JoVE Logo

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מדווח כאן על פרוטוקול לאבלציה סלקטיבית של מקרופאגים כלייתיים כדי לחקור את התחדשותם באמצעות כלי אבלציה של תאי CD59/intermedilysin אנושיים. שיטה זו ישימה גם לחקר התפקוד וההתחדשות של אוכלוסיות תאים אחרות בכליות, בכבד וברקמת השומן.

Abstract

מקרופאגים כלייתיים (RMs) חיוניים לבריאות הכליות, תזמור מעקב חיסוני, הומאוסטזיס רקמות ותגובות לפציעה. בעבר, דיווחנו על שימוש בכלי אבלציה של תאים אנושיים CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) כדי לחקור את הגורל המובהק, הדינמיקה והנישות של RMs ממקור מח עצם או עוברי. מקורם של RMs במקרופאגים שמקורם בשק חלמון, מונוציטים בכבד עוברי ומונוציטים שמקורם במח העצם ונשמרים בבגרות באמצעות ריבוי מקומי וגיוס של מונוציטים במחזור הדם. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לאבלציה סלקטיבית של RMs כדי לחקור את התחדשותם, כולל 1) יצירה ואפיון של ביטוי השראת Cre של hCD59 ב-RMs של עכברים, 2) טיהור ILY ואפיון פעילות ILY, 3) אינדוקציה של ביטוי hCD59 על RMs בעכברים מורכבים, ו-4) אפיון התחדשות לאחר אבלציה של RM בתיווך ILY. ILY מדלדל באופן ספציפי ומהיר RMs בעכברים מורכבים, עם אבלציה יעילה של מקרופאגים תוך יום אחד ממתן ILY. התחדשות מקרופאגים כלייתיים החלה ביום השלישי לאחר האבלציה, עם התאוששות של ~88% ביום השביעי. מודל זה מציע כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של מקרופאגים ויכול לשמש להסרת אוכלוסיות תאים אחרות בכליות, בכבד וברקמות השומן כדי לחקור את תפקודם והתחדשותם.

Introduction

מקרופאגים כלייתיים (RMs) הם תאים חיסוניים חיוניים השומרים על הומאוסטזיס בכליות, מווסתים את התגובות החיסוניות ומקדמים תיקון רקמות לאחר פציעה. הם מבצעים מגוון פונקציות, כולל פגוציטוזיס, הצגת אנטיגן ותזמור של תגובות דלקתיות ואנטי דלקתיותכאחד 1,2,3. בהתאם לסביבה המקומית, RMs יכולים לקטב לפנוטיפים פרו-דלקתיים (M1) או אנטי דלקתיים (M2), או להחמיר פציעה או להקל על ריפוי 4,5,6. חוסר ויסות של RMs היה מעורב בהופעה והתקדמות של פגיעה כלייתית חריפה (AKI) ומחלת כל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקולי המחקר בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוליין, בית הספר לרפואה (פרוטוקול מספר 1482). עכברי הניסוי, Cx3cr1CreER+/+ ו-ihCD59+/+, בגילאי 10-12 שבועות ובמשקל 25-30 גרם, שוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) במתקן בעלי החיים של האוניברסיטה. כל ההליכים הכרוכים בבידוד כליות נערכו בסביבה סטרילית, כאשר החוקרים לבשו כפפות ומסכות פנים כדי למנוע זיהום. פרטים לגבי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. השג עכברי CX3CR1CreER+/+ ממעבדת ג....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הטיהור של His-Tag רקומביננטי ILY פעל לפי אותו פרוטוקול שתואר קודם לכןב-14. ILY התבטא בהצלחה בתאי E. coli BL21(DE3), שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד המקודד את הגן ILY מסטרפטוקוקוס אינטרמדיוס. עם השראת IPTG, ביטוי יתר של חלבון המטרה היה ברור. לאחר הביטוי, ILY טוהר באמצעות כרו?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הביטוי, הטיהור והאימות התפקודי המוצלח של ILY רקומביננטי מתויג His במחקר זה עקבו אחר פרוטוקול מבוססהיטב 15. עם זאת, התהליך כלל מספר שלבים קריטיים שהבטיחו תפוקת חלבון גבוהה, טוהר ופעילות ביולוגית. השראת תאי E. coli BL21 (DE3) עם IPTG עברה אופטימיזציה ?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים או קשרים אישיים שהיו יכולים להשפיע על העבודה המדווחת בכתב יד זה. שום ניגוד אינטרסים, כולל שיוך כספי, לא פיננסי, מקצועי או אישי, לא השפיע על העיצוב, הביצוע, הפרשנות או ההצגה של המחקר.

Acknowledgements

אנו מביעים את תודתנו לחברים בעבר ובהווה במעבדת צ'ין על תרומתם לפיתוח ולשכלול הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה. אנו מודים גם לקבוצתו של ד"ר ר.ק. טוויטן במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה על האספקה הנדיבה של הפלסמיד הרקומביננטי ILY, שהיה חיוני במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) באמצעות מענק NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) ו-R21OD024931 (X.Q).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm syringe filterMilliporeSLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad4568084
6X Loading bufferFisher50-103-6570
70% EthanolWWR Life Science64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing BufferGibcoA1049201
Affinity resin beadsMillipore69670
Ampicillin sodium solutionZymo ResearchA1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)eBioscience48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)eBioscience48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)BioLegend 123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Aqua Live/Dead dyeInvitrogen    L34957A
Beads (resin)Millipore69670
Benzonase NucleaseMillipore70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagentMillipore70584-4
Centrifuge for microtubesEppendorf5424
Centrifuge for tubesThermo Scientific75-001-241
Collagenase type IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
Corn oilSigma AldrichC8267
Deoxyribonuclease (DNAse) IWorthington Biochemical CorporationLS002007
Detoxi-Gel resin columnMillipore69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solutionCorning21-031-CV
EDTA tubesBD365974
FBS (Fetal bovine serum)Gibco10082-139
GlycerolFisherBP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)Gibco24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Millipore-Sigma206-703-0
IsofluraneVET one502017
LB media
LSRFortessa flow cytometerBD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]Fisher50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]Fisher50-213-522
Percoll density gradient mediaCytiva17089101
Peristaltic pumpFisher ScientificDiscontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)Thermo ScientificI28800
Purification columnMilliporeUFC900308
rLysozyme solutionNovagen20C71110
Shaking water bath Thermo ScientificTSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kitThermo66107
Sodium deoxycholateFisherBP349-100Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)Fisher Scientific22-363-547
TamoxifenSigma Aldrich6734
Ultra centrifugal filterMilliporeUFC900308
Ultrapure waterThermo10977-015
Vortex mixerFisher Scientific2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)FisherBP176-100

References

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved