הדמיית העברת אנרגיית תהודה של תאים חיים של דינמיקת הפעלת Akt מווסתת מטבולית בתאי HepG2

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הדינמיקה המרחבית-זמנית של הפעלת Akt וזרחון בתאי HepG2 חיים. הדמיית העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא כלי רב עוצמה המספק תובנות חשובות לגבי מסלולי איתות אינסולין וויסות מטבולי בתאי סרטן.

הפעלת Akt מווסתת מטבולית היא צומת קריטי במפל איתות האינסולין ומספקת תובנות חשובות לגבי הקשר בין סוכרת לסרטן. כדי לכמת במדויק את פעילות Akt בתאי HepG2, פיתחנו פרוטוקול חזק וניתן לשחזור המשתמש בהעברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) עם חיישנים ביולוגיים ספציפיים ל-Akt מקודדים גנטית. פרוטוקול זה מתאר שלבים מפורטים לתרבית תאים, הכנת צלחת הדמיה וטרנספקציה של תאי HepG2 כדי לבטא חיישנים ביולוגיים מבוססי FRET, לצד הנחיות ספציפיות לסריקת לייזר תצורת חומרה ותוכנה של מיקרוסקופ קונפוקלי. התוצאות הדגימו דפוסים ייחודיים של איתות אינסולין בתאי HepG2, המציגים מתג בלתי הפיך המאופיין בהפעלת Akt מכוננת עם סף הפעלה מוגדר אך ללא סף כיבוי. לעומת זאת, myotubes מציגים מתג הפיך. הפעלת Akt המתמשכת בתאי HepG2 מרמזת על מנגנונים העומדים בבסיס עמידות לאינסולין וחוסר ויסות מטבולי בתאי הכבד, עם השלכות רחבות יותר להבנת התקדמות הפרעות מטבוליות וסרטן. פרוטוקול זה מציע מסגרת רבת ערך לחקר מסלולי איתות והתנהגויות תאיות הקשורות ל-Akt בהקשרי מחלה שונים.

סוכרת מהווה אתגר בריאותי עולמי גדול, המאופיין בתנגודת לאינסולין ופגיעה בהומאוסטזיס גלוקוז¹. הבנה מקיפה של מסלולי איתות אינסולין חיונית להבהרת הפתופיזיולוגיה של מחלה זו, שכן אינסולין ממלא תפקיד מרכזי בחילוף החומרים של גלוקוז, צמיחת תאים והישרדות². מחקרים רבים הוכיחו כי איתות אינסולין משפיע באופן משמעותי על סוגי סרטן שונים, וקושר תנגודת לאינסולין להתקדמות הגידול ותוצאות גרועות של המטופלים 3,4,5,6. תאי HepG2, קו תאי קרצינומה הפטו-תאית נפוץ, משמשים כמודל רב ערך לחקר עמידות לאינסולין ויחסי הגומלין בין חוסר ויסות מטבולי והתפתחות סרטן⁷. באופן מסורתי, חוקרים ראו את תגובות האינסולין כמדורגות; עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי תאים בודדים יכולים להפגין תגובות דו-יציבות, ולהציג מעברים בולטים בין חוסר תגובה לתגובה מלאה המתרחשים בסף ריכוז אינסולין ספציפי ^8,9.

הדמיית העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא כלי רב עוצמה לחקר ההתפלגות המרחבית-זמנית של ביומולקולות בתאים חיים¹⁰. על ידי חילוץ מידע מדינמיקה מולקולרית, FRET מספק תובנות לגבי תהליכים כגון הפעלת Akt בזמן אמת, מה שהופך אותו לטכניקה שלא יסולא בפז לחקר תאים חיים^11,12. שיטת הדמיה זו הוכחה כחיונית בחקר הדינמיקה התאית, במיוחד במחלות מטבוליות וסרטן, שם אינטראקציות מולקולריות מדויקות הן קריטיות¹³. FRET מאפשר גם ניטור בזמן אמת של אינטראקציות מולקולריות, ושופך אור על מנגנונים כגון עמידות לאינסולין והתקדמות הגידול^14,15. חיישני FRET ביולוגיים חיוניים בחקר הסרטן לחקר מיקרו-סביבות גידול, עמידות לתרופות והפרעות מטבוליות¹⁶. שיטות זיהוי FRET, כגון פליטה רגישה (SE), הלבנת מקבל (AB), מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים פלואורסצנטי (FLIM) וספקטרוסקופיה, כל אחת מהן מציעה יתרונות מובהקים לכימות אינטראקציות מולקולריות¹⁷. SE מודד העברת אנרגיה בין פלואורופורים תורמים ומקבלים, וכתוצאה מכך שינוי מדיד בספקטרום הפליטה המתאם עם הקרבה של ביומולקולות אינטראקטיביות¹⁸. AB משתמש בפוטו-הלבנה סלקטיבית של הפלואורופור המקבל ועוקב אחר שינויים בפלואורסצנטיות של התורם, מה שמאפשר לחוקרים להעריך קינטיקה ומרחקים של אינטראקציה¹⁹. FLIM מעריך את שיעורי הדעיכה הקרינה של הפלואורופור התורם, המושפעים ישירות מיעילות FRET, כדי לספק מדידות מדויקות בקנה מידה ננומטרי של אינטראקציות מולקולריות²⁰.

באמצעות טכניקות FRET, הדגמנו לאחרונה תגובות אינסולין דו-יציבות ב-myotubes שמקורם ב-C2C12 8,9,21,22,23,24. ספי ההפעלה והכיבוי המובהקים להפעלת Akt, כפי שגילינו, מצביעים על כך שתגובת מינון האינסולין המדורגת בכל הגוף סותרת את המורכבות של מפל האיתות התת-תאי החל מגירוי אינסולין, שמגיע לשיאו בתגובה של הכל או כלום ברמת התא הבודד 21,22,23,24. כדי לבחון נוכחות של דו-יציבות בסוגי תאים אחרים, גירינו תאי HepG2 עם אינסולין ורשמנו את תגובתם באמצעות הדמיית FRET של תא בודד. גירינו תאי HepG2 עם ריכוזי אינסולין משתנים וניטרנו את פעילות Akt ברמת התא הבודד באמצעות חיישן ביולוגי של Akt. החיישן הביולוגי של Akt כולל חלבון פלואורסצנטי ציאן משופר (ECFP)²⁵ כפלואורופור התורם והגרסה הבהירה ביותר של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YPet)²⁶ כפלואורופור המקבל, המקושר על ידי מקשר Eevee המכיל את רצף הפפטידים SGRPRTTTFADSCKP. פפטיד זה פועל כמצע ל-Akt זרחני (pAkt), המותאם לגליקוגן סינתאז קינאז אנושי 3β (GSK3β). במצבו הלא זרחני, ההפרדה המרחבית בין הפלואורופורים התורם והמקבל עולה על רדיוס פורסטר, המעכב את העברת האנרגיה. עם גירוי אינסולין, מתרחשת זרחון Akt ומוביל לזרחון של SGRPRTTTFADSCKP. תהליך זה גורם לשינוי קונפורמציה המביא את התורם והמקבל לרדיוס פורסטר, ומאפשר FRET²⁷. כתוצאה מכך, עוצמת אות ה-FRET מתואמת עם כמות מולקולות ה-Akt הזרחניות ומאפשרת כימות בזמן אמת של תגובות תאיות בתיווך אינסולין.

פרוטוקול זה, שפותח בתחילה כדי לחקור איתות אינסולין בשרירים שמקורם ב-C2C12, יושם בהצלחה על תאי HepG2 ונעשה בו שימוש בפלטפורמות חומרה ותוכנה שונות, ובכך מדגים את הישימות שלו, יכולת ההסתגלות והרבגוניות שלו. תאי HepG2 מציגים פעילות Akt מכוננת, מה שהופך אותם למודל אידיאלי במבחנה לחקר איתות אינסולין ספציפי לכבד ותהליכים מטבוליים. התכונות העיקריות של הפרוטוקול מתוארות שלב אחר שלב בסעיף הפרוטוקול.

סקירה כללית של השלבים הניסיוניים המעורבים בהדמיית תאים חיים FRET לניטור זרחון Akt בתאי HepG2 בודדים מוצגת באיור 1.

1. רכישה, התפשטות וטיהור פלסמיד

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים החיוניים לרכישה, הגברה וטיהור הפלסמיד הנדרש לניתוח FRET של תא יחיד.

1. השתמש בפלסמיד pEevee-iAkt-NES-YPet (איור 2A).
   הערה: הפלסמיד סופק בנדיבות על ידי פרופ' קזוהירו אאוקי במכון הלאומי לביולוגיה בסיסית (NIBB), יפן.מפות פלסמיד עבור חיישני הביו-FRET המשמשים לניטור Akt והבקרות שלהם בהתאמה מתוארות באיור 2. ה-pEevee-iAkt-NES-ECFP (תורם; איור 2B) ו-pEevee-iAkt-NES-Ypet (מקבל; איור 2C) פלסמידים משמשים כבקרות כיול במהלך ניסויי FRET⁹.
   הערה: איור 3 מציג את ההרכב והמנגנון של החיישן הביולוגי FRET התוך-מולקולרי.
2. כדי להפיץ את הפלסמיד, בצע טרנספורמציה חיידקית באמצעות תאי E. coli מוכשרים כימית (ראה טבלת חומרים). צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על אגר לוריא-ברטאני (LB) המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, בחר מושבה עמידה לאמפיצילין ותרבית אותה במרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין להגברת פלסמיד.
3. כדי לטהר את ה-DNA של הפלסמיד, השתמש בערכת טיהור DNA פלסמיד זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי להשיג טוהר ותשואה גבוהים. הערכת איכות ה-DNA על ידי מדידת יחסי ספיגה (A260/A280 ו-A260/A230) באמצעות ספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים). יחסים בין 1.8-2.0 ו-2.0-2.2 נחשבים אופטימליים. ודא את תקינות הפלסמיד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי להבטיח שהוא מתאים לטרנספקציה.

2. הליך תרבית תאים

הערה: בצע את כל הליכי תרבית התאים בתוך מכסה זרימה למינרי כדי לשמור על סביבה סטרילית ולמנוע זיהום. זרימת העבודה של תרבית תאים HepG2 מוצגת באיור 4. המדיה המלאה לתאי HepG2 מורכבת ממדיום חיוני מינימלי (MEM), 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1 מ"מ נתרן פירובט, 2 מ"מ תוסף L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין ו-2.5 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייקוטית (ראה טבלת חומרים, טבלה 1).

1. הפשרה מהירה של תאי HepG2 קפואים על ידי הנחת הבקבוקון בתרמו-מיקסר של 37 מעלות צלזיוס או באמבט מים עד להפשרה מלאה.
2. העבירו את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מצע גידול שלם (ראה טבלת חומרים).
   הערה: יש לחמם מראש את מדיום הגידול המלא ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש כדי למזער הלם תרמי לתאים.
3. צנטריפוגה את הצינור ב-200 x גרם למשך 5 דקות כדי לגלול את התאים.
4. שאפו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה רחב קדח כדי למנוע הפרעה לכדור התא.
5. השעו מחדש את הגלולה ב -10 מ"ל של מדיום גידול שלם טרי.
6. העבירו את תרחיף התאים לבקבוק תרבית רקמה בגודל 75 ס"מ.
7. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO₂
   הערה: התבונן בתאים במהלך 24-48 השעות הבאות כדי לאשר את ההתקשרות ולהעריך את ההתאוששות. אל תפריע לתאים למשך 4 שעות לפחות כדי להבטיח הצמדה נכונה לפני החלפת המדיום. הימנע מפתיחת החממה לעתים קרובות במהלך 4 השעות הראשונות, מכיוון שהדבר עלול לשבש את חיבור התאים. עקוב אחר פרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים והשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) כדי לשמור על סביבת עבודה בטוחה במהלך כל הליכי תרבית התאים. תת-תרבית תאי HepG2 כאשר הם מגיעים למפגש של 70%-80% לשמירה על תנאי גידול אופטימליים ומניעת צפיפות, מה שעלול להשפיע על כדאיות התאים ופוטנציאל הצמיחה.
8. לתת-תרבית, שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
9. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין כדי לכסות את שכבת התא החד-שכבתית (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ודא שהטריפסין מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפעילות מיטבית. אל תנסה יתר על המידה את התאים, מכיוון שהדבר עלול להפחית את הכדאיות. עקוב אחר התאים במיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק.
10. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-5 דקות.
11. כאשר התאים מתנתקים, הוסף 2 מ"ל של מדיום שלם כדי לנטרל את הטריפסין ולאסוף את התאים על ידי פיפטינג.
12. פיפטה בעדינות את מתלה התא כדי לפרק גושים ולהשיג תרחיף חד-תאי.
13. הוסף 3 מ"ל של מדיום שלם לכל בקבוק חדש, ולאחר מכן העביר את התאים ביחס מפוצל של 1:2 לכל בקבוק.
    הערה: עבור קטעים מוקדמים, פצל את התאים בדילול של 1:2. לאחר פסקאות 4-5, ניתן לבצע דילולים של 1:4 או 1:5 לפי הצורך.
14. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% CO₂.
    הערה: בדוק את התאים לאחר 24 שעות כדי לאשר את ההתקשרות ולהעריך את ההתאוששות.
15. לתרבית שגרתית, החלף את מדיום התרבות כל 2-3 ימים או מוקדם יותר אם מחוון ה- pH משתנה מוורוד לצהוב, מה שמעיד על החמצה.
    הערה: אל תתנו למדיום להיות חומצי מדי, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בתאים.
16. בדוק את המורפולוגיה של התא באופן קבוע תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את בריאות התא.
    הערה: לאחסון לטווח קצר, הקפיאו תאי HepG2 בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס; לאחסון לטווח הארוך, יש לאחסן בחנקן נוזלי. הרכב אמצעי ההקפאה ששימש בניסוי זה מתואר בטבלה 2.

3. ציפוי צלחות הדמיה בפולי-ליזין

1. השתמש ב-1 מ"ל של תמיסת פולי-L-ליזין של 0.1 מ"ג/מ"ל לכל צלחת הדמיה כדי לכסות את כל פני השטח (ראה טבלת חומרים).
   הערה: התאם את ריכוז הפולי-L-ליזין בהתאם לדרישות סוג התא הספציפיות.
2. נדנד את המנה בעדינות כדי להשיג ציפוי אחיד של משטח התרבות.
   הערה: הקפידו על תנאים סטריליים לאורך כל התהליך כדי למנוע זיהום.
3. דגרו את הכלים למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT).
4. שאפו עודפי תמיסת פולי-L-ליזין מהכלים על ידי פיפטינג החוצה.
5. שטפו את המשטח עם PBS שלוש פעמים, במנוחה במשך 5 דקות בכל פעם (ראו טבלת חומרים). הסר לחלוטין את הפולי-L-ליזין הלא קשור מצלחת ההדמיה כדי למנוע עיכוב צמיחת תאים. שטפו את הצלחות בעדינות כדי למנוע גירוד או נזק לתחתית הזכוכית.
6. יבש באוויר את כלי ההדמיה המצופים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות.
7. השתמש מיד בכלי ההדמיה המצופים או אחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.

4. טרנספקציה של תאי HepG2

הערה: שיטת הטרנספקציה HepG2 מודגמת באיור 5.

1. תאי HepG2 זרעים בצלחות הדמיה מצופות מראש 24-48 שעות לפני הטרנספקציה כדי להבטיח שהם מגיעים למפגש של 70%-90%.
2. הפשירו את מגיב הטרנספקציה והפלסמיד המקודד את החיישן הביולוגי FRET על קרח. מערבולת ביסודיות ובצע סיבוב קצר (למשל, 5,000 x גרם למשך 5 שניות) לפני השימוש (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ודא שמגיב הטרנספקציה והפלסמיד מופשרים במלואם לפני השימוש.
   זהירות: הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים, מכיוון שהדבר עלול להפחית את היעילות של מגיב הטרנספקציה.
3. הוסף 8 מיקרוגרם של פלסמיד המקודד את החיישן הביולוגי FRET עם מאגר התגובה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי מערבולת במשך 5 שניות במהירות גבוהה (כ-3,000-5,000 x גרם).
   הערה: הוסף תמיד פלסמיד למאגר לפני הוספת מגיב הטרנספקציה מבוסס הפולימר. לפחות 50 מיקרוליטר מהתמיסה חייבת להיות מורכבת ממאגר התגובה (ראה טבלת חומרים).
4. הוסף 2.4 מיקרוליטר של פולימר הטרנספקציה לצינור המכיל את ה-DNA של הפלסמיד המדולל. מערבבים היטב על ידי מערבולת במשך 15 שניות במהירות גבוהה (כ 3,000-5,000 × גרם).
   הערה: השתמש תמיד ב-0.3 מיקרוליטר של פולימר הטרנספקציה לכל 1 מיקרוגרם של DNA.
   זהירות: ודא שפולימר הטרנספקציה מעורבב היטב עם ה-DNA של הפלסמיד ליצירת קומפלקסים אחידים של ננו-חלקיקים.
5. דגרו את תערובת החיישן הביולוגי והפולימר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של ננו-חלקיקים.
   הערה: הימנע משמירה על פולימר הטרנספקציה בתמיסה במשך למעלה מ-30 דקות, מכיוון שהדבר עלול להפחית את יעילות ההעברה.
   זהירות: עקוב אחר זמן הדגירה בקפידה כדי למנוע דגירה יתר, מה שעלול להוביל ליעילות טרנספקציה מופחתת.
6. סובב את הצינור למשך 5 שניות ב-5,000 x g כדי לאסוף את התוכן בתחתית, ולאחר מכן הוסף את כל 100 מיקרוליטר של תמיסה מורכבת של ננו-חלקיקים טיפה למדיום תרבית התא. נדנד בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי לערבב.
   הערה: ודא שהתמיסה המורכבת של ננו-חלקיקים מתווספת טיפה כדי לפזר אותה באופן שווה על פני מדיום תרבית התאים.
   זהירות: הימנע מנדנוד נמרץ, מכיוון שהדבר עלול לעקור תאים או לגרום לפיזור לא אחיד של המתחמים.
7. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עד לילה.
   הערה: ניתן להתאים את זמן הדגירה על סמך צרכי הניסוי, אך 4 שעות מספיקות בדרך כלל להעברה יעילה.
   אזהרה: יש להימנע מדגירה ממושכת (>16 שעות), מכיוון שהדבר עלול להפחית את חיוניות התאים.
8. הסר את קומפלקסי הננו-חלקיקים מהתאים על ידי שאיפה, החלף אותם ב-2 מ"ל של מצע גידול שלם טרי, והחזיר את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס עד למועד הניתוח. ביטוי שיא מגיע בדרך כלל ל-48 שעות לאחר הטרנספקציה.
9. נתח את התאים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
   הערה: ודא שהמיקרוסקופ מכויל כראוי להדמיית פלואורסצנטי כדי לקבל תוצאות מדויקות.
   זהירות: צמצם את חשיפת התאים לאור עז במהלך ההדמיה כדי למנוע פוטוטוקסיות.

5. רעב של תאי HepG2

הערה: לאחר השלמת שלב הטרנספקציה, יש להרעיב את התאים בסרום לפני גירוי אינסולין והדמיית FRET. זה ממזער את הפעלת מסלול Akt עקב אינסולין הקיים ב-FBS ומבטיח רמות בסיס עקביות של פעילות Akt. הרכב תווך הרעב ששימש בניסוי זה מתואר בטבלה 3. BSA מגיע בצורת אבקה. להכנת תמיסה של 0.1% (w/v), יש להרכיב מחדש 0.1 גרם BSA ב-3 מ"ל DMEM, תוך ערבוב יסודי. עקרו את התמיסה באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר והתאימו את הנפח הסופי ל-100 מ"ל על ידי הוספת DMEM.

1. הסר את מדיום התרבית ושטוף את כלי ההדמיה עם PBS 1x פעמיים למשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: שתי שטיפות ה-PBS עוזרות להסיר לחלוטין שאריות סרום וכל אינסולין או גורמי גדילה שעלולים להפריע לניסוי.
2. הוסף 2 מ"ל של מדיום רעב לצלחות ההדמיה (ראה טבלת חומרים). מוסיפים בעדינות את המדיום סביב קצה הכלי כדי למנוע עקירת התאים מתחתית הזכוכית. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
   הערה: הדגירה של 4 שעות אופטימלית לסנכרון חילוף החומרים התאי; עם זאת, ניתן להאריך את משך הזמן בהתאם לצרכי הניסוי.

6. הדמיית תאים חיים FRET לתאי HepG2

הערה: סעיף זה מספק הוראות להדמיית תאים חיים של FRET לניטור הדינמיקה המרחבית-זמנית של זרחון Akt בתאי HepG2 בודדים. חיוני לייעל את הגדרת המיקרוסקופ, נהלי הטיפול ותנאי ההדמיה עבור תאי HepG2 חיים, כמפורט להלן. מערך המיקרוסקופ חיוני לאופטימיזציה של תנאי הדמיה להדמיית FRET. עקוב אחר הגדרת מיקרוסקופ סריקת לייזר PC/קונפוקלי (CLSM) שלב בהתאם להוראות היצרן כדי להבטיח פעולה יציבה. תצורת ה-CLSM המותאמת אישית להדמיית FRET מוצגת ב (איור 6).

1. הפעל את המתג המרוחק כדי להפעיל את המיקרוסקופ, המחשב, הסורק, שיגור הלייזר, שלב הפיזו ומקור אור LED אפיפלואורסצנטי. ודא שכל הרכיבים מחוברים כהלכה לפני ההפעלה כדי למנוע נזק אפשרי.
2. סובב את המקש למצב ON בשיגור הלייזר ולחץ על הכפתורים כדי להפעיל את שני הלייזרים הנדרשים ל-FRET (קווי לייזר של 457 ננומטר ו-514 ננומטר).
   הערה: ודא שהמסננים וההגדרות המתאימים נמצאים במקום להדמיית FRET אופטימלית. בחירת קו הלייזר צריכה להתבסס על פרופילי העירור והפליטה של החיישן הביולוגי.
3. הפעל את מפצל החשמל כדי להפעיל את המחשב והצג המחוברים למיקרוסקופ.
   הערה: ודא שכל החיבורים מאובטחים לפני ההפעלה כדי למנוע נזק לציוד.
4. היכנס ל-Windows והפעל את תוכנת המיקרוסקופיה.
5. לחץ על A1 for Acquisition כדי להתחיל את הגדרת ההדמיה. בחר את התצורות האופטיות המתאימות על סמך הדרישות של ניסוי FRET.
6. התאם את עוצמת הלייזר ורגישות הגלאי לפי הצורך לתנאי הדמיה מיטביים. התקן בזהירות את החממה העליונה של שלב המיקרוסקופ ואבטח אותו באמצעות ברגים.
   הערה: אין להדק יתר על המידה את הברגים כדי למנוע נזק לחממה או למיקרוסקופtagה.
7. מלאו את אמבט המים הפנימי במים מזוקקים כפולים סטריליים (ddH₂O). התקן את המחמם העליון בצורה מאובטחת והפעל את ספק הכוח עבור ה-stagמחמם, מחמם האמבטיה ומחמם העדשות (איור 7A).
   הערה: אין למלא יתר על המידה כדי למנוע שפיכה למערכת. ודא שכל תנורי החימום פועלים כראוי כדי לשמור על תנאי טמפרטורה עקביים להדמיית תאים חיים.
8. השתמש בעדשת טבילת שמן 40x להדמיה (ראה טבלת חומרים).
   הערה: עיין ביצרן webאתר למפרט טכני.
9. נגב את עדשת המטרה בנייר עדשה רטוב באתנול 95%. הנח טיפה קטנה של שמן טבילה על עדשת האובייקט (איור 7B). הנח את צלחת ההדמיה המכילה את תאי HepG2 על שלב המיקרוסקופ ואבטח אותה עם המחזיק (איור 7C).
   הערה: ודא שצלחת ההדמיה מיושרת ומאובטחת כהלכה כדי למנוע תנועה במהלך ההדמיה. הימנע מלחץ על העדשה כדי למנוע נזק הן לעדשה והן לתחתית הזכוכית של הכלי.
10. סגרו את התא ודגרו על התאים בתוך תא התאים החיים למשך 1-2 שעות כדי לאפשר להם להתייצב בשיווי משקל (איור 7D).
11. במהלך הדמיית זמן-lapse, עצור במרווחי זמן ספציפיים והסר בעדינות את המדיה (איור 7E), ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל של מדיה טרייה שהוכנה עם ריכוז האינסולין הנתון (איור 7F, טבלת החומרים).
    הערה: הכן תמיסת מלאי אינסולין של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 1 מ"ג אינסולין ב-1 מ"ל של 10 מ"ל של חומצה אצטית של 10 מ"מ. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק סטרילי של 0.2 מיקרומטר ואחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
12. הפעל את חלון רכישת ND מתפריט File של תוכנת המיקרוסקופיה.
    הערה: הגדרת רכישת ND מוצגת ב (איור 8).
13. בחר את הכרטיסיה זמן כדי להגדיר את מרווח הזמן, משך הזמן והלולאות הרצויות עבור הדמיית זמן-lapse. לאחר מכן, לחץ על XY הכרטיסייה ולחץ על + להוסיף כפתור כדי לכלול תאי HepG2 בודדים להדמיה.
14. כדי להוסיף תאים מרובים, אתר תאים מתאימים, סרוק, כוונן את המיקוד ונעל את פונקציית התפשטות הנקודה (PSF). חזור על שלב זה עבור כל תא חדש שנוסף להדמיה. סרוק תאים מרובים במיקומים שונים בתוך צלחות ההדמיה כדי לזהות תאי מטרה שונים להכללה.
15. לחץ על סמל ה- X האדום כדי לבטל את הבחירה בתאים. סמן את התיבה 'Z' כדי להגדיר את מיקום Z. לאחר בחירת כל הפרמטרים, הזן את שם הניסוי בתיבה 'שם קובץ' .
16. לחץ על עיון כדי לבחור את תיקיית היעד ולאחר מכן סמן את התיבה שמור בקובץ. לחץ על הפעל עכשיו הכרטיסייה כדי להתחיל את רכישת ה-ND. חלון רכישת ND יציג את ההתקדמות בזמן אמת של הדמיית זמן-lapse, כולל הזמן שחלף והזמן שנותר.
17. רשום מדידות בסיסיות עד 30 דקות מבלי לגרות את התאים באינסולין.
18. אתר תאים מתאימים, התקרב/הקטן כדי להביא תא בודד למיקוד ובחר תאים בעלי עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה. הוסף את התאים בזה אחר זה, עד 6 תאים לכל היותר.
    הערה: הגבל את מספר התאים כדי למנוע עיכובים ברכישת תמונות והקפאת חלונות במהלך ההדמיה.
19. הגדר את הזמן ואת תדירות ההדמיה עבור הדמיית דולג הזמן. התחל את הדמיית דולג הזמן.
    הערה: ודא שכל הפרמטרים, כולל זמן החשיפה ועוצמת הלייזר, ממוטבים לפני תחילת הפעלת ההדמיה.
20. השהה את ההדמיה במרווחי זמן קבועים, הסר בעדינות את המדיה מכלי הזכוכית והוסף 1 מ"ל של מדיום בתוספת ריכוז האינסולין המתאים.
21. המשך את רכישת התמונה. חזור על שלב 6.20 כנדרש.
22. בסוף הניסוי, לחץ על הכרטיסייה סיום כדי לסגור. גבה ואחסן תמונות שנרכשו בצורה מאובטחת לניתוח.

7. ניתוח נתונים

1. תקן את נתוני הדמיית ה-FRET המעובדים מראש מדגימות בקרה עבור הצלבה ספקטרלית ואוטופלואורסצנציה של CFP, מה שמביא לערכי FRET מתוקנים ויעילות FRET מדויקת. השתמש בתוכנת הדמיה לרכישה, עיבוד וניתוח של תמונות FRET, בהתאם לפרוטוקולים שתוארו במחקרים קודמים 27,28,29,30 (איור 9).

8. חישובי יעילות FRET

1. כדי לקבוע את יעילות FRET, רכוש שבע תמונות: תא (I_DA(D), I_DD(D), I_DA(A), I_AA(A), I_DD, I_AA ו-I_DA). חשב את יעילות ה- FRET באמצעות הנוסחה הבאה:
   
   כאשר FRET_Corrected מתקבל מהמשוואה:
   
   עם d ו-a מוגדרים כ:
   
   
   כאן I_DA, I_DD ו-I_AA מייצגים תמונות של תאים שעברו טרנספטציה עם החיישן הביולוגי. I_DA(D)  ו-I_DD(D)) הן תמונות בקרה של תורמים בלבד, ו-I_DA(A) ו-I_AA(A) הן תמונות בקרה של מקבלים בלבד.

9. רכישת תמונות

1. I_DA : השג את התמונה על ידי עירור תורם (434 ננומטר) עם פליטת מקבל (530 ננומטר).
2. I_DD : השג את התמונה על ידי עירור תורם (434 ננומטר) עם פליטת תורם (477 ננומטר).
3. I_AA : השג את התמונה על ידי עירור מקבל (517 ננומטר) עם פליטת מקבל (530 ננומטר).
4. I_DA(D) ו - I_DA(A) : רכוש את התמונה באמצעות אותו עירור ופליטה כמו I_DA אך מתאים המבטאים רק את התורם והמקבל, בהתאמה.
5. I_DD(D) : רכוש את התמונה באותם תנאים כמו I_DD לשליטת התורם בלבד.
6. I_AA(A) : השג את התמונה תוך שימוש באותם תנאים כמו I_AA אך היא ספציפית לבקרת המקבל בלבד.

10. תיקון רקע

1. פתח את תוכנת ניתוח התמונות במחשב. משורת התפריטים העליונה, גש לתפריט קובץ. בחר פתח או פתח קובץ מהאפשרויות הנפתחות.
2. נווט אל הספרייה המכילה את נתוני התמונה של זמן-lapse. אתר את תמונת דולג הזמן הדורשת ניתוח (למשל, פורמט nd2).
3. בחר את הקובץ ולחץ על פתח או אישור כדי לטעון אותו לתוכנה להצגה וניתוח. הגדר אזור עניין (ROI) בתוך התא (או השתמש בתא כולו כ- ROI) ורשום את הערך האפור של כל פיקסל באזור זה.
4. בחר אזור נטול תאים כרקע וחשב את ערך האפור הממוצע שלו. צור את התמונה המתוקנת על ידי הפחתת ממוצע רקע זה מערך האפור של כל פיקסל בתוך החזר ה-ROI של התא.

11. חיסול דימום FRET (הצלבה)

הערה: החפיפה הספקטרלית בין פליטת התורם לעירור המקבל מתוארת באיור 3B, שהיא קריטית ליעילות FRET ולתהליך העברת האנרגיה. דימום בהדמיית FRET בזמן-lapse הוא אתגר משמעותי הנובע מהחפיפה הספקטרלית של פלואורופורים תורמים ומקבלים, מה שמוביל למדידות לא מדויקות. דיבור צולב הוא אינהרנטי מכיוון שהספקטרום של הפלואורופורים התורמים והמקבלים חופפים במידה מסוימת (איור 3C, D). בעיה זו מחמירה על ידי גורמים כמו ריכוזי פלואורופור גבוהים ותצורות מסנן לא תקינות. טיפול בדימום הוא חיוני להבטחת האמינות של מדידות FRET.

1. עיין במחקר קודם לשיטה להפחתת השפעות הדימום⁹.

12. כימות וניתוח סטטיסטי

1. לבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי.

כדי לחקור את הפעלת Akt בתאי HepG2, התאים נזרעו על צלחות הדמיה מצופות מראש והועברו עם החיישן הביולוגי מבוסס FRET pEevee-iAkt-NES (איור 2A), שנועד לאפשר ניטור בזמן אמת של זרחון Akt. לאחר הטרנספקציה, התאים עברו רעב בסרום במשך 4 שעות במדיום נטול סרום כדי לסנכרן את מצבם המטבולי ולמזער את איתות האינסולין הבסיסי.

התאים נחשפו לאחר מכן לריכוזי אינסולין משתנים (0 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM ו-0 pM) כדי להפעיל באופן שיטתי את מסלול איתות האינסולין. כפי שמוצג באיור 10A, נצפתה עלייה תלוית מינון בזרחון Akt. יש לציין כי עלייה חדה בזרחון התרחשה באינסולין של 300 pM, מה שסימן את הסף להפעלה מקסימלית של Akt. מעבר לריכוז זה, רמות הזרחן התייצבו, עם עלייה הדרגתית שנצפתה עד 500 pM.

מעניין לציין שכאשר ריכוזי האינסולין הופחתו ברצף מ-500 pM ל-0 pM, הפעלת Akt נשמרה, כאשר רמות הזרחן נותרו גבוהות ולא הצליחו לחזור לנקודת ההתחלה. תופעה זו מצביעה על הפעלת Akt מכוננת, מה שמרמז על כך שברגע שעוברים את סף ההפעלה באינסולין של 300 pM, זרחון Akt נשאר פעיל ללא קשר להפחתות שלאחר מכן בריכוז האינסולין.

הנתונים המנורמלים המוצגים באיור 10B,C התקבלו משלושה ניסויים עצמאיים. בניסויים אלה, בהם התאים עוררו עם עלייה רציפה בריכוזי האינסולין (0 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM ו-500 pM), ואחריהם ירידה הדרגתית (500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM ו-0 pM). ניסוי זה הדגים דפוס דומה של הפעלת Akt, המאשר את התגובה תלוית המינון ואת פעילות ה-Akt המתמשכת מעבר לסף ההפעלה.

איור 1: זרימת עבודה של הדמיית FRET בתאי HepG2 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מפות פלסמיד של חיישנים ביולוגיים FRET עבור ניטור Akt. (A) pEevee-iAkt. (B) pEevee-iAkt-NES-ECFP (תורם). (C) pEevee-iAkt-NES-YPet (מקבל). נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ההרכב והמנגנון של החיישן הביולוגי FRET התוך-מולקולרי. (A) פוספו-Akt מזרחן את פפטיד הסובסטרט (SGRPRTTTFADSCKP), המקדם קשירת PBD וגורם לשינוי קונפורמציה, המאפשר העברת אנרגיה מהפלואורופור התורם לפלואורופור המקבל^27,31. (ב) חפיפה ספקטרלית בין פליטת התורם לעירור המקבל. (C) הצלבה של עירור מתעוררת עקב החפיפה בין ספקטרום העירור של ECFP ו-YPet. (D) הצלבת פליטה מתרחשת בגלל החפיפה בין ספקטרום הפליטה של ECFP ו-YPet. נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זרימת עבודה של תרבית תאים HepG2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: טרנספקציה של HepG2. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תצורת CLSM מותאמת אישית עבור הדמיית FRET. (A) בחר את הערוצים הרצויים והגדר את ההגדרות בלוח הנתיב האופטי. (B) בחלונית ההגדרות של Aplus, בחר את הערוצים המתאימים, הגדר את עוצמת הלייזר ועוצמתו, זמן השהייה של הפיקסלים, חור הסיכה ופרמטרים רלוונטיים אחרים. השאר את ההיסט מוגדר ל-"0" כברירת המחדל. נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: הגדרת מיקרוסקופ והכנת דגימה עבור הדמיית תאים חיים. (א) התקן את החממה העליונה TOKAI HIT Stage כדי לווסת את הטמפרטורה ורמות ה-CO₂ . (B) מרחו שמן טבילה על עדשת טבילת השמן 40×. (ג) התקן צלחת הדמיה של 35 מ"מ עם תחתית זכוכית על הטמפרטורה מבוקרתtagה. (D) דגימות דגירה מוקדמות בתא התא החי כדי לאזן את תנאי הסביבה. (E) הסר מדיה באמצעות משאבה פריסטלטית מדויקת. (F) הוסיפו חומר עם תוספת אינסולין לכלי באמצעות קצה פיפטה עדין. נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: הגדרת רכישת ND עבור הדמיית זמן-lapse. (A) בחלון רכישת ND, הפעל את אפשרות הזמן כדי להגדיר את המרווח, משך הזמן ומספר הלולאות עבור ניסוי זמן-lapse. (B) לחץ על אפשרות XY כדי לבחור או לבטל את הבחירה של תאים בודדים להדמיה. (ג) הפעל את אפשרות Z כדי לנעול את מיקום Z ולחץ על "הפעל" כדי לחדש את הניסוי. (D) חלון התקדמות ה-ND יופיע ויציג את הסטטוס בזמן אמת של הניסוי. נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: זרימת עבודה עבור ניתוח נתוני FRET. נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: תמונות מייצגות של זמן-lapse ויחס אותות FRET מנורמל ממוצע של זרחון Akt בתאי HepG2 בודדים. (A) תאי HepG2 הפגינו יעילות FRET מקסימלית כאשר הם מגורים עם אינסולין של 300 pM, שסימן את הסף להפעלת Akt מקסימלית. עלייה הדרגתית ביעילות FRET נצפתה כאשר ריכוזי האינסולין עלו ל-500 pM. אפילו עם ירידה הדרגתית בריכוז האינסולין מ-500 pM ל-0 pM במרווחי זמן שונים, הפעלת Akt מתמשכת נמשכה, מה שמעיד על זרחון Akt מכונן. (B) אות FRET משורטט כנגד ריכוז האינסולין, וממחיש תגובה דמוית מתג בלתי הפיכה. (C) אות FRET משורטט כנגד הזמן שחלף, עם פסי שגיאה המציינים סטיית תקן. נתון זה אומץ באישור Akhtar et ^al.8. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב מדיה מלא של MEM.

טבלה 2: הרכב מדיום הקפאה.

טבלה 3: הרכב מדיום הרעב.

הפרוטוקול להדמיית FRET של תאים חיים לניטור זרחון Akt בתאי HepG2 כולל מספר שלבים מרכזיים כדי להבטיח תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. השלב הקריטי הראשון הוא תרבית תאים, הכוללת תחזוקה שוטפת של תאים, ציפוי צלחות הדמיה וזריעת תאים. ציפוי נכון חיוני לחיבור תאים במהלך ניסויי הדמיה בזמן-lapse, מכיוון שהוא מבטיח היצמדות יציבה של תאים, מונע ניתוק וממזער סחיפה, מה שעלול להוביל לנתונים לא עקביים ^9,32. שינויים בעובי התא או במבנים תת-תאיים עלולים לגרום לכך שחלקים מהתא לא יהיו ממוקדים, מה שמשפיע על דיוק המדידה. טמפרטורה, pH וריכוזי יונים משפיעים על אותות FRET ומוסיפים שונות 33,34,35. חיבור תאים נכון תומך בבריאות התאים, שומר על שלמות האיתות ומבטיח מדידות FRET מדויקות. טרנספקציה של תאי HepG2 עם חיישן Akt מבוסס FRET הוא צעד קריטי, מכיוון שיעילות הטרנספקציה משפיעה ישירות על עוצמת אות ה-FRET והעקביות³¹. עם זאת, טרנספקציה חולפת מובילה מטבעה להטרוגניות בביטוי חיישנים ביולוגיים. ניתן למזער שונות זו על ידי אופטימיזציה של תנאי טרנספקציה, יישום בקרות קפדניות ובחירת תאים עם עוצמת פלואורסצנטיות אחידה. הבטחת ביטוי הומוגני על פני אוכלוסיית התאים חיונית להשגת תוצאות עקביות ואמינות. כיול פליטה רגישה (SE) באמצעות דגימות בקרה - כגון מבנים של תורם בלבד, מקבל בלבד ותורם-מקבל - הוא חיוני לכימות מדויק של יעילות FRET. כיול זה מתקן הצלבה ספקטרלית וקובע מדידות בסיס עקביות, מה שמאפשר פרשנות נתונים מדויקת 28,36,37,38.

בעוד ששיטת SE-FRET מספקת תובנות חשובות בזמן אמת לגבי דינמיקת זרחון Akt, יש לטפל במספר מגבלות כדי להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות. דיבור ספקטרלי בין פלואורופורים תורם ומקבל יכול לעוות אותות FRET, מה שמחייב שימוש בדגימות בקרה מרובות²⁸. מגבלות דימום ספקטרלי (SBT) ועומק שדה במיקרוסקופיה משפיעות באופן משמעותי על הדיוק של ניתוח FRET בתאים בעלי עובי או מורפולוגיה משתנים. אתגרים אלה מחייבים שיטות תיקון מתקדמות לשיפור אמינות המדידה^27,39. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, על החוקרים לייעל את ביטוי הפלואורופור של התורם/מקבל, לחדד את הליכי הטרנספקציה ולערוך ניסויי בקרה חזקים לתיקון אותות לא ספציפיים ולהבטיח איסוף נתונים מדויק^28,39. שליטה לא מספקת בגורמים אלה עלולה להוביל למסקנות שגויות, אך טכניקות נורמליזציה מתקדמות, כמו אלה שפותחו על ידי Hoppe et ^al.40 ו-Zal and Gascoigne⁴¹, יכולות לתקן הפרעות ספקטרליות ולשפר את הדיוק של מדידות FRET בסביבות תאיות מורכבות. בנוסף, שיטות נורמליזציה מתקדמות של FRET, כפי שהודגש על ידי Hochreiter et ^al.42, מאפשרות ניתוח כמותי של אינטראקציות חלבון, כולל סטוכיומטריות וזיקה יחסית בתאים חיים, ומספקות הבנה מעמיקה יותר של דינמיקת חלבונים בתנאים שונים.

בנוסף למגבלות הטכניות הללו, שילוב מודלים חישוביים של מסלולי איתות הוא חיוני לשיפור הפרשנות של תוצאות SE-FRET. מודלים אלה מספקים מסגרת מובנית לפירוש נתונים ביולוגיים מורכבים. על ידי הדמיית רשתות איתות, חוקרים יכולים להבין טוב יותר את הדינמיקה של אינטראקציות מולקולריות ואת ההשפעות של הפרעות, מה שמוביל לתחזיות ותובנות מדויקות יותר 43,44,45,46. לדוגמה, מחקרים על מסלול mTOR זיהו מתגים דו-יציבים בהפעלת Akt, שבהם האיתות עובר בין מצבים יציבים מובהקים החיוניים לוויסות תהליכים כמו התפשטות תאים והישרדות^47,48. מודלים כאלה מדגישים את המורכבות של איתות Akt, במיוחד בתאים סרטניים שבהם הפעלה מתמשכת מניעה את התקדמות המחלה. על ידי שילוב הדמיית SE-FRET בזמן אמת עם מודלים חישוביים, חוקרים יכולים לקבל תובנות עמוקות יותר לגבי האופן שבו לולאות משוב ושינויים זמניים בפעילות Akt משפיעים על תגובות תאיות, ותורמים להבנה מקיפה יותר של מחלות מטבוליות וסרטן 13,48,49,50.

השיטה המבוססת על FRET מציעה יתרונות משמעותיים על פני גישות מסורתיות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ודינמיקת איתות, במיוחד במסלולים מווסתים מטבולית⁵¹. בניגוד למבחנים ביוכימיים בתפזורת, הדמיית FRET מספקת רזולוציה מרחבית וזמנית ברמת התא הבודד, ומאפשרת תצפית בזמן אמת על תהליכים דינמיים בתאים חיים. יכולת זו לעקוב אחר אירועים מולקולריים ברמת התא הבודד מספקת תובנות לגבי הטרוגניות תאית, החשובה להבנת האופן שבו שינויים מטבוליים (כגון אלה הנגרמים על ידי זמינות חומרים מזינים, איתות אינסולין או מתח מטבולי) יכולים להשפיע על דינמיקת האיתות של Akt. בהשוואה לטכניקות אחרות המבוססות על פלואורסצנטיות, FRET רגיש באופן ייחודי לשינויים במרחק בין חלבונים הפועלים באינטראקציה, מה שהופך אותו לאידיאלי לזיהוי שינויים קונפורמטיביים עדינים או חולפים ואינטראקציות חלבונים ^8,9,52. עם זאת, העברת אנרגיית תהודה ביולומינסנציה (BRET) ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים עם FRET (FLIM-FRET) הן טכניקות מתקדמות לחקר אינטראקציות חלבון, שכל אחת מהן מציעה יתרונות ייחודיים בהקשרים ניסיוניים ספציפיים. BRET משתמש בזוהר מלוציפראז כדי למזער בעיות כמו פוטו-הלבנה ואוטופלואורסצנטיות, מה שהופך אותו ליעיל במיוחד לכימות ביטוי חלבון ממברנה⁵³. לעומת זאת, FLIM-FRET מספק הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח כמותי של אינטראקציות חלבון, במיוחד בתנאים טבעיים, על ידי מדידת שינויים באורך החיים הקרינה^54,55. בעוד שלשיטות אלה יש מגבלות, הן מציעות תובנות משלימות בהקשרים ניסיוניים ספציפיים.

הפרוטוקול מבוסס FRET לניטור זרחון Akt בתאי HepG2 חיים מציע תובנות משמעותיות לגבי איתות תאי, במיוחד בהקשר של מחלות מטבוליות כמו סוכרת וסרטן. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של תהליכים דינמיים, ומשפרת את ההבנה של תפקידו של Akt בוויסות מטבולי ופתוגנזה של מחלות 27,31,56. יכולת ההסתגלות של שיטות לחקר הפעלת Akt על פני סוגי תאים שונים משפרת משמעותית את התועלת שלהן בחקר הסרטן. גמישות זו מאפשרת לחוקרים לחקור מנגנוני איתות ספציפיים לסוג התא, שיכולים להוביל לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות¹³. יתר על כן, החוסן של פרוטוקולים אלה מאפשר לחקור מסלולי איתות אחרים ואינטראקציות חלבון, ולשפר את ההבנה של תהליכים תאיים. הפוטנציאל להתאמה בתפוקה גבוהה של שיטות אלה פותח אפיקים חדשים לגילוי תרופות, במיוחד בסרטן ומחלות מטבוליות 12,13,56. לפיתוח חיישנים ביולוגיים חדשים המשתמשים בחלבונים פלואורסצנטיים מגוונים (FPs), יחד עם טכניקות מתקדמות כגון מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), יש פוטנציאל משמעותי לשפר את התועלת של בדיקות מבוססות FRET. חידושים אלה משפרים את הרגישות, מפחיתים הצלבה ספקטרלית, מאפשרים הדמיה מרובת ומספקים דיוק כמותי, המרחיב את הישימות של FRET במחקר ביו-רפואי. התקדמות כזו מאפשרת חקירה של רשתות איתות מורכבות, סינון תרופות בתפוקה גבוהה ומודלים של מחלות עם דיוק ואמינות גדולים יותר.

לסיכום, בעוד ש-SE-FRET מציגה מגבלות מסוימות, בקרות קפדניות ואסטרטגיות הדמיה מתקדמות מתמודדות עם אתגרים אלה. זה הופך את SE-FRET לכלי רב עוצמה ורב-תכליתי להבהרת דינמיקה תאית מורכבת. היכולת שלו להתבונן בדינמיקה של תא בודד בזמן אמת מציעה יתרונות מובהקים על פני בדיקות בתפזורת ומספקת תובנות לגבי אינטראקציות מולקולריות שעלולות להישאר בלתי מזוהות. יכולת זו חשובה במיוחד לחקר זרחון Akt, שבו הבנת הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של אירועי איתות היא חיונית לפיתוח טיפולים ממוקדים למחלות מטבוליות כגון עמידות לאינסולין וסרטן.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן למדעי הטבע של שנזן (JCYJ20240813113606009), אזור שיתוף הפעולה שנג'ן-הונג קונג לטכנולוגיה וחדשנות (HZQB-KCZYB-2020056), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070681), תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2019YFA0906002) ותוכנית הטווס של שנזן (KQTD2016053117035204).