Name: isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

הערה: פרוטוקול זה הותאם מאל Bonaventure et. (2004), מולינה et al. (2006), לי ואח &#39;. (2013) 7,10,11. צעדים 1-5 מסוכמים באיור 1. Delipidation 1. רקמות הערה: תמיד לשטוף את כל כלי הזכוכית וכובעים עם כלורופורם, ומאפשר לי יבש מתחת למכסת מנוע קטר, לפני השימוש. זהירות: בצע הומוגניזציה רקמות וכל שלבי העברת הממס תחת מכסה המנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה כדי למנוע מגע ישיר עם כימיקלים וכדי להגן על הדגימות מזיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה מחממים מים ולחסום חום עד 85 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל כ 0.5 גרם של כל דגימת עלה לתוך צינורות 20 מ&quot;מ-שקל מראש x 125 מ&quot;מ מבחן זכוכית עם polytetrafluoroethylene פקקי הברגה (PTFE) -faced. כולל ארבעה חזרות לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2-propanol בארלנמייר (כ 125 מיליליטר, 25 מיליליטר לגרם של SAMPle). להוסיף 2,6-די-טרט-בוטיל-4-methylphenol (הידוע גם בhydroxytoluene butylated, BHT) לריכוז סופי של 0.01% (w / v). הערה: הוסף BHT מ% 5 (w / v) פתרון מניות במתנול (BHT מסייע למזער חמצון של חומצות שומן בלתי רוויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מחממים 2-propanol עד 85 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר ממס 2-propanol חם על צינור אחד מדגם וחום במשך 15 דקות על 85 מעלות צלזיוס בגוש חום. צעד זה מנטרל lipases שעשוי להשתחרר מהתאים שיבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו צינורות להתקרר לטמפרטורת חדר ולטחון רקמה ביסודיות עם homogenizer עד השעיה הומוגנית מתקבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות בייקר מסלולית וללחוץ במשך 1-2 שעות ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 2-propanol ולנער במשך 12 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר CH3 Cl: CH 3 OH (2: 1, נ / V) לשאריות (25 מיליליטר לגרם של מדגם) ולנער לילה ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, נ / V) לשאריות ולנער לילה ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהסיר ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות יבשות מתחת למכסת מנוע קטר הלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש השאריות ולאחר מכן למקם בייבוש ואקום מעל CaCl נטול מים 2 או 4 קאסו עד שהגיע למשקל קבוע (3-5 ימים). </li></ol> 2. Depolymerization: Methanolysis עם נתרן methoxide (איור 2) זהירות: בצע צעדים 2.3-2.4, 2.7-2.8, 2.10-2.11, 2.13-2.15 ו2.17-2.18 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול מבחנות המכילות שאריות יבשות (חשובות לחישובים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תקנים פנימיים על צינור אחד: 25 heptadecanoate ωL תיל (1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות) וω-pentadecalactone 25 μl (1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.9 מיליליטר אצטט מתיל, 1.5 methoxide מיליליטר נתרן, ושל 3.6 מיליליטר מתנול על צינור אחד וכובעם. לחלופין, להכין תערובת תגובה עם שלושת ריאגנטים אלה ולהוסיף aliquots 6 מ&quot;ל לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום למשך 2 שעות ב 60 ° C ומערבולת מעת לעת במרווחים של 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של dichloride תילן (CH 2 Cl 2) ושל 1.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית כדי לחלץ את אסטרים מתיל חומצת שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני (נמוך) כדי לנקות צינורות בגודל בינוניים (16 x 125 מבחנות זכוכית מ&quot;מ עם פוליtetrafluoroethylene כובע בורג -faced (PTFE)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שלב המימי (עליון) וחזור על שלבים 2.11-2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל השלב המימי (העליון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סולפט נטול מים נתרן (Na 2 SO 4) לממס, מכסה את הצינורות, ומערבולת דקות 1; דגימות יכולות עכשיו להיות שנותרו עד היום הבא. בניתן להשאיר דגימות שלב זה הלילה מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 800 XG קומפקטי מלח Na 2 SO 4 בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני לצינור חד פעמי זכוכית קטנה (13 x 100 מבחנות זכוכית מ&quot;מ עם polytetrafluoroethylene (כובע בורג -faced PTFE)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס ליובש תחת חנקן ולהמשיך לשלב derivatization. אם לא מעובד באופן מיידי, החנות התאדתה דגימות ב -20 ° C (דגימות יכולות להיותמאוחסן הסימפונית לפני שלב האידוי). </li></ol> 3. הכנה של נגזרים עבור גז כרומטוגרפיה זהירות: בצע את השלבים 3.1.2 ו3.1.5 - 3.1.8 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגזרי Trimethylsilyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 100 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של פירידין 100 μl ושל BSTFA (N, O Bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide) 100 μl לכל צינור ומכסה אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום של 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות דגימות תחת חנקן בטמפרטורת חדר. הימנעו הפעלת חום לדגימות, מונומרים תנודתיות מאוד בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1: 1 (V / V) heptane: טולואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף דוגמאות לבקבוקוני GC ולהמשיך GC ניתוח / MS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצטילנגזרים הערה: acetylation, לשנות צעדים 3.1.1-3.1.3 לעיל כדלקמן (לא מוצג בוידאו); צעדים 3.1.4-3.1.8 זהים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של פירידין 100 μl ושל אנהידריד אצטית 100 μl (AC 2 O) לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום שעה 1 ב 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעמודת נימים HP-5 (30 0.25 מ&quot;מ x 0.25 עובי MX מיקרומטר סרט) או (כלומר., Diphenyl 5%, polysiloxane דימתיל 95%) שווה ערך. תכנית GC עם זרימת ספק הליום גז שנקבעה ברמה של 1.5 מיליליטר / דקה וטמפרטורת תנור המתוכנת 150-300 מעלות צלזיוס ב 3 מעלות צלזיוס / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהזרקת פיצול (01:10 יחס פיצול) וספקטרומטר מסה מוגדר לסריקת מצב על 40-600 האמו (יינון השפעת אלקטרונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור טבלת רצף כוללים ממס (ריק), WT ומשכפל מוטציה, כל שיטת ניתוח cutin באמצעות מצויינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס עומסובקבוקוני מדגם על הקרוסלה, להוסיף הקסאן לבקבוקוני שטיפה-מזרק בautosampler במידת צורך, ולהתחיל את הרצף. לאחר הרצף הושלם, סך עקבות chromatogram היון זמינות עבור כל הדגימות. </li></ol> ניתוח נתונים 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות מונומרים פוליאסטר שומנים על ידי השוואת הספקטרום ההמוני של כל שיא לספקטרום מסה שפורסם או על ידי חיפוש בספרייה מסחרית אם זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיא כל שזוהה בchromatogram הנוכחי היון הכולל, להשתמש הפעמים השמירה שלהם כדי למצוא את האזורים על שולחן תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS (איור משלימה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מונומר (עמודות א.ב.), להוסיף את אזור הערכים נמצאו בטבלת האינטגרציה (איור 1 נוסף, עמודת D) לעמודה המתאימה לכל לשכפל מדגם בטבלת Excel של מונומרים (קובץ נוסף 2, טורי CF), שהוא גיליון אלקטרוני לכמת ארבידופסיסנגזרי cutin TMSi. השתמש בקובץ נוסף 3 אם נגזרי acetylated מוכנים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תחומי הסטנדרטים הפנימיים (IS) לעמודות (HK). לאלו מונומרים שאינם derivatized, אסטרים מתיל כלומר חומצות שומן (ג&#39;יימס), ואסטרים דימתיל חומצת dicarboxylic (DCA DMEs), להשתמש 17: 0 תהילה (IS1) כלכימות (תאים מוצלים סגולים בטבלת מונומר; נוסף קבצי 2/3). למונומרים hydroxylated, כוללים אלכוהול ראשוני, חומצת ferulic וחומצות ω-הידרוקסי, להשתמש 15: 0 FAME 15 הידרוקסי-(IS2) כבחירה לכימות מתחם (תאים-shadded ירוקים בטבלת מונומר; משלימה קבצי 2/3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף משקל עלה יבש לכל לשכפל לעמודות AX-תואר ראשון (קובץ נוסף 2) או AQ-AT (קובץ נוסף 3); לחלופין, לסרוק עלים לחשב שטח פנים ולהוסיף ערכי שטח לשולחן מונומר להביע המון מונומר ליחידהשטח פנים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolyester+membranes+of+plants:+cutin+and+suberin.">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li><li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyesters+in+higher+plants.">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li><li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+plant+cuticles.">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li><li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis.">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li><li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin,+a+plant+barrier+biopolymer.">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li><li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis:+occurrence+of+octadeca-cis-6,+cis-9-diene-1,+18-dioate+as+the+major+component.">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li><li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin.">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li><li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li><li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds.">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li><li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl-lipid+metabolism.">Acyl-lipid metabolism.</a> The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).</li><li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana.">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li><li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development.">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 446 (2010).</li><li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry.">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li><li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+(L.)+Karst.,+Quercus+robur+L.,+and+Fagus+sylvatica+L.">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li><li>Riederer, M., Sch&#246;nherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin.">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li><li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis.">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li><li>Gra&#231;a, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins.">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li><li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I:+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle.">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li><li>Espelie, K. E., K&#246;ller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid,+a+novel+component+in+citrus+cutin.">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li><li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves.">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li><li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins.">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li><li>Holloway, P. J., Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chemical constitution of plant cutins. , 45-85 (1982).</li><li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle.">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

שלא כמו biopolymers האחר כגון דנ&quot;א וחלבונים, השומנים פוליאסטר צמח אינו עשוי מתבנית. במקום זאת, יצירותיהם תלויות בספציפית של האנזימים הנמצאים ברקמות שהופכות את הפולימרים תאיים אלה. ככזה, אנליזות כימיות של מרכיב רכיבים קריטיים להבין הרכב פוליאסטר שומנים. שיטות כימיות לדבוק אג&quot;ח אסתר כוללות סבון, hydrogenolysis, transmethylation-זרז חומצה, ו- זרז בסיס transmethylation 2. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות. סבון מייצר חומצות שומן חופשיות הידרוקסי שיכול לעבור תגובות המשניות. Hydrogenolysis עם ליתיום אלומיניום הידריד (4 LiAlH) 16 שמש במשך ניתוח cutin 7. Hydrogenolysis מפחית פחמנים פונקציונליות לאלכוהול והמבנים המקוריים צריכים להסיק על ידי deuteriolysis עם deuteride אלומיניום ליתיום (LiAlD 4).חסרון של גישה זו הוא הדרישה של GC / MS ברזולוציה גבוהה כדי להשוות את מידת deuteriation של polyols השומן שהושג לעשות משימות של המבנים שלהם. transesterification זרז-חומצה עם trifluoride ורון methanolic (BF 3) כבר בשימוש תכוף בdepolymerizations cutin ושַׁעֲמָן 8,17,18, אבל יש מגיב חיי מדף מוגבלים ועשוי להציג את החפצים בשל תופעות תגובות 15. חומצה גופרתית methanolic גם תשואות אסטרים מתיל של מונומרים אבל עם פרופורציות גדולות יותר של חומצות שומן 2-הידרוקסי, אשר ככל הנראה לא רכיבי פוליאסטר השומנים נכונים, בהשוואה לשיטות אחרות 10. שיטת transesterification הזרז-NaOMe המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת אסטרים מתיל חומצת השומן שderivatized על ידי silylation של קבוצות הידרוקסיל, מתן ספקטרום מסה אופייני לזיהוי, או על ידי acetylation לספק נגזרים יציבים יותר של קבוצות הידרוקסיל FOכימות r. חסרון אחד של שיטה זו הוא שהידרוליזה מתחרה עם transesterification כאשר המים נמצאים בתגובה. מים מגיבים עם NaOMe (הזרז) ומייצרים NaOH, אשר בתורו hydrolyses אסטרים מתיל חומצת שומן להניב חומצות חופשיות (איור 2 ד). זה צד תגובה רצויה משום ששתי פסגות תהיה נוכחת לכל חומצת שומן: תיל אסטר ונגזר אסתר TMSi, ובכך מסבכים את הניתוח. שימוש בחומרים כימיים נטול מים והוספה מתיל אצטט כשיתוף ממס להתחרות עם סבון הם צעדים חיוניים ובכך למנוע הידרוליזה (איור 2 ד). Cutin ושַׁעֲמָן מכילים בין גליצרול 1 ו -26% 4. עם זאת, מונומר זה לא יזוהה על ידי תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול זה. גליצרול הוא הידרופילי מאוד, ובניגוד למונומרים התיל אסטר חומצת שומן, יבוטל במהלך שלבי ממס השטיפה מימיים. מגבלה זו גםpplies לשיטות אחרות cutin depolymerization, אבל גליצרול ניתן לקבוע בשכבה המימית המתקבלת לאחר transesterification באמצעות שיטה האנזימטית. לחלופין, ניתן לכמת באמצעות תנאים מתונים יותר (לדוגמא., 0.05 M NaOMe) ללא מיצוי במים נוסף כדי לזהות את כל מונומרים, כולל גליצרול 19,20 .Although שימושי לצורך כימות גליצרול, תנאים קלים בדרך כלל לתת depolymerization שלם של cutin ו שַׁעֲמָן. אם GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID) זמין, ניתן לנתח את כל משכפל במכשיר זה למטרות כמותי, אחרי פסגות של מדגם מייצג זוהו על ידי GC / MS. לחלופין, ניתן לזהות מונומרים בGC / עקבות FID אם ידועים מדדי שימורם. יש גלאי יינון הלהבה גבוהה במיוחד רגישות ומגוון רחב של מידתיות, שהוא קריטי לכימות של רכיבי מדגם גדולים והקטניםבריצות יחידה. בנוסף, הוא חזק וקל לתחזוקה ותפעול 15. הפרוטוקול המתואר מאפשר הבידוד, זיהוי, וכימות אמין ושחזור של מונומרים פוליאסטר שומנים צמחיים, המאפשר אפיון הכימי של מוטציות שונות בהרכב של מונומרים פוליאסטר שומנים אחד או יותר. ההליך הוא מדרגי, זה יכול להתאים בקלות לעבד כמויות קטנות וכמות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כוללים שורשים, זרעים, עלים, גבעולים ופרחים. נתוני רפאים המוניים של מונומרים פוליאסטר שומנים ממינים רבים שפורסמו לדוגמא., 21-26 ומהווים משאבים יקרי ערך כדי לזהות מונומרים ידועים מתי התאמת פרוטוקול זה לרקמות ו / או מינים אחרים. שיטה זו ישימה לחקירות של ביוסינתזה, רגולציה, וההפצה של פוליאסטר שומנים בצמחים גבוהים יותר.

צמחים עילאיים להסתמך על שכבות תאיים המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות צמח והסביבה החיצונית. המבנים הקשורים קיר תא lipophilic אלה מגבילים את הזיהום פתוגניים ולהסדיר את התחבורה הפסיבית של גזים, מים, וחומרים מומסים ובמתוך רקמות צמח 1. מחסומים כאלה הם ציפורן הצמח, מבנה synapomorphic ייחודי לצמחים 2, ומחסומי דיפוזיה המכיל שַׁעֲמָן שונים. הציפורן היא שכבת oleophilic המסונתזת על ידי תאי האפידרמיס וחייבת אותם באמצעות שכבת pectinaceous בצד תאי של דופן התא 3-5. זה סוגר את האיברים אוויריים העיקריים של צמחים גבוהים יותר, המתפקד כממשק חיוני בין רקמות צמח והסביבה. Cutin, המטריצה ​​המבנית של הציפורן, ושַׁעֲמָן שני פוליאסטר glycerolipid מסיס הקשורים שעוות ממס נשלף 2,4. l פולימרים אלהipids מורכב של נגזרי חומצת שומן רוויים ובלתי רוויים והם גם מבני ותפקודי דומים. עם זאת, הם נבדלים על ידי הבדלים אופייניים באתרי הרכב ותצהיר כימיים. שַׁעֲמָן הוא פוליאסטר אליפטי הממוקם בתוך קירות התא של רקמות פנימיות וחיצוניות מסוימות ויוצרות קיר המשני. רקמות Suberized כוללות periderms של שורשים, פקעות וקליפת עץ, endodermis שורש, שכבות מעיל זרע, ופצעים הגלידו 2. שלא כמו cutin, פוליאסטר שַׁעֲמָן בדרך כלל מכיל אלכוהול, רווי וחומצות dicarboxylic מונו-בלתי רווי, וחלק גדול ממונומרים מאוד ארוכת-שרשרת (C≥20). Cutin הוא פוליאסטר שומנים הנפוץ ביותר בצמחים עילאיים 6, והוא מורכב מגליצרול ונגזרי חומצת שומן interesterified C16-C18, כגון חומצות שומן-אפוקסי הידרוקסי הידרוקסי והוחלף 4. בעוד ההרכב של פולימרים cutinמשתנה בין מיני tracheophyte, מונומרים העיקריים השולט ביותר הם 10, 16-dihydroxy 16: 0,-9,10-אפוקסי 18-הידרוקסי 18: 0, ו9,10,18-trihydroxy 18: 0 חומצות שומן. מעניין לציין, עלה ארבידופסיס ונובע cutin מורכב בעיקר של 18: 2 חומצת dicarboxylic 7,8. שורש צמח גם להציג שונות ניכר בעובי, החל כמה ננומטרים לכמה מיקרומטרים 9. מאז בידוד ציפורן הוא צעד מייגע וגוזל זמן, במיוחד לעור קרני עלה דק מאוד כמו אלה של thaliana ארבידופסיס 8, שיטות העוקפות בידוד ציפורן פותחו ומאומתים 7,8. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד הקומפוזיציה מונומר של cutin בעלי thaliana ארבידופסיס ידי methoxide נתרן (NaOMe) depolymerization -catalyzed וגז כרומטוגרפיה הבאה / ספקטרומטר מסה (GC / MS) ניתוח. פרוטוקול זה מציע שיטה חזקה למנסה לאמוד את שיתוףmposition של פוליאסטר שומנים צמח ברקמות delipidated כל, והותאם מפרוטוקולים שדווחו בעבר 7,10,11. דגימות רקמה שלמות הן ראשון הומוגני וממצה delipidated, הסרת שומני ממס לחילוץ כולל cuticular ושעוות epicuticular, שומני קרום, וtriacylglycerols. אז שאריות מועשרות קיר תא depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידי methanolysis-זרז methoxide נתרן. אסטרים מתיל חומצת שומן מופקים על החמצה, וderivatized להשיג נגזרי trimethylsilyl או אצטיל המקביל שלהם. שאריות derivatized תנודתיות מאוד, ויכולות להיות eluted מעמודת גז כרומטוגרפיה בטמפרטורה סבירה מבלי לשנות קונפורמציה המבנית שלהם במהלך ניתוח GC / MS.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent for delipidation</td></tr><tr><td>Anhydrous sodium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidification agent</td></tr><tr><td>Helium carrier gas, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Carrier gas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organic solvent, transmethylation reactive</td></tr><tr><td>Methyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methyl heptadecanoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Internal standard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methylene dichloride (Dichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Nitrogen, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Carrier gas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Internal standard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvent for derivatization</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Sodium methoxide (25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)&lt;br/&gt; Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Square greenhouse pots, 3.5 inch&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC vial microinserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytic balance</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J&amp;amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m film thickness</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gas chromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-stage regulator</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא להגדיר כדי לקבוע מונומרים פוליאסטר שומנים, צמצום התרומות של שומנים שאינם cutin 10 איור 1 מציג סקירה של assay, שלגמרי לוקח בין 8 (כלומר, cutin או שַׁעֲמָן.) -. 10 ימים (מקצירת רקמה ראשונית לקבלת נתונים GC), תלוי כמה זמן דגימות להתייבש. Methanolysis נבחר-זרז הבסיס (איור 2) השיטה לdepolymerize פוליאסטר קבלה תוקף בעבר לזרעי ארבידופסיס, המכילים שני cutin ושַׁעֲמָן. רקמות ראשונות הומוגני וממצות delipidated כדי להסיר שומני ממס שניתן להפיק. תשואת השאריות לאחר חילוץ, כאחוז ממשקל הטרי ראשוני, היא בדרך כלל 6% לא thaliana Col-0 עלים. שאריות מועשרות קיר תא מיובשות בייבוש ואקום ולאחר מכן depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידיזרז-בסיס transmethylation. דגירה של שעות נבחרה כזמן הקריטי הנדרש לdepolymerization והתאוששות של רכיבי פוליאסטר שומנים נכונים. פעמים דגירה כבר הביאו לעלייה בחומצות 2-הידרוקסי; אלה שעלולים לנבוע מsphingolipids קרום 10. Chromatogram טיפוסי אם cutin עלה סוג בר ארבידופסיס מוצג באיור 3, לנגזרי O -TMSi אתר (איור 3 א) ונגזרי -acetyl O (איור 3). שיא כל זוהה על ידי השוואה לספקטרום המוני מהספרות 7,8 ומאגר נתונים ציבורי 12 פרוטוקול וידאו .our מראה כיצד להכין נגזרי TMSi, אבל לחלופין ניתן acetylated דגימות לderivatize קבוצות הידרוקסיל. נגזרי Silylated טובים למטרות זיהוי משום שהם נותנים ספקטרום המוני אבחון. עם זאת, נגזרי acetylated הם יציבים יותר ואלטרנטיבה טובה לsilylationמונומרים פעם זוהו 10. (איור נוסף כדי לעזור ליישם פרוטוקול זה במעבדות שרק לי GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID), GC / FID עקבות מתאים לנגזרי acetylated של מונומרים cutin עלה WT ולסדרת הומולוג של סטנדרטים תיל אסטר חומצת שומן מוצג גם 4). שיטה זו היא איכותית ומזהה הבדלים כמותיים בין דגימות, ומכאן הערך שלה עבור ניתוח שעבר מוטציה. הכמויות של מונומרים פרט נקבעות תוך שימוש בשיטה סטנדרטית הפנימית של כימות, המאפשרת השוואות של שפע מונומר בין דגימות. יובהר, עם זאת, כי גודל השיא (סה&quot;כ ספירת יון) עלול שלא לשקף יחסים הטוחנות של מונומרים בפוליאסטר. אנו כוללים שולחנות עריכה של מונומרים לחשב כמויות מונומר בcutin עלה ארבידופסיס כאסטרים של חומצות שומן מתיל ונגזרי TMSi (קובץ נוסף 1), או אס<html> נגזרי Tyl (קובץ נוסף 2) של אלכוהול. לוחות אלה ייתכן שיהיו צורך מותאם אם דגימות שחולצו מאיברים שונים או מיני צמחים. ארבידופסיס תאליה na קולומביה כדוגמא, יש לנו ניתחתי (Col-0) עלים סוג בר ושני אללים null-המוטציה אפיינו בעבר את של גן CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) וatt1-2 (m-2 ) 13,14. monooxygenases ציטוכרום P450 של תת-משפחת CYP86A לקודד ω-oxydases המשוער ולהשתתף שבַׁעֲמָן וביוסינתזה מונומר cutin. התוצאות שלנו (איור 4) להפגין ירידה משמעותית בעומסים של שלושה מונומרים שומנים גדולים בעלי המוטציה בהשוואה לעלי WT. עולה בקנה אחד עם התפקוד של האנזים שחזה, 16: 0, 18: 2, 18 ו: 1 dicarboxylates הושפע במיוחד במוטציות att1. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 53,386 / /&gt; 53386fig1.jpg &quot; איור 1. סקירה כללית של ניתוח פוליאסטר השומנים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> איור 2. מנגנון של תגובת transmethylation זרז-NaOMe. אניוני methoxide nucleophilic לתקוף את הפחמן cabonyl של פוליאסטר שומנים כדי ליצור יציב tetrahedral ביניים (א), שמנתק קלות לאסטרים מתיל חומצת השומן ואניוני alkoxide (B). alkoxides אלה הם בסיסי המצומד, ומגיב עם מתנול, התחדשות אניוני methoxide catalytically הפעיל, ובכך לשמר את תגובות נוספות depolymerization (C). אם מים נמצאים במערכת, שהיא תגיב עם methoxide נתרן כדי ליצור סודיום הידרוקסיד, בסיס חזק שאופן בלתי הפיך hydrolyses אסטרים לייצר חומצות שומן חופשיות בלתי רצויות. מתיל אצטט נוסף כ-15 שיתוף הממס להסיר כמויות קטנות של נתרן הידרוקסידי בתוך המערכת (ד &#39;). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> איור 3. Chromatogram הנציג הכולל יון של מונומרים cutin עלה thaliana ארבידופסיס wild-type. (א) אתר O -trimethylsilyl (TMSi) ו- (ב) נגזרי הידרוקסיל אצטט. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> איור 4. הרכב Cutin מונומר של WT thaliana ארבידופסיס ושני אללים המוטציה null של גן CYP86A2. (מוטציה-1 = att1-1; מוטציה-2 = att1-2) ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (n = 4) . מעובד מתוך 13, באישור © לקוול ההוצאה לאור (2007). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> איור נוסף טבלת 1. שיא תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS. פסגות המתאימות מונומרים מזוהים וסטנדרטים פנימיים מזוהות על ידי retenti<html> בזמן (העמודה C) וערכי אזור הם נספר בטור ד <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">&#39;אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> קובץ 2. טבלה נוספת של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי אתר trimethylsilyl של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> קובץ 3. לוח נוסף של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי -acetyl O של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי).com / קבצים / ftp_upload / 53,386 &quot;target =&quot; / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> GC איור 4. נוסף / עקבות FID של (AB) תיל אסטר חומצת שומן (תהילה) סטנדרטים מדד שימור (פסגות מסומנות עם כל אורך שרשרת FAME רווי); ו- (ג) acetylated א מונומרים cutin עלה WT thaliana. מספרים בשיא מתאים ל: 16: 0 תהילה (1), ferulate (2), 18: 3 תהילה (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 תהילה (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 תהילה (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 תהילה (12), 18 18-OH: FAME 1 (13), 20: 0 תהילה (14), 10,16-diOH 16: 0 תהילה (15), 24: 0 תהילה (16). DCA: אסתר דימתיל חומצת dicarboxylic; תהילה: תיל אסטר חומצת שומן; IS1: תקן פנימי 1, 17: 0 תהילה; IS2: רח הפנימיandard 2, 15-OH 15: 0 תהילה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Views.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Video: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Chemistry

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

השימוש מוטאנטים eceriferum ארבידופסיס לחקור לציפורן ביוסינתזה הצמח

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

בידוד כימי, כימות, הפרדת שומנים בעור של זוחלים

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Environment

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

מיצוי של ליגנין עם תכולה גבוהה של β-O-4 על-ידי הפקת אתנול מתון והשפעתו על התשואה Depolymerization

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...