דלדול מהיר של מקרופאגים כלייתיים באמצעות כלי אבלציה של תאים CD59/Intermedilysin אנושי

מדווח כאן על פרוטוקול לאבלציה סלקטיבית של מקרופאגים כלייתיים כדי לחקור את התחדשותם באמצעות כלי אבלציה של תאי CD59/intermedilysin אנושיים. שיטה זו ישימה גם לחקר התפקוד וההתחדשות של אוכלוסיות תאים אחרות בכליות, בכבד וברקמת השומן.

מקרופאגים כלייתיים (RMs) חיוניים לבריאות הכליות, תזמור מעקב חיסוני, הומאוסטזיס רקמות ותגובות לפציעה. בעבר, דיווחנו על שימוש בכלי אבלציה של תאים אנושיים CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) כדי לחקור את הגורל המובהק, הדינמיקה והנישות של RMs ממקור מח עצם או עוברי. מקורם של RMs במקרופאגים שמקורם בשק חלמון, מונוציטים בכבד עוברי ומונוציטים שמקורם במח העצם ונשמרים בבגרות באמצעות ריבוי מקומי וגיוס של מונוציטים במחזור הדם. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לאבלציה סלקטיבית של RMs כדי לחקור את התחדשותם, כולל 1) יצירה ואפיון של ביטוי השראת Cre של hCD59 ב-RMs של עכברים, 2) טיהור ILY ואפיון פעילות ILY, 3) אינדוקציה של ביטוי hCD59 על RMs בעכברים מורכבים, ו-4) אפיון התחדשות לאחר אבלציה של RM בתיווך ILY. ILY מדלדל באופן ספציפי ומהיר RMs בעכברים מורכבים, עם אבלציה יעילה של מקרופאגים תוך יום אחד ממתן ILY. התחדשות מקרופאגים כלייתיים החלה ביום השלישי לאחר האבלציה, עם התאוששות של ~88% ביום השביעי. מודל זה מציע כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של מקרופאגים ויכול לשמש להסרת אוכלוסיות תאים אחרות בכליות, בכבד וברקמות השומן כדי לחקור את תפקודם והתחדשותם.

מקרופאגים כלייתיים (RMs) הם תאים חיסוניים חיוניים השומרים על הומאוסטזיס בכליות, מווסתים את התגובות החיסוניות ומקדמים תיקון רקמות לאחר פציעה. הם מבצעים מגוון פונקציות, כולל פגוציטוזיס, הצגת אנטיגן ותזמור של תגובות דלקתיות ואנטי דלקתיות^{כאחד 1,2,3}. בהתאם לסביבה המקומית, RMs יכולים לקטב לפנוטיפים פרו-דלקתיים (M1) או אנטי דלקתיים (M2), או להחמיר פציעה או להקל על ריפוי ^4,5,6. חוסר ויסות של RMs היה מעורב בהופעה והתקדמות של פגיעה כלייתית חריפה (AKI) ומחלת כליות כרונית (CKD), מה שהופך אותם לשחקנים קריטיים בבריאות הכליות ובפתולוגיה ^7,8. RMs נובעים ממקורות שונים, כולל מקרופאגים שמקורם בשק חלמון במהלך האמבריוגנזה, מונוציטים בכבד עוברי ומונוציטים שמקורם במח עצם בבגרות. RMs מתרחבים ומבשילים במקביל לצמיחה כלייתית לאחר הלידה, שמקורם בעיקר במונוציטים בכבד העובר לפני הלידה, עם תחזוקה עצמית עד לבגרות בתוספת מונוציטים היקפיים⁹. אצל מבוגרים, מונוציטים במחזור מגויסים לכליה על ידי אותות הומאוסטטיים או אותות פציעה, ומתמיינים למקרופאגים תחת השפעות מיקרו-סביבתיות מקומיות. תחזוקת RM נשמרת באמצעות ריבוי מקומי וחידוש תקופתי ממונוציטים במחזור 9,10,11,12.

הדגמנו בעבר את השימוש במערכת אבלציה של תאים אנושיים CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) ככלי^13,14 לחקירת הגורלות, הדינמיקה והנישות המיקרו-סביבתיות המובהקות של RMs שמקורם במח עצם או ממקורות עובריים⁹. ILY מבצע ליזה סלקטיבית של תאים אנושיים תוך שניות על ידי יצירת נקבוביות בקרומי תאים ממוקדים¹⁵. ספציפיות זו נובעת מהזיקה הבלעדית של ILY ל-CD59 אנושי (hCD59), ללא אינטראקציה או השפעה ליטית על תאים ממינים אחרים חסרי קולטן^{זה 15}. בהתבסס על תפיסה זו, הנדסנו כלי המאפשר אבלציה מהירה, מותנית וממוקדת של תאים אנושיים המבטאים CD59 במודלים של עכברים טרנסגניים באמצעות יישום אינטרמדיליזין (ILY)¹⁴. כדי להקל על השימוש בכלי זה, פיתחנו מודל של אבלציה מותנית וממוקדת של תאים על ידי יצירת עכברי נוקין STOP-CD59 (ihCD59), שבהם ביטוי של CD59 אנושי מתרחש רק לאחר רקומבינציה מתווכת Cre¹³. בעבר, נמצא כי הגן CX3CR1cre-EFP מתבטא באופן בלעדי ב-CD11bintF480hi, המוגדר כמקרופאגים כלייתיים⁹. לכן, השתמשנו בקווי CX3CR1CreER2^+/+  כדי לחצות עם עכברי ihCD59 כדי לבטא hCD59 על מקרופאגים כלייתיים. יצרנו בהצלחה עכברים מורכבים עם הגנוטיפ ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 (+/-, +/+ ו-/- מציינים את העכברים הטרנסגניים ההומוזיגוטיים, המיזיגוטים והלא-נשאים, בהתאמה). מתן טמוקסיפן בעכברים מורכבים ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- המסומנים באופן מותנה RMs על ידי ביטוי hCD59⁹. בעקבות דלדול נישת ה-RM באמצעות טיפול ב-ILY, מונוציטים היקפיים התמיינו מיד ל-RMs שמקורם במח עצם, ולמעשה אכלסו מחדש את הנישה כפי שתואר קודם לכן^ב-9. התחדשות זו הייתה תלויה באופן קריטי בציר האיתות CX3CR1/CX3CL1, מה שמדגיש את תפקידו החיוני הן בתחזוקה והן בשיקום אוכלוסיית RM⁹. אנו מראים גם כי בשל היכולות הגליקוליטיות הייחודיות שלהם, ל-RMs שמקורם בעובר יש יכולת גבוהה יותר לנקות קומפלקסים חיסוניים והם רגישים יותר לאתגרים חיסוניים מאשר RMs שמקורם במח עצם⁹.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לאבלציה סלקטיבית של RMs כדי לחקור את התחדשותם באמצעות אבלציה מהירה של תאים בתיווך Cre-inductible hCD59 (ihCD59) לאחר מתן ILY. הזרקת ILY גרמה לאבלציה ממוקדת של RMs המבטאים באופן מותנה וספציפי hCD59 בעכברי CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-compound . לאחר האבלציה, עקבנו אחר שינויים דינמיים של מקרופאגים באמצעות ציטומטריית זרימה ומצאנו דלדול מהיר של מקרופאגים ואחריו התחדשות של RMs. ILY רקומביננטי התבטא בתאי E. coli BL21(DE3) וטוהר באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה לניקל-NTA. הטוהר והפונקציונליות של ה-ILY הרקומביננטי אושרו על ידי SDS-PAGE, ספקטרופוטומטריה ובדיקת המוליזה, מה שמדגים את פעילות הציטוליזין האופיינית לו התלויה בכולסטרול. השתמשנו ב-ILY כדי לרוקן את ה-RMs בעכברים, ולהשיג אבלציה יעילה של מקרופאגים תוך יום אחד ממתן ILY. התחדשות מקרופאגים כלייתיים החלה ביום השלישי לאחר האבלציה, עם התאוששות של ~85% ביום השביעי. הנתונים מצביעים על כך שהתחדשות מונעת בעיקר על ידי גיוס מונוציטים. מודל זה מציע כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה של המקרופאגים ויש לו פוטנציאל טיפולי למניפולציה ממוקדת של אוכלוסיות מקרופאגים במחלות כליות. ניתן להשתמש בכלי אבלציה של תאים ihCD59/ILY כדי לחקור את תפקוד התאים והתחדשות בכליות, בכבד, ברקמת השומן ובאיברים אחרים.

פרוטוקולי המחקר בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוליין, בית הספר לרפואה (פרוטוקול מספר 1482). עכברי הניסוי, Cx3cr1CreER^+/+ ו-ihCD59^+/+, בגילאי 10-12 שבועות ובמשקל 25-30 גרם, שוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) במתקן בעלי החיים של האוניברסיטה. כל ההליכים הכרוכים בבידוד כליות נערכו בסביבה סטרילית, כאשר החוקרים לבשו כפפות ומסכות פנים כדי למנוע זיהום. פרטים לגבי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

1. השג עכברי CX3CR1CreER^+/+ ממעבדת ג'קסון. שכן את העכברים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טוליין (SOM) במתקן ספציפי נטול פתוגנים (SPF). שמור על בעלי החיים במחזור אור/חושך של 12 שעות עם תנאי סביבה מבוקרים.
2. השתמש בעכברי ihCD59+/+ שנוצרו בעבר עם רקע גנטי C57BL/6 לצורך רבייה. הכלאה של עכברי CX3CR1CreER^+/+ הומוזיגוטיים (חסרים בביטוי CX3CR1) עם עכברי ihCD59^+/- כדי לייצר את הגנוטיפים הבאים של הצאצאים: CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^{-/-ו-CX3CR1CreER+/-}/ihCD59^+/-.
3. ודא שעכברי CX3CR1CreER^+/- הטרוזיגוטיים שומרים על ביטוי CX3CR1 פונקציונלי, בעוד שעכברי CX3CR1CreER^+/+ הומוזיגוטיים חסרים CX3CR1 על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה עם נוגדן Anti-CX3CR1⁹.

2. ייצור ILY (נגזר^מ-14,15)

1. יום 0
   1. אחזר מלאי קפוא של זן חיידקי ILY BL21-DE3-RIPL הנושא רצפי ILY מתויגים שלו בפלסמיד pTrcHis-A (איור משלים 1) המאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס. יש לחסן 10 מיקרוליטר ממלאי החיידקים לתוך 40 מיקרוליטר של מדיום מרק לוריא (LB) המכיל אמפיצילין בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. מורחים את התערובת המחוסנת על צלחת אגר LB בתוספת אמפיצילין (1 מיקרוגרם/מ"ל). דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת חיידקים.
2. יום 1
   1. בחר שש מושבות בודדות מלוח האגר LB. יש לחסן כל מושבה ל-3.5 מ"ל של מדיום LB המכיל אמפיצילין. דגרו על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. יום 2
   1. העבירו כל תרבית התחלה של 3.5 מ"ל ל-250 מ"ל של מדיום LB בתוספת אמפיצילין. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות עם ניעור בטמפרטורה של 230 x גרם כדי לאפשר צמיחת חיידקים.
   2. לאחר 3 שעות, הוסף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מתמיסת מלאי של 1 M (מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס) בדילול של 1:1000 כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ. המשך בדגירה למשך 4 שעות נוספות כדי לגרום לביטוי חלבון.
   3. שקלו בקבוק צנטריפוגה ריק ורשמו את המשקל. העבירו כ-250 מ"ל מהתרבית המושרה לבקבוק הצנטריפוגה.
   4. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ואז שקלו את הבקבוק המכיל את הגלולה. חשב את משקל הגלולה על ידי הפחתת משקל הבקבוק הריק מהמשקל הכולל לאחר צנטריפוגה.
   5. אחסן את גלולת החיידקים ב-20 מעלות צלזיוס למיצוי וטיהור לאחר מכן של ILY.
4. יום 3 : מיצוי וטיהור ILY
   1. הכן את מאגר הליזה על ידי שילוב של 30 מ"ל של מגיב מיצוי חלבון באסטר באג עם 30 מיקרוליטר של נוקלאז בנזונאז (1200 יחידות קוניץ) ו-0.9 מיקרוליטר של ליזוזים (10,000 יחידות של פעילות אנזימטית) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
   2. מערבבים את התמיסה בעדינות כדי להבטיח שמאגר הליזיס הומוגני. הוסף את מאגר הליזיס המוכן לגלולת החיידקים (2-5 גרם). מערבל את התערובת ביסודיות במשך 30-60 שניות כדי להשעות מחדש את תאי החיידקים במלואם.
   3. חלקו את התמיסה המושעה באופן שווה בין שני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל. מניחים את הצינורות על קרח ומדגרים למשך 30-90 דקות. במהלך הדגירה, יש לנער בעדינות את הצינורות באמצעות שייקר אורביטלי ומערבולת קצרה כל 5-10 דקות למשך 10-15 שניות כדי לשפר את ליזיס התאים.
   4. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הליזטים ב-4,900 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   5. שטפו את העמוד היטב במי ברז בעזרת קצה פיפטה של 1 מ"ל כדי להסיר את כל השרף שנותר מהשימוש הקודם.
   6. שוטפים את העמוד עם 70% אתנול כדי לחטא אותו. שטפו את העמודה 2x-3x עם ddH₂O קר כדי להסיר שאריות אתנול. מקם את העמודה במחזיק.
   7. הוסף 6-10 מ"ל של ddH₂O קר כדי לשטוף עוד יותר ולאזן את העמודה לטיהור. הוסף כ -3 מ"ל חרוזי שרף לעמודה. חבר את העמוד למשאבה פריסטלטית המוגדרת למהירות של 30.
   8. הוסף 10 מ"ל של ddH₂O קר כדי להשהות את השרף לחלוטין ולהכין אותו לקשירת חלבון. שטפו את חרוזי השרף עם 15 מ"ל של מאגר טעינה 1x כדי להכין את השרף לקשירת חלבון.
   9. אסוף את הסופרנטנט החיידקי ליזאט לאחר צנטריפוגה בצינור טרי, וודא שהגלולה מושלכת. סנן את הסופרנטנט באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר עם מזרק כדי להסיר את כל הפסולת התאית שנותרה.
   10. העבירו 20-25 מ"ל של ליזט החיידקים המסונן דרך העמודה בשלושה סיבובים נפרדים. לאחר כל מעבר, אספו 20 מיקרוליטר מהזרימה וסמנו אותה כ-PE למדידת צפיפות אופטית (OD) מאוחרת יותר.
   11. שטפו את העמוד עם 20-30 מ"ל של מאגר מחייב כדי להסיר חלבונים לא קשורים. שטפו את העמוד עם 20-30 מ"ל של מאגר כביסה. אסוף 20 מיקרוליטר משבר הכביסה למדידת OD.
   12. יש לסלק את החלבון הקשור על ידי הוספת 10-20 מ"ל של Elution Buffer. התחל לאסוף את הפליטה לאחר 3-4 דקות באמצעות צינורות מיקרוצנטריפוגה. אוספים כ -1 מ"ל לצינור, ממלאים 15-17 צינורות.
   13. מדוד את הספיגה של כל שבר פליטה ב-A280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במאגר ה-Elution כריק במהלך קריאות A280. אסוף את הצינורות עם ספיגה מוגברת באופן דרמטי ב-A280 מכיוון שהם מכילים את חלבון ILY המתויג His-tag שנמצא בדרך כלל בשברים סביב צינור 13.
   14. אחסן את שברי הפליטה (או הצינורות) המכילים חלבון ILY ב-4 מעלות צלזיוס. המשיכו בשלבים נוספים במהלך היום שלמחרת כדי להבטיח יציבות חלבון מיטבית.
       הערה: בצע את כל השלבים על קרח או ב-4 מעלות צלזיוס במידת האפשר כדי לשמור על שלמות החלבון.
5. יום 4: הסרת אנדוטוקסין מהפליטה
   1. שטפו את עמוד השרף להסרת האנדוטוקסין עם 6-10 מ"ל מים טהורים במיוחד. לחץ בעדינות על העמוד כדי לווסת את הזרימה.
   2. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של תמיסת נתרן דאוקסיכולט 1% (מיוצרת טרייה או לא יותר מחודש) כדי להסיר אנדוטוקסינים קשורים. שטפו את העמוד שוב עם 6-10 מ"ל מים טהורים במיוחד כדי להסיר שאריות חומר ניקוי.
   3. החל את דגימת החלבון המוכנה על עמוד השרף. דגרו את הדגימה בעמודה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר קשירת אנדוטוקסין אופטימלית.
   4. אסוף את שבר הזרימה הראשוני. הוסף ddH₂O לעמודה לפליטה נוספת ואסוף שברים מופשטים בכ-10 צינורות (1 מ"ל לצינור).
   5. אחסן את עמודת השרף באתנול 25% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של דגימות החלבון המנופחות כדי לכמת את התשואה. צפו לשחזר כ-50%-70% מסך החלבון מאצווה הפליטה הראשונה.
6. יום 5-6: דיאליזה
   1. הכן 2 ליטר של מאגר דיאליזה על ידי חיטוי של 1600 מ"ל מים מזוקקים ונטולי יונים (ddH₂O). הוסף 200 מ"ל של 10x PBS, 200 מ"ל גליצרול ו-3.5115 גרם של חומצה אתנסולפונית MES (2-(N-morpholino)) למים שעברו חיטוי.
   2. מערבבים את התערובת עם מוט ערבוב מגנטי עד שכל הריאגנטים מומסים לחלוטין. אחסן את המאגר שנוצר ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. הוסף את שברי הפליטה המאוחסנים לערכת הדיאליזה, ולאחר מכן הסר אוויר מערכת הדיאליזה בעזרת מחט. דיאליזה של תמיסת החלבון באמצעות ערכת הדיאליזה למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם מהירות תסיסה מוגדרת לכ-2.
   4. הגדר את ערכת הדיאליזה כדי להבטיח שהיא שקועה במלואה במאגר. החלף את מאגר הדיאליזה בערכת הדיאליזה במאגר דיאליזה טרי במיכל של 2 ליטר למחרת. המשך בדיאליזה למשך 24 שעות נוספות.
   5. העבירו בזהירות את כל התמיסה, כולל כל המשקעים הלבנים, לתוך צינור סטרילי כדי לשמר את חלבון ILY, שעלול להצטבר. יש לרכז את חלבון ILY באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית, בהתאם להוראות היצרן לצנטריפוגה.
   6. יש לחלק את חלבון ה-ILY המרוכז למנות של 200 מיקרוליטר בצינורות סטריליים. סמן כל צינור עם התאריך והשם. אחסן את המינונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי בבדיקות אלקטרופורזה של ג'ל והמוליזה.

3. אפיון ILY על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE

1. הכן את מאגר הריצה MOPS SDS (1x) על ידי דילול מאגר הריצה (20x) עם ddH₂O.
2. הכן את מאגר הדגימה במכסה אדים על ידי ערבוב של 90 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 6 עם 10 מיקרוליטר של β-מרקפטואתנול (β-ME). מערבבים היטב את התמיסה כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה.
3. שלב את הדגימה המוכנה עם מאגר הטעינה כדי להשיג נפח סופי של 30 מיקרוליטר. הפשירו את הדגימות ומערבלו אותן במרץ כדי להבטיח ערבוב מלא.
4. מחממים את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבונים. טען את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE 4%-20%. הפעל את האלקטרופורזה במתח קבוע של 80 וולט למשך 90 דקות.
5. פתחו בזהירות את קלטת הג'ל וטבלו את הג'ל ב-ddH₂O למשך 5 דקות. חזור על שלב הכביסה פעמיים באמצעות שייקר.
6. יש לצבוע את הג'ל ב-Coomassie Brilliant Blue למשך שעה בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את הג'ל במשך 30 דקות ב-ddH₂O. החליפו את המים ב-ddH₂O טרי ודגרו את הג'ל על שייקר לתקופה שנעה בין לילה ל-3 ימים לניקוי מוחלט.
7. צלמו תמונה של הג'ל המוכתם באמצעות מצלמה (איור 1A). לנתח את הג'ל באמצעות תוכנת ImageJ להערכות כמותיות ואיכותניות.

4. בדיקה המוליטית לפעילות ILY

1. הפשירו את דגימות ה-ILY (Intermedilysin) המאוחסנות לחלוטין בטמפרטורת החדר. מערבול את הדגימות המופשרות ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות, מכיוון ש-ILY יכול להצטבר בעת ההפשרה.
2. הגדר צלחת של 96 בארות לדילולים סדרתיים. הוסף 160 מיקרוליטר מתמיסת המלאי ILY (26.7 ננוגרם/מיקרוליטר) לבאר הראשונה. הוסף 80 מיקרוליטר של 1x PBS לכל אחת מהבארות הבאות באותה שורה או עמודה.
3. העבר 80 מיקרוליטר מתמיסת ILY מהבאר הראשונה לבאר השנייה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח שהתמיסה הומוגנית. מעבירים 80 מיקרוליטר מהבאר השנייה לבאר השלישית ומערבבים היטב.
4. חזור על תהליך זה עבור כל באר, והעביר 80 מיקרוליטר מהבאר הקודמת להבאה עד להכנת מספר הדילולים הרצוי. לאחר העברת 80 מיקרוליטר לבאר האחרונה, השליכו 80 מיקרוליטר מאותה באר כדי להבטיח נפחים עקביים על פני הצלחת.

5. הכנת תאי דם אדומים אנושיים (RBCs)

1. שאבו 1-2 מ"ל של דם אנושי טרי לתוך שפופרת המכילה נוגד קרישה, כגון EDTA. צנטריפוגה של הדם בטמפרטורת החדר ב-3,000 x גרם למשך 5 דקות.
2. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את כדור ה-RBC האנושי עם PBS 2x-3x עד שהסופרנטנט נקי. לדלל את ה-RBCs האנושיים השטופים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של RBCs ל-900 מיקרוליטר של 1x PBS כדי להשיג דילול של 1:100.
3. הוסף 10 מיקרוליטר של תאי הדם האדומים האנושיים המדוללים לכל באר. הוסף 30 מיקרוליטר מתמיסת ILY המדוללת סדרתית מצלחת הדילול לכל באר. הוסף 160 מיקרוליטר של 1x PBS כדי להביא את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטר לבאר (ריכוז התחלתי: 4 ננוגרם/מיקרוליטר).
4. הוסף 10 מיקרוליטר של תאי הדם האדומים האנושיים המדוללים לבארות הבקרה. הוסף 190 מיקרוליטר מים או 1x PBS לבארות הבקרה לבקרות שליליות. מערבבים את הצלחות על ידי הקשה עדינה עליהן.
5. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר המוליזה. צנטריפוגה של הצלחות ב-3,000 x גרם למשך 5 דקות כדי לגלול כל RBC אנושי שלם.
6. העבירו בזהירות 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל באר לצלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. מדדו את הספיגה של הסופרנטנטים ב-405 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
7. חשב את הפעילות המוליטית של ILY על ידי השוואת ערכי הספיגה של הדגימות לבקרה¹⁶.

6. טיפול בטמוקסיפן, דלדול RM והתחדשות

1. מחממים שמן תירס ל -42 מעלות צלזיוס. ממיסים 100 מ"ג טמוקסיפן ב-5 מ"ל שמן תירס שחומם מראש להכנת תמיסת ציר בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל.
2. יש לתת טמוקסיפן תוך צפקי (i.p.) לעכברים זכרים בני 10-12 שבועות CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- במינון של 100 מיקרוגרם/גרם משקל גוף. חזור על הזרקת הטמוקסיפן במשך 3 ימים רצופים.
3. יש להמתין 15 יום לאחר הזרקת הטמוקסיפן הסופית כדי לאפשר ביטוי hCD59 בתיווך Cre.
4. יש להזריק מנה בודדת של אינטרמדיליזין (ILY) תוך ורידי לעכברי CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- ולבקרות CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- במינון של 120 ננוגרם/גרם משקל גוף.
5. עקוב ואשר אבלציה של RM והתחדשות לאחר מכן על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה ב-1, 3 ו-7 ימים לאחר מתן ILY¹⁷.

7. המתת חסד בעכבר

1. הנח את החיה בתא מתאים וחשוף אותה לאיזופלורן בהתאם לפרוטוקולי IACUC. ודא את ההרדמה על ידי בדיקת היעדר רפלקסים, כגון רפלקס נסיגת הדוושה.
2. לאחר שהעכבר מורדם לחלוטין ואינו מגיב, בצע פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד. אשר המתת חסד על ידי אימות היעדר רפלקסים, כגון רפלקס נסיגת הדוושה.
3. בצע חתך בקו האמצע של כ-2 ס"מ על הבטן באמצעות אזמל סטרילי ומשוך בעדינות את העור כדי לחשוף את חלל בית החזה. פתח את כלוב הצלעות לאורך עצם החזה באמצעות מספריים כירורגיים קהים כדי לחשוף את הלב.
4. הכנס מחט 21G-23G לחדר השמאלי. התחל בזלוף עם 10-20 מ"ל PBS קר כדי לשטוף את הדם.
5. חותכים את האטריום הימני פתוח כדי לאפשר לדם להתנקז מהמחזור. המשך בזלוף עד שהכליות נראות חיוורות, מה שמעיד על פינוי דם יעיל.
6. אתר את הכליות כנגד דופן גוף הגב. הפרד בעדינות את הכליות מהרקמות הסובבות באמצעות מלקחיים ומספריים. יש להוציא את כמוסות הכליות ולהניח מיד את הכליות ב-PBS קר כדי למנוע התדרדרות.

8. עיכול כליות

1. הכינו את קוקטייל אנזימי העיכול על ידי ערבוב של 9 מ"ל של HBSS (ללא Ca/Mg), 1 מ"ל של קולגנאז IV (5 מ"ג/מ"ל) ו-20 מיקרוליטר של DNase I (10 מ"ג/מ"ל). הכינו את תמיסת האנזים טרייה ושמרו אותה על קרח עד לשימוש.
2. טוחנים את הכליות לשברים זעירים (באופן אידיאלי ≤ 1 מ"מ) בעזרת מספריים סטריליים בצלחת פטרי המכילה 5 מ"ל HBSS. העבירו את שברי רקמת הכליה לצינורות של 15 מ"ל המכילים 10 מ"ל מתמיסת האנזים המוכנה.
3. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה כדי לנתק את הרקמה. יש לשלש את הרקמה בעדינות באמצעות פיפטה או בוכנת מזרק כדי להפריד עוד יותר את גושי התאים.
4. הסר פסולת רקמות על ידי העברת תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה את מתלה התא ב-650 x גרם למשך 10 דקות ב-18 מעלות צלזיוס.
5. רוקנים בזהירות את המאגר לאחר צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מאגר ליזה ודגרו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליז כדוריות דם אדומות.
6. שטפו את התאים עם PBS כדי להסיר את מאגר הליזיס. שמור על ההשעיה החד-תאית המתקבלת על קרח עד לשימוש נוסף.

9. צנטריפוגה שיפוע צפיפות

1. כדי להעשיר תאים המטופואטיים, השעו מחדש את גלולת התא מהכביסה הקודמת ב-10 מ"ל של תמיסת שיפוע בצפיפות של 30%. שכבו בזהירות את התמיסה על 3 מ"ל של תמיסת שיפוע בצפיפות של 70% בצינור צנטריפוגה.
2. צנטריפוגה את השיפוע ב-500 x g למשך 30 דקות מבלי להפעיל בלם. לאחר צנטריפוגה, אסוף בזהירות את שכבת הבין-פאזה בין התמיסות של 30% ל-70%; שכבה זו מכילה את התאים הבודדים המועשרים.
3. שטפו את התאים שנאספו פי 2 עם 10 מ"ל PBS על ידי צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 10 דקות בכל פעם. השעו מחדש את גלולת התא הסופית ב-1 מ"ל של מאגר FACS (1x PBS עם 2% FBS) בצינור של 1.5 מ"ל.
4. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. התאם את ריכוז התאים ל-2 x 10⁶ תאים/מ"ל.

10. צביעת ציטומטריית זרימה, רכישה

1. התאם את ריכוז התאים מתרחיפים חד-תאיים שהוכנו מרקמת כליה של עכבר ל-2-3 x 10⁶ תאים/מ"ל לניתוח זרימה ציטומטרי.
2. גלולה את התאים בצינורות של 1.5 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב-650 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מאגר FACS.
3. הוסף נוגדן נגד CD16/32 בדילול של 1:200 כדי לחסום קשירת קולטן Fc לא ספציפית. דגרו על התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. השתמשו בצבע Aqua Live/Dead כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים, בהתאם להוראות היצרן.
5. צבעו את התאים בנוגדנים מצומדים מראש בדילול של 1:100, כולל CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE ו-F4/80-BV605. הוסף את קוקטייל הנוגדנים לתרחיף התא.
6. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך כדי להגן על פלואורופורים מפני פוטוהלבנה. שטפו את התאים המוכתמים פי 2 עם מאגר FACS (PBS עם סרום בקר עוברי 2%) על ידי צנטריפוגה ב-650 x גרם למשך 5 דקות.
7. מקבעים את התאים ב-1% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 30 דקות על קרח. שטפו את התאים הקבועים פעמיים עם מאגר FACS כדי להסיר שאריות PFA.
8. רכוש תאים מוכתמים וקבועים באמצעות ציטומטר זרימה. נתח את הנתונים באמצעות התוכנה.
9. זהה מקרופאגים ומיקרוגליה בכליות וברקמות אחרות באמצעות סמנים CD45, CD11b ו-F4/80 כמתואר^ב-9 .
10. בצע שער ראשוני לבחירת תאים חיים על סמך פרופילי פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). בטל כפילויות על ידי שער על אזור פיזור קדימה (FSC-A) לעומת גובה פיזור קדימה (FSC-H). אל תכלול תאים מתים באמצעות צבע הכדאיות LIVE/DEAD.
11. העשיר את תאי מערכת החיסון על ידי שער על אוכלוסיות CD45+. הגדירו מקרופאגים השוכנים בכליות כתאי CD11b+F4/80++ בתוך אוכלוסיית CD45+, כפי שמוצג באסטרטגיית השער (איור 2A).
12. הגדירו אוכלוסיות מיקרוגליה כתאי CD11b+CD45ⁱⁿt (איור 2B). בצע רכישת נתונים על ציטומטר הזרימה. בצע את הניתוח הסופי באמצעות התוכנה להשלמת המחקר הציטומטרי של הזרימה.

הטיהור של His-Tag רקומביננטי ILY פעל לפי אותו פרוטוקול שתואר קודם לכן^ב-14. ILY התבטא בהצלחה בתאי E. coli BL21(DE3), שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד המקודד את הגן ILY מסטרפטוקוקוס אינטרמדיוס. עם השראת IPTG, ביטוי יתר של חלבון המטרה היה ברור. לאחר הביטוי, ILY טוהר באמצעות כרו?...

הביטוי, הטיהור והאימות התפקודי המוצלח של ILY רקומביננטי מתויג His במחקר זה עקבו אחר פרוטוקול מבוסס^{היטב 15}. עם זאת, התהליך כלל מספר שלבים קריטיים שהבטיחו תפוקת חלבון גבוהה, טוהר ופעילות ביולוגית. השראת תאי E. coli BL21 (DE3) עם IPTG עברה אופטימיזציה ?...

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים או קשרים אישיים שהיו יכולים להשפיע על העבודה המדווחת בכתב יד זה. שום ניגוד אינטרסים, כולל שיוך כספי, לא פיננסי, מקצועי או אישי, לא השפיע על העיצוב, הביצוע, הפרשנות או ההצגה של המחקר.

אנו מביעים את תודתנו לחברים בעבר ובהווה במעבדת צ'ין על תרומתם לפיתוח ולשכלול הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה. אנו מודים גם לקבוצתו של ד"ר ר.ק. טוויטן במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה על האספקה הנדיבה של הפלסמיד הרקומביננטי ILY, שהיה חיוני במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) באמצעות מענק NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) ו-R21OD024931 (X.Q).