Этот протокол описывает простой и эффективный экран супрессора для выявления мутаций супрессора у мутантов, которые имеют дефект роста в расщепляющихся дрожжей. Традиционные методы мутагенеза используют токсичные химические вещества или УФ, которые могут генерировать несколько мутаций в клетке. И наоборот, этот протокол может обогатить одного мутанта-супрессора в отдельных клетках без использования методов индуцирования мутаций.
Начните эту процедуру с напряжения строительства и подготовки, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 200 микролитров жидкого мультимедиа к каждой колодец из 96-хорошо полистирола микроплита. С помощью стерильного аппликатора возьмите небольшое количество каждой из подготовленных колоний и приостановите каждую колонию в отдельных колодцах, содержащих жидкие средства массовой информации.
Включите пустой колодец для каждого ряда на тарелке, содержащей 200 микролитров одного и того же средства массовой информации. Теперь наймите протокол на программное обеспечение обнаружения считыватель пластин подключен к автоматизированному считыватель микроплатформ. Установите температуру на уровне 30 градусов по Цельсию и установите кинетическую программу на 24 часа с частотой чтения двух минут.
Это приводит к 721 всего читает в течение 24-часового периода на колодец. Установите встряхивания непрерывной быстрой орбитальной тряски. Установите оптические считывает для измерения рассеяния света на длине волны 600 нанометров для измерения оптической плотности и установить свет для чтения из-под пластины.
Через 24 часа завечите окончательные пустые показания оптической плотности и используйте формулу в текстовом протоколе, чтобы определить объем, необходимый для разбавления каждого из образцов до оптической плотности 0,1. Для пакетного процесса объем разбавления, который будет использоваться из каждой экспериментальной системы, экспорт данных из программного обеспечения для чтения пластин и использование программного обеспечения электронной таблицы для вставки той же формулы, что и функция. Каждые 24 часа используйте те же средства массовой информации, что и нулевой день, чтобы разбавить каждый из образцов до оптической плотности 0,1 с помощью формулы.
Убедитесь в том, чтобы использовать формулу, чтобы разбавить все скважины до оптической плотности 0,1. Это включает в себя скважины, которые, возможно, начали показывать некоторое восстановление в их дефект роста. Сохранить все кривые роста генерируется ежедневно.
Обратите внимание на любую индивидуальную колонию, которая показывает увеличение темпов роста, судя по окончательной оптической плотности, которая значительно выше, чем остальная часть когорты с тем же генетическим фоном или кривой роста, которая похожа на колонии дикого типа. Этот анализ обычно занимает от семи до 14 дней. Выполните все шаги в стерильных условиях.
С последнего дня анализа считывателя пластин, некоторые жидкие культуры имеют заметно восстановленные темпы роста, предположительно, путем получения мутации супрессора, которая может облегчить фенотип родительской мутации. Для хранения фенотипически восстановленных культур перенесите и смешайте 250 микролитров жидкой культуры на криотрубку, содержащую 250 микролитров 50%глицероля. Вспышка заморозить клетки в жидком азоте и сохранить штаммы в минус 80 градусов по Цельсию на неопределенный срок.
Чтобы подтвердить, что мутация супрессора является генетически наследуемым элементом, используйте стандартные методы генетического скрещивания, чтобы пересечь ваши любимые мутантные P-клетки с вашими любимыми мутантными клетками S. Когда две гаплоидные клетки с бесплатным типом спаривания смешиваются и подвергаются азотной голоданию, они могут генерировать зиготу, которая спорит, чтобы сформировать тетраду из четырех спор. Родительские генетические материалы будут сегрегироваться во время мейоза в соответствии с правилами генетики Менделея.
После sporulation, индивидуальные споры от таких же tetrads можно вскрыть и сформировать 4 индивидуальных колонии как наблюдаемые вертикально на плите. Равномерно поместите споры один за другим на тарелку с помощью микроиглы. После вскрытия оставьте клетки расти в 30 градусов по Цельсию инкубатор в течение нескольких дней, пока колонии появляются.
Если мутация супрессора является генетически наследуемым элементом, этот крест должен дать тетрады, в которых две колонии имеют фенотип болезни родительского штамма и две колонии имеют темпы роста восстановления штамма супрессора. Выберите три колонии с фенотипом супрессора и три колонии с родительским фенотипом из того же генетического креста и приступайте к шагам по извлечению и секвенированию геномной ДНК, описанным в текстовом протоколе. Затем выполните биоинформатический анализ для идентификации мутаций супрессора, как описано в тексте.
Кривые роста отдельных колоний были зарегистрированы в начальной точке времени и в течение шести дней с непрерывным мониторингом с помощью считыватель пластин. Как и ожидалось, колонии дикого типа не показывают заметных изменений в кривых роста на протяжении всего эксперимента. Примечательно, что четыре колонии с фоном удаления elf1 и одной колонией удаления fal1 показывают резкий сдвиг в росте от медленного роста к некоторым различным уровням роста, аналогичным уровню колоний дикого типа.
Драматически, все мутанты clr6 показывают последовательное фенотипическое восстановление, растущее более быстрыми темпами к концу анализа. Два из выявленных не синонимных изменений, мутация cue2 и мутация rpl2702 были реконструированы в лаборатории с использованием стандартных протоколов для сайта направленного мутагенеза. Двойные мутанты Cue2 elf1 и двойные мутанты rpl2702 elf1 были скрещены с бесплатным штаммом мутантов elf1.
Генетическая скрещивание показало, что выявленные мутации супрессора успешны в подавлении медленно растущего фенотипа мутанта удаления эльф1 и являются напыльными. Во время ежедневного разбавления пластины из 96 скважин важно разбавить все скважины до одинаковой концентрации, чтобы избежать искусственного восстановления роста. Этот метод позволяет изоляции мутаций супрессора в высокой пропускной способности образом ускорения открытия сотен генов, которые не были хорошо охарактеризованы в расщепляющихся дрожжей и других микроорганизмов.
Этот метод может быть использован для изоляции супрессоров для всех микроорганизмов, которые имеют мутации, вызывающие дефект роста и которые могут быть выращены до большой популяции в жидкой культуре. Выявление мутаций супрессора в расщепляющихся дрожжах может иметь потенциальные последствия в поиске болезнетворных генов в перекрывающихся путях, особенно когда дело доходит до высокосхраняющихся путей от дрожжей до людей.
