושבות 400-500, התגובות לפחות 10 שווה של פיוז'ן PCR לבנות נדרשת. צורך זה יכולים להתקיים על ידי פשוט הגדלת הסכום התגובה (קרי, מספר המבחנות) לפי פקטור של 10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. שינוי של שמרים ביקוע על ידי אלקטרופורציה (איור 1F)
<ol><li>לחסן שמרים עד 10 מ"ל של כן בינוניים עד רוויה מאת המקננת זה עבור יותר מ 16 h.</li>
	<li>לדלל לתאים צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.2 ב 200 מ ל כן בינוני דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות עבור h 5-6, כדי OD600 = 0.6 - 0.8.</li>
	<li>להתרכז לתאים OD600 = 30, לוותר על ארבעה צינורות חרוט 50-mL ולהירגע על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>לקצור את התאים על ידי ביצוע צנטריפוגה ב 1,050 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות, אלקטרו 10-וואקום על קרח. בצע את השלבים 7.3-7.8 על קרח.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע והוסף 15 מ"ל של 1.2 מ' בסורביטול. ללחוץ בעדינות את הצינורות כדי resuspend את התאים.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב- g x 1050 עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חזור על שלבים 7.4 ו- 7.5. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 500 µL של 1.2 מ' בסורביטול כל שפופרת, resuspend את התאים, וכן לאסוף את כל התאים אחד צינור חרוטי 15-ml.</li>
	<li>להוסיף בסורביטול 1.2 מ' עד 2.4 מ ל (OD600 = 10 0.2 מ"ל). שמור את הצינורית על קרח.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של תאים בסורביטול-הושעתה (ודא שהם מושעים באופן מלא) צניעותו EP המכיל הפיוז'ן PCR לבנות, מערבבים היטב, להעביר את הדגימה אלקטרו-cuvette.</li>
	<li>Electroporate התאים עם האפשרויות הבאות: פטריות, ShS (2.00kV, הדופק 1).</li>
	<li>להוסיף µL 600 של 1.2 מ' בסורביטול כל אלקטרו-cuvette עבור הנפח הכולל של 800 µL, ופרש לאחר מכן התאים על כן ארבעה לוחות (µL 200/צלחת). אלקטרו עשר-וואקום אחלק ל-40 כן צלחות.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לבצע ציפוי משוכפל כדי כן + G418, דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.</li>
</ol>8. מבחר של יציב הטרוכרומטין מוטציות, בדיקת תוצאות חיוביות שגויות
<ol><li>על כל צלחת כן + G418, לבצע ציפוי משוכפל כן-אייד (איד נמוך), צלחות PMG-אייד (לא אייד). תקופת דגירה הלוחות עותק משוכפל של 1-2 ימים ב- 30 מעלות צלזיוס, עד הופעה כלשהי של המושבות על לוחות כן-אייד צבע אדום (איור 1 ג'י).</li>
	<li>להשוות לוחות כן-אייד ואייד PMG ותאים בחר להראות ורוד או לבן על הצלחת. איד. כן, גם לגדול על הצלחת PMG-אייד. אל תבחר מושבות ללא גידול על PMG-אייד, כפי שהם תוצאות חיוביות שגויות (למשל, המשקף הקלטת קאן משולב באתר-יעד בחלקים אחרים של הגנום).</li>
	<li>לאסוף כ עונה 1 פרק 105 תאים מהמושבה לכל, דגירה ב 10 µL של SPZ, לאודנום zymolyase 2.5 mg/mL 100 T ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות שימוש 1 µL של פתרון זה לבצע כתבנית המוצא המושבה PCR (איור 1 H).<ol>
<li>להפוך SPZ (50 מ"ל) על ידי ערבוב 30 מ של 2 מ' בסורביטול, 4.05 מ של 1 מ ' נה2HPO4, mL 0.95 NaH2PO4 ו-15 מיליליטר מים מזוקקים (pH הסופי, 7.5). (5 מ"ל) יכול להיות בתוספת zymolyase ודוגמאות המאוחסן ב- 500-µL aliquots ב-20 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע בג'ל (1.2% agarose ג'ל, 180V, 20 דקות) כדי להמחיש את התוצאות של + המושבה ה-PCR. בחר תגובות תערוכת ה-PCR להקות של גודל תקין ולעכל 5 µL של כל מוצר התגובה עם Xhoאני (4 U אנזים 1 x עיכול מאגר, תנורים 37 ° C, 1 h) לסנן תוצאות חיוביות שגויות (איור 1 H).</li>
	<li>לבצע בג'ל להמחיש את מעכל XhoI (1.2% Agarose ג'ל, 180 V, 20 דקות). סמן את המושבות שמוצריהן PCR נחתכים על ידי XhoI, לרפא אותם ללוחות כן + G418 (איור 1I).</li>
	<li>לבודד gDNA מתאי שמרים ביקוע ולבצע רצף של מוצרי ה-PCR23. להשוות את הרצף שהושג עם הרצף פראי-סוג כדי לזהות מוטציות (איור 1I).</li>
	<li>ישירות מחדש מציגים את mutation(s) פראי-סוג תאים על-ידי הפיכתם עם בונה פיוז'ן מוגבר על ידי ה-PCR של תאים מוטציה23. כדי לאשר את פנוטיפ בתאים מוטציה עשה לאחרונה (איור 1J) לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט הבחינה.<ol>
<li>פיוז'ן שינוי המבנה יכול להיות בקלות מוגבר על ידי PCR עם תחל p1, p10 באמצעות ה-DNA גנומי של מוטציות כמו התבנית הנפח הכולל של 50 µL (~ 1 µg ה-DNA, האנזים U 20, 1 x תגובת מאגר), וליישם את מחזורי התגובה המתוארים בטבלה 2 . טרנספורמציה של הבונה יכול להיעשות על-ידי ביצוע השלבים הבאים 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+model+of+error-prone+PCR.">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+induced+by+ultraviolet+light.">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).</li><li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms.">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li><li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+shuffling+works.">How DNA shuffling works.</a> Science. 293 (5528), 237 (2001).</li><li>Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+26S+Proteasome+subunit+RPT4a+regulates+ToLCNDV+transcription+and+activates+hypersensitive+response+in+tomato.">Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato.</a> Sci Rep. 6, 27078 (2016).</li><li>Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sug1+modulates+yeast+transcription+activation+by+Cdc68.">Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68.</a> Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gal4+activation+domain+binds+Sug2+protein,+a+proteasome+component,+in+vivo+and+in+vitro.">The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro.</a> J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).</li><li>Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+mutants+that+alleviate+transcriptional+silencing+in+centromeric+flanking+repeats+and+disrupt+chromosome+segregation.">Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation.</a> Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).</li><li>Grewal, S. I., Jia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+revisited.">Heterochromatin revisited.</a> Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).</li><li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> pBlueScript II Vector. , (2005).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gibson Assembly Master Mix. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).</li><li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Szewczyk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+PCR+and+gene+targeting+in+Aspergillus+nidulans.">Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).</li><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fission Yeast Handbook. , (2000).</li><li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast.">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li><li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterisation+of+temperature+sensitive+mutants+of+genes+encoding+the+fission+yeast+spindle+pole+body.">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).</li><li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+by+PCR.">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מוטגנזה מכוונת אקראית באמצעות PCR לשגיאות הוא כלי רב עוצמה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות באזור נתון. טכניקה זו שימושית במיוחד עבור מחקרים אשר מבקשים להעריך את הפונקציה של חלבון תחת נסיבות מסוימות. לדוגמה, במסמך זה השתמשנו PCR לשגיאות כדי להעריך את תפקוד 19 פרוטאוזום יחידה משנית, Rpt4, בתחזוקת הטר...

גנטיקה קדימה היא שיטה קלאסית שבה חוקרים לחפש מוטנטים המתרחשים באופן טבעי המציגים פנוטיפ מסוים, ואת לבצע ניתוח גנטי. גנטיקה הפוכה, מוטציות יוכנסו הגן עניין, פנוטיפ נבדק. במקרה האחרון, מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים יעד משמש לעתים קרובות כדי ליצור מאגר של מוטציות נבחרו לאחר מכן עבור פנוטיפים הרצויה, כגון רגישות טמפרטורה או שינו את פעילות אנזימטיות. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להשיג מוטגנזה מכוונת אקראי, כולל PCR לשגיאות1; הקרנה UV2; מוטגנים כימיים, כגון אתיל methanesulfonate (EMS) או חומצה חנקיתית3; השימוש של זנים הנתונים זמניים, כגון אלה יתר לבטא mutD5 4; וסדר דנ א5.
כאן, אנו מתארים אסטרטגיה הפוכה-גנטיקה שבו אנו מנצלים PCR לשגיאות לייצר בריכות מוטציה גן המטרה שמרים ביקוע. כפי שאפשר לנחש מהשם שלו, שיטה זו יוצר מוטציות על ידי בכוונה הצגת שגיאות במהלך ה-PCR. בניגוד לשיטות אחרות מוטגנזה מכוונת, PCR לשגיאות מאפשר למשתמש להגדיר את האזור כדי להיות mutagenized. זה עושה את זה שימושי במיוחד המאמצים לחקור את הפונקציה של חלבון/תחום עניין.
כדי להדגים את הפרוצדורה מוטגנזה מכוונת אקראית זו, אנו בזאת השתמש rpt4 +, שמקודד את יחידת משנה פרוטאוזום 19, כדוגמה. Rpt4 הוכח יש פונקציות proteolysis תלויית אורגניזמים שאינם ביקוע שמרים6,7,8,9, פגם proteolysis עלול לגרום השפעות עקיפות על ידי שינוי חלבונים רמות. לפיכך, אנו, איבחון מוטציות שהפעיל שינויים proteolysis עצמאית, במטרה לחקור את תפקוד פרוטאוזום על הטרוכרומטין.
PCR לשגיאות ניתן ליישם בכל אזור הגן על-ידי כוונון המיקום שבו לאגד צבעי יסוד. ניתן לזהות מוטנטים כי התערוכה פנוטיפי לשינוי המיוחל עם כתבים המתאים. כאן, אנחנו מנוצל של הכתב ade6 + הוספת תאים 1 החיצוני חוזרים על עצמם (otr) אזור10. הטרוכרומטין מכוננת נוצר ב אזור זה11, אז הכתב ade6 + מושתק במצב פראי-סוג; זה מסומן על ידי מושבות אדום10. מוטציה אשר שיערער את הטרוכרומטין מכוננת על תאים יוביל הביטוי של ade6 + הכתב, אשר הוא מדמיין בתור מושבות לבן.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Enzyme reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>For error-prone PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>For general PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen square, black</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>For replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>For replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652086&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>For fusion PCR ramp reaction&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים היעד משמשת לזיהוי מוטציות תשואה של פנוטיפ הרצוי. שיטות העשויות לשמש להשגת מוטגנזה מכוונת אקראי, PCR לשגיאות היא אסטרטגיה נוחה ויעילה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות (כלומר., ספרייה מוטציה). PCR לשגיאות הוא שיטת הבחירה כאשר חוקר מבקש להפוך למוטציות אזור מוגדרים מראש, כגון האזור קידוד של הגן תוך השארת אזורים אחרים גנומית מעושה. לאחר ספריית מוטנטים מוגבר על-ידי ה-PCR לשגיאות, זה חייב להיות משובטים לתוך פלסמיד מתאים. הגודל של הספרייה שנוצר על ידי ה-PCR לשגיאות מוגבל בשל היעילות של השלב שיבוט. עם זאת, בשמרים ביקוע, שמר הביקוע, הצעד השיבוט יכול להיות מוחלף על ידי שימוש יעילים ביותר בשלב אחד פיוז'ן PCR כדי ליצור מבנים לשינוי. מוטציות של פנוטיפים הרצוי ייתכן ואז שנבחר באמצעות עיתונאים המתאים. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה הזאת בפירוט, לוקחים כדוגמה, כתב להוסיפה אצל הטרוכרומטין centromeric.

המוטציות Rpt4 שנרכש על-ידי ביצוע ההליכים המתוארים באיור 1 ניתן לנתח אותם על-ידי הערכת את הצבעים של המושבות. הצבעים של המושבות הם הבחינו על גבי הלוחות הרלוונטיים ומקטין את המספר באיור2. הכתב ade6 + להוסיפה אצל באזור הטרוכרומטין מושתק בפראי-?...

Watch this Scientific Journal Video about Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast at JoVE.com

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K Views.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

Video: Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biology

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב

ממוקד

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ"א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב

בימוי שיטת אבולוציה

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה