Name: rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

מחקר במעבדה CJN נתמך על ידי מענקים הפועלים מNSERC, הקנדי למלחמה בסרטן אגודת מכון המחקר (CCSRI), והשד הקנדי קרן למלחמה בסרטן (BC-יוקון סניף).

הערה: העבודה הכללית של הליך זה מתואר באיור 2. 1. קביעת מינון צמיחה-מעכבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תרבות לילה שמרים הערה: תקשורת שמרים-תמצית-peptone דקסטרוז הצמיחה (YEPD) שימוש בפרוטוקול זה היא מתכון סטנדרטי 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את BY4741 (his3 מאטה Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) תאים על צלחת אגר YEPD דגירה במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס או עד מושבות גלויות טופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות לילה בלחסן 5 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD בכלי תרבות סטרילי עם מושבה אחת. דגירה הלילה בשעה 30 ° C עם סיבוב רציף או רועד. התרבות בדרך כלל תגיע לרוויה בבוקר (~ 2 × 10 8 תאים / מיליליטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה אגר מוצקה המכילים מינונים שונים כימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמה מניות שלהכימי להיבדק ב100x ריכוז סופי רצוי בממס מתאים. הערה: ריכוזים אפקטיביים יהיו תלויים בחומר הכימי, ויש לקבוע באופן אמפירי. אי לכך, מומלץ תחילה לבחון מגוון רחב ריכוז סופי, כלומר, ממיקרומטר הנמוך לגבוה מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק, aliquot 3 מיליליטר של אגר YEPD המותך לכמה צינור תרבות סטרילי. מקום באמבט המים C ° 55 כדי לשמור לחיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק להוסיף 30 μl של מתחם 100x לתקשורת מותכת, מערבולת 2-3 שניות כדי לערבב, ופיפטה 1 מיליליטר לכל זוג של בארות כפולות בצלחת 12 גם. הקפד לכלול רכב רק שליטה. לאפשר צלחות להגדיר לילה בטמפרטורת חדר. לבטל את כל אמצעי תקשורת נוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי התפשטות ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD עם 2 μl של תרבית שמרים רוויה, גדל הלילה כמו בשלב 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 25 μl של תרבית שמרים מדוללת היטב, להתפשט באופן שווה באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית או מוט, ולאפשר את הצלחת לייבוש תחת אש. דגירה צלחת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הצמיחה של שמרים (גם מספר והגודל כולל של מושבות) על הצלחות. בחר ריכוז תת-קטלני של מתחם שלא לעכב את הצמיחה על ידי יותר מ 10% -15% כדי לבצע את המסך. </li></ol></li></ol> 2. מסך כימי גנטי שיטתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה של מחיקת מוטנטי-מערך (DMA) והכנה של צלחת המקור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיאור מפורט על בניית מערכי מוטציה מחיקה ממניות גליצרול עיין et al Baryshnikova. 14. ברגע שמוטציות מחיקה כבר ערוכות בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת, DMA יכול להיות מאוחסן במשך כמה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. לשכפל על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 כנדרש כדי למנוע ממושבות גדלו לתוך כלאחר. יש להימנע משוכפלים סידוריים מרובה על מנת למנוע אובדן של זנים גדלו איטיים ולצמצם את המראה של מוטציות מדכאת: הערה. זה רלוונטי במיוחד אם שמירת האוספים כhaploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל שלבי העתק-הציפוי באמצעות חיידקים עֲרִיכָה מערכת רובוטית. לחלופין, לתפעל ערוך מושבות באמצעות כלים pinning ידניים. הערה: אוסף שמרי המחיקה זמין כhaploids וdiploids ממספר מקורות מסחריים ונשלח בדרך כלל כמניות גליצרול ב96-גם צלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוי מערך המוטציה המחיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 250 מיליליטר של תקשורת אגר YEPD המכילה 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. הריכוז היעיל של G418 עשוי להשתנות וכל מגרש יש לבדוק באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חמש צלחות אגר YEPD על ידי שפיכת 50 מיליליטר של אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 לכל צלחת. האם יום אחד זה לפני עיבוי המערך ולאפשר הצלחות להתקרר בטמפ &#39;החדרerature לילה על אף משטח שטוח. הערה: ארבע צלחות תידרש לאיסוף בצפיפות 1,536 מתח, הצלחת החמישית היא שפך כתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 16 צלחות פטרי המכילות את אוסף מחיקת המוטציה בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת ולאפשר להגיע לטמפרטורת חדר (~ 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב כל עיבוי שנוצר על המכסה של כל צלחת באמצעות משימה עדינה לנגב. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לטיפי מים שהופקדו על המערך וזיהום צולב של מוטנטים ערוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט מערך תולה חיידקים, להתעבות DMA מצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת (16 צלחות פטרי) ל1,536 מושבות בכל צלחת (4 צלחות פטרי). לבצע את זה כדי שמושבת -1 מפינים 1 הצלחת לחתור עמודה 1 1 של מערך תמצית, המושבה -1 בצלחת 2 לחתור 1 טור 2, המושבה -1 בצלחת 3 לחתור 2 ועמודה 1, ו המושבה -1 בצלחת 4 לחתור 2עמודה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך המאוחד על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את המערך כדי להבטיח העברה אחידה של מושבות מצלחות מקור. תהיה כמה עמדות ריקות, שהתאגדו בכוונה תחילה את המערך, המשמשים כמדריך כדי להבטיח את DMA כבר מרוכז בצורה נכונה (איור 4 א). הערה: אלה יהיו צלחות המקור לציפוי העתק על גבי מדיה המכילה את תרכובת המבחן. צלחת מקור יחידה יכולה לשמש לpinnings מרובה. גם רובוטים רבים יהיו תכונת קיזוז, אשר תבטיח מספרים דומים של שמרים מועברים בכל פעם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך מוטציה מחיקת צלחת Replica <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 700 מיליליטר של שליטה (רכב בלבד) ו -700 מיליליטר של תקשורת הניסיונית (המכיל כימית). זה מספיק לביצוע assay בשלושה עותקים (12 צלחות לכל מצב, בתוספת שתי תוספות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50 מיליליטר של אגר YEPD מכיל כימי מבחן או שליטה לכל צלחת. לאפשר t הצלחותo להתקרר בטמפרטורת חדר למשך לילה על אף משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברובוט לצלחת העתק, לחסן DMA על שלושה סטים של צלחות המכילות כימיקלים בריכוז בניסוי הנחוש, כמו גם שלושה סטים של צלחות המכילות שליטה ברכב. דגירה צלחות בטמפרטורת חדר למשך 24-48 שעות. </li></ol></li></ol> 3. צלחות הדמיה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות מהחממה ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר (~ שעה 1) לפני ההדמיה. זה ימנע עיבוי מ טביעה בזמן ההדמיה הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תמונה ב 24 ו 48 שעות על ידי הסרת המכסה והצבה עם פנים כלפי מטה על סורק למיטה שטוח. צלם תמונות ברזולוציה של לפחות 300 dpi. לחלופין, להשתמש במצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונות. אם כך צלחות מקום, עם הפנים כלפי מעלה על רקע כהה ולהסיר את המכסים לתמונה. הערה: תבנית הקובץ והמיקום של צלחות תהיה תלויה בתכנית הכימות בשימוש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות והשוואה של גדלי מושבה מערך באמצעות אחד מכמה תוכנות קוד פתוחות, כוללים 15 &quot;שטויות, SGAtools 16, וScreenMill 17. </li></ol> 4. אישור של מסך הערה: בשלב זה מוטציות כמה מחיקות שמרים את הציון רגישה כמו לכימי של עניין. אינטראקציות כימיות-גנטי אלה חייבים להיות מאומתים הבאות בשתי דרכים. ראשית את זהותו של זנים רגישים צריכה להיות מאושרת על ידי PCR. שנית, רגישות כימית חייבת להיות הבקיע באופן עצמאי. המפורטים להלן הוא פרוטוקול קצר לביצוע מבחני איתור כדי לאמת את רגישות יתר לחץ, טכניקה נפוצה בשמרי ביולוגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את מוטציות רצויה (רגישות יתר) מאוסף מחיקת השמרים על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עד טופס מושבות. ודא גנוטיפ של המתח על ידי PCR עם פריימרים אבחון על פיהפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של נוזל YEPD עבור כל זן ודגירת הלילה בשעה 30 ° C עם רוטציה או רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד OD 600 ולדלל כל זן לOD 600 = 1 בסטרילי DH 2 O. אלה נמצאים כעת תרביות שמרים מנורמלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על שמרים מנורמלים wild-type (BY4741) תרבות 100 μl ולA1 של צלחת 96-היטב. לוותר של עד שבעה זנים נוספים 100 μl לבארות B1-H1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettor רב-ערוצי לוותר 90 μl של סטרילי DH 2 O לבארות A2-H2 דרך A6-H6. לבסוף, להכין סדרה של דילולים 1:10 תרבויות שמרים מנורמלות. התחל על ידי סדרתי pipetting 10 μl של עמודת 1 לעמודה 2 עם pipettor רבי ערוצים, ותמשיך על פני הצלחת 96-היטב עד שישה דילולים נעשים (כלומר, 10 0-10 -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 2-5 μl של תרבויות שמרים מדוללים ברשת באמצעות רב-ערוציpipettor על גבי מדיה מוצקה YEPD מכילה שליטה כימית ורכב. דגירה צלחות בטמפרטורה המתאימה ל24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחות ולהשוות את הרגישות של מוטציות בחרו לכימי (יחסית לBY4741 שליטה). צלחות תמונה ב 24 ו -48 שעות כמו בשלב 3.2. הערה: בעוד שזיהוי של מספר זנים רגישים עם אונטולוגיות גן קשור או פונקציות מעניק ביטחון לתוקף של המסך, הפיכתו של זן מחיקה רגיש עם פלסמיד המכיל עותק wild-type של הגן נדרש לקבוע רשמית כי גן מחיקה של עניין (ומוטציות אתר השניה לא מוסתרות) גורם לרגישות לסמים. </li></ol>

<ol>
	<li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis.">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome.">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast.">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action.">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30 (2010).</li><li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries.">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides.">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li><li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast.">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+(SGA)+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe.">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li><li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balony:+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments.">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).</li><li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SGAtools:+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens.">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li><li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScreenMill:+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement,+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data.">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).</li><li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil:+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies.">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li><li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth:+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents.">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li><li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunSpec:+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast.">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li><li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology+annotations+at+SGD:+new+data+sources+and+annotation+methods.">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li><li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs.">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell.">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li><li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleosome+function:+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants.">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

מתואר כאן הוא גישה ליצירת פרופילי אינטראקציה כימית-גנטית. השיטה היא פשוטה: על ידי השוואת גדלי מושבה של כל זן באוספי מחיקת גן מקיפים בנוכחות והיעדרות של חומר כימי, כל הגנים הדרושים כדי לסבול עלבון כימי מזוהים. ניתוח העשרת ביאור של הרשימה של זנים רגישים וכתוצאה מכך לאחר...

הכלים ומשאבים זמינים באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae הגנטיים אפשרו מחקרי גנומיקה התפקודית בקנה מידה גדולה שביחד מספקים תובנה חדשה איך גנים לתפקד כרשתות כדי למלא את הדרישות של מערכות ביולוגיות. אבן הפינה של כלים אלה הייתה היצירה המשותפת של סט שלם של מחיקות גן שאינו חיוניות של כל מסגרות הקריאה הפתוחה בשמרי 1,2. תצפית מדהימה הייתה שרק ~ 20% מגנים של שמרים נדרשים לכדאיות כאשר גדלו כhaploids בתנאי מעבדה סטנדרטיים. זה מדגיש את יכולתו של תא לחיץ נגד הפרעות הגנומי באמצעות הניצול של מסלולים ביולוגיים חלופיים. מוטציות גנטיות כי הן מבחינה אישית, אך קטלניות בשילוב, לאותת מסלולים ביולוגיים מקבילים מחוברים או מתכנסים ויוצרות רשתות אינטראקציה גנטיות המתארות פונקציה ביולוגית. עם התפתחותה של te המותנהאללים mperature רגישים וhypomorphic של גנים חיוניים הטכנולוגיה לא מוגבל למחקר של גנים שאינם חיוניים 3,4. מושג זה יושם בקנה מידה הגנומי לייצר מפת אינטראקציה גנטית משוחדת הממחישה את הגנים מעורבים בתהליכים תאיים דומים להתקבץ יחדיו 5. הפרעות כימיות של רשתות גנטיות מחיקות גן לחקות (איור 1) 6. שאילתות תרכובות צמיחה מעכבת כנגד מערך צפיפות גבוהה של זני מחיקה לרגישות יתר מזהה פרופיל אינטראקציה כימית-גנטי, כלומר רשימה של גנים שנדרשו לסבול מתח כימי. כמו אינטראקציות גנטיות, מסכי בקנה מידה גדולה של ספריות כימיות הראו כי תרכובות עם מצב דומה של אשכול פעולה יחד 7. לכן, על ידי הקמת פרופיל האינטראקציה הכימית-גנטית של מתחם המצב של פעולה ניתן ללמוד על ידי השוואתו עם larאינטראקציה גנטית וכימית סינתטית ge בקנה המידה גנטית מערכי נתונים 8,9. מסכי כימיים-גנטית בקנה מידה גדול, שבו עשרות רבות של תרכובות נחקרו, בוצעו על ידי מבחני תחרות ברקוד. בגישה זו, האוסף המשולב של זני מחיקה הוא גדל בהמוניהם לכמה דורות בנפח קטן של מדיה המכילה חומר כימי. מאז כל מוטציה מחיקת נמלים ברקוד גנטי ייחודי, את הכדאיות / הצמיחה של מוטציות בודדות בתוך הבריכה של זני מחיקה היא מעקב על ידי microarray או תפוקה גבוהה רצף 10. הסיק כושר על ידי ניטור גודל מושבה של מוטציות ערוכות מבחינה פיזית גדלו על אגר מוצק המכיל תרכובת ביו-אקטיבית הוא גם שיטה יעילה לזיהוי אינטראקציות כימיות-גנטי 11,12. גישה זו מספקת חלופה חסכונית להקרנה מבוססת תחרות והוא גם מתאים למנסה לאמוד ספריות קטנות של כימיקלים.מתואר כאן היא מתודולוגיה פשוטה להפקת רשימה של אינטראקציות כימיות-גנטי בS. cerevisiae שאינו מסתמך על מניפולציות מולקולריות ביולוגיה או תשתיות. זה דורש רק אוסף שמרי מחיקה, מנגנון נעיצה רובוטית או ידני, ותוכנת ניתוח תמונה זמינה באופן חופשי.

<table><tbody><tr><td>Yeast Extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>Tyrptone Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) &amp;#8212; do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Prepare 1,000x stock at 200&amp;nbsp;mg/ml in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and filter sterilize.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml culture tubes</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>high-throughput microbial array pinning robot</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&amp;copy; Petri Dish</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Box of 200 dishes</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td>1536 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td colspan="4">Alternative Pinning Tools:</td></tr><tr><td>Fully Automated Robtic Systems</td><td>S&amp;amp;P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td></tr><tr><td>Manual Pinning Tools</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Handheld replication tools and accessories.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

קביעת מצב פעולה של כימיקלים ביו-אקטיביים היא עניין למגוון רחב של אקדמיות, תרופות, ומדענים תעשייתיים. Saccharomyces cerevisiae, או שמרי ניצנים, הוא מודל לeukaryote שאוסף של ~ 6000 מוטציות מחיקת גן וגן חיוני hypomorphic מלא מוטציות זמינות מסחרי. אוספים אלה של מוטציות יכולים לשמש כדי לזהות באופן שיטתי אינטראקציות כימיות-גן, גנים כלומר צורך לסבול כימי. מידע זה, בתורו, דיווחים על המצב הסביר של פעולה של המתחם. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי המהיר של אינטראקציות כימיות-גנטית בשמרי ניצנים. אנו מדגימים את השיטה באמצעות הסוכן כימותרפיות 5-fluorouracil (5-FU), שבה יש מנגנון מוגדר היטב של פעולה. התוצאות שלנו מראות כי הנווד הגרעיני RNA אנזימי exosome ותיקון DNA נחוצים לשגשוג בנוכחות 5-FU, שעולה בקנה אחד עם מ &#39;קודםicroarray גישות המבוססות על קידוד בר כימיות גנטיות והידע ש5-FU משפיע לרעה על חילוף חומרים הן RNA ו- DNA. פרוטוקולי האימות המבוקשות למסכי תפוקה גבוהה אלה גם מתוארים.

כאימות של גישה זו הופענו מסך נציג כימי גנטי אינטראקציה של 5-fluorouracil הסוכן כימותרפיות (5-FU) בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. 5-FU ידוע לשבש synthase thymidylate כמו גם DNA ו- RNA חילוף חומרים 18. האינטראקציות הגנטיות הכימית של 5-FU היטב למדו ונחקרו על ידי טכניקות microarray השמרים ברקוד באמצע...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.3K Views.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Video: Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Genetics

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, and release of the complex components. Glycerol gradient centrifugation has been used for the separation of protein or RNP (RiboNucleoProtein) complexes for functional and structural studies. Here, we describe the utilization of Grafix (Gradient Fixation), which was first developed to purify and stabilize macromolecular complexes for single particle cryo-electron microscopy, to identify interactions between splicing factors that bind transiently to the spliceosome complex. This method is based on the centrifugation of samples into an increasing concentration of a fixation reagent to stabilize complexes. After centrifugation of yeast total extracts loaded on glycerol gradients, recovered fractions are analyzed by dot blot for the identification of the spliceosome sub-complexes and determination of the presence of individual splicing factors.

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Here, we describe the utilization of Grafix (Gradient Fixation), a glycerol gradient centrifugation in the presence of a crosslinker, to identify interactions between splicing factors that bind transiently to the spliceosome complex.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Biochemistry

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships with other genes and organization into biological pathways and processes. Although the majority of the genetic screens were initially developed in Saccharomyces cerevisiae, a complementary platform for carrying out these genetic screens has been provided by Schizosaccharomyces pombe. One of the common approaches used to identify genetic interactions is by overexpression of clones from a genome-wide, high-copy-number plasmid library in a loss-of-function mutant, followed by selection of clones that suppress the mutant phenotype.
This paper describes a protocol for carrying out this &#39;multicopy suppression&#39;-based genetic screen in S. pombe. This screen has helped identify multicopy suppressor(s) of the genotoxic stress-sensitive phenotype associated with the absence of the Ell1 transcription elongation factor in S. pombe. The screen was initiated by transformation of the query ell1 null mutant strain with a high-copy-number S. pombe cDNA plasmid library and selecting the suppressors on EMM2 plates containing 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), a genotoxic stress-inducing compound. Subsequently, plasmid was isolated from two shortlisted suppressor colonies and digested by restriction enzymes to release the insert DNA. Plasmids releasing an insert DNA fragment were retransformed into the ell1 deletion strain to confirm the ability of these suppressor plasmid clones to restore growth of the ell1 deletion mutant in the presence of 4-NQO and other genotoxic compounds. Those plasmids showing a rescue of the deletion phenotype were sequenced to identify the gene(s) responsible for suppression of the ell1 deletion-associated genotoxic stress-sensitive phenotype.

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

This work describes a protocol for a multicopy suppressor genetic screen in Schizosaccharomyces pombe. This screen uses a genome-wide plasmid library to identify suppressor clone(s) of a loss-of-function phenotype associated with a query mutant strain. Novel genetic suppressors of the ell1 null mutant were identified using this screen.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב