דלדול מהיר של מקרופאגים כלייתיים באמצעות כלי אבלציה של תאים CD59/Intermedilysin אנושי

מדווח כאן על פרוטוקול לאבלציה סלקטיבית של מקרופאגים כלייתיים כדי לחקור את התחדשותם באמצעות כלי אבלציה של תאי CD59/intermedilysin אנושיים. שיטה זו ישימה גם לחקר התפקוד וההתחדשות של אוכלוסיות תאים אחרות בכליות, בכבד וברקמת השומן.

מקרופאגים כלייתיים (RMs) חיוניים לבריאות הכליות, תזמור מעקב חיסוני, הומאוסטזיס רקמות ותגובות לפציעה. בעבר, דיווחנו על שימוש בכלי אבלציה של תאים אנושיים CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) כדי לחקור את הגורל המובהק, הדינמיקה והנישות של RMs ממקור מח עצם או עוברי. מקורם של RMs במקרופאגים שמקורם בשק חלמון, מונוציטים בכבד עוברי ומונוציטים שמקורם במח העצם ונשמרים בבגרות באמצעות ריבוי מקומי וגיוס של מונוציטים במחזור הדם. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לאבלציה סלקטיבית של RMs כדי לחקור את התחדשותם, כולל 1) יצירה ואפיון של ביטוי השראת Cre של hCD59 ב-RMs של עכברים, 2) טיהור ILY ואפיון פעילות ILY, 3) אינדוקציה של ביטוי hCD59 על RMs בעכברים מורכבים, ו-4) אפיון התחדשות לאחר אבלציה של RM בתיווך ILY. ILY מדלדל באופן ספציפי ומהיר RMs בעכברים מורכבים, עם אבלציה יעילה של מקרופאגים תוך יום אחד ממתן ILY. התחדשות מקרופאגים כלייתיים החלה ביום השלישי לאחר האבלציה, עם התאוששות של ~88% ביום השביעי. מודל זה מציע כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של מקרופאגים ויכול לשמש להסרת אוכלוסיות תאים אחרות בכליות, בכבד וברקמות השומן כדי לחקור את תפקודם והתחדשותם.

מקרופאגים כלייתיים (RMs) הם תאים חיסוניים חיוניים השומרים על הומאוסטזיס בכליות, מווסתים את התגובות החיסוניות ומקדמים תיקון רקמות לאחר פציעה. הם מבצעים מגוון פונקציות, כולל פגוציטוזיס, הצגת אנטיגן ותזמור של תגובות דלקתיות ואנטי דלקתיות^{כאחד 1,2,3}. בהתאם לסביבה המקומית, RMs יכולים לקטב לפנוטיפים פרו-דלקתיים (M1) או אנטי דלקתיים (M2), או להחמיר פציעה או להקל על ריפוי ^4,5,6. חוסר ויסות של RMs היה מעורב בהופעה והתקדמות של פגיעה כלייתית חריפה (AKI) ומחלת כל....

פרוטוקולי המחקר בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוליין, בית הספר לרפואה (פרוטוקול מספר 1482). עכברי הניסוי, Cx3cr1CreER^+/+ ו-ihCD59^+/+, בגילאי 10-12 שבועות ובמשקל 25-30 גרם, שוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) במתקן בעלי החיים של האוניברסיטה. כל ההליכים הכרוכים בבידוד כליות נערכו בסביבה סטרילית, כאשר החוקרים לבשו כפפות ומסכות פנים כדי למנוע זיהום. פרטים לגבי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

1. השג עכברי CX3CR1CreER^+/+ ממעבדת ג....

הטיהור של His-Tag רקומביננטי ILY פעל לפי אותו פרוטוקול שתואר קודם לכן^ב-14. ILY התבטא בהצלחה בתאי E. coli BL21(DE3), שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד המקודד את הגן ILY מסטרפטוקוקוס אינטרמדיוס. עם השראת IPTG, ביטוי יתר של חלבון המטרה היה ברור. לאחר הביטוי, ILY טוהר באמצעות כרו?.......

הביטוי, הטיהור והאימות התפקודי המוצלח של ILY רקומביננטי מתויג His במחקר זה עקבו אחר פרוטוקול מבוסס^{היטב 15}. עם זאת, התהליך כלל מספר שלבים קריטיים שהבטיחו תפוקת חלבון גבוהה, טוהר ופעילות ביולוגית. השראת תאי E. coli BL21 (DE3) עם IPTG עברה אופטימיזציה ?.......

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים או קשרים אישיים שהיו יכולים להשפיע על העבודה המדווחת בכתב יד זה. שום ניגוד אינטרסים, כולל שיוך כספי, לא פיננסי, מקצועי או אישי, לא השפיע על העיצוב, הביצוע, הפרשנות או ההצגה של המחקר.

אנו מביעים את תודתנו לחברים בעבר ובהווה במעבדת צ'ין על תרומתם לפיתוח ולשכלול הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה. אנו מודים גם לקבוצתו של ד"ר ר.ק. טוויטן במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה על האספקה הנדיבה של הפלסמיד הרקומביננטי ILY, שהיה חיוני במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) באמצעות מענק NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) ו-R21OD024931 (X.Q).