הערכת דומיננטיות חברתית במודלים של עכברים באמצעות מבחן המבחנה

פרוטוקול זה מתאר מבחן התנהגותי להערכת דומיננטיות חברתית במכרסמים באמצעות מבחן המבחנה. הדומיננטיות החברתית נשארת יציבה לאורך זמן, ומספר מודלים של הפרעות התפתחותיות ונוירולוגיות מציגים חריגות דומיננטיות חברתיות חזקות. לכן, בדיקת הצינור משמשת כמדד תוצאה נוח למחקרים מכניסטיים או להקרנה טיפולית פרה-קלינית.

דומיננטיות חברתית משתנה במחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות ומשמשת כמדד תוצאה שימושי במחקרים פרה-קליניים של הפרעות אלה. בדיקת המבחנה היא בדיקה התנהגותית פשוטה להערכת דומיננטיות חברתית שאינה דורשת ציוד יקר. בבדיקה זו, שני עכברים נכנסים לקצוות מנוגדים של צינור פלסטיק שקוף, ולאחר שנפגשו באמצע, אחד (הפחות דומיננטי) חייב לסגת. בדיקת המבחנה יכולה לשמש לעכברים זכרים ונקבות כאחד וכוללת מספר פרמטרים הניתנים להתאמה לצרכי החוקר. עכברים עשויים להיבדק מול מספר יריבים ייחודיים כדי לספק מדד לדומיננטיות חברתית. הדומיננטיות החברתית במבחן המבחנה נשארת יציבה על פני בדיקות חוזרות ונשנות ונמצאת בקורלציה עם ביצועים במבחנים חברתיים אחרים. בנוסף, ניתן לבצע את המבחן בין חברים לכלוב כדי להעריך היררכיות דומיננטיות חברתיות בתוך הכלוב. בדיקת הצינור שימושית במיוחד במחקרים טיפוליים פרה-קליניים, מכיוון שהיא מאפשרת בדיקות אורך לפני ואחרי התערבויות ניסיוניות. לכן, הוא משמש כמדד תוצאה נוח למחקרים מכניסטיים וסינון טיפולי פרה-קליני.

הפרעה בהתנהגות חברתית היא מאפיין של הפרעות אנושיות רבות, כולל הפרעות התפתחותיות, פסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות ^1,2. מודלים של עכברים משמשים כדי לקבל תובנה לגבי הפתוגנזה של הפרעות אלו ולספק פלטפורמה לבדיקות פרה-קליניות של טיפולים. עם זאת, מבחנים רבים להתנהגות חברתית של עכברים גוזלים זמן לביצוע, דורשים ציוד יקר ו/או תוכנת מעקב וידאו לניתוח, או שיש להם אלגוריתמים סובייקטיביים של ניקוד. לעומת זאת, בדיקת המבחנה לדומיננטיות חברתית היא מהירה ופשוטה לביצוע ואינה דורשת ציוד מיוחד או מעקב וידאו. לבדיקה יש תוצאה בינארית של ניצחון/הפסד, מה שהופך את פרשנות התוצאות לפשוטה.

מבחן המבחנה לדומיננטיות חברתית פותח על ידי לינדזי ועמיתיו במאמץ להעריך דומיננטיות חברתית בעכברים³. מאז פיתוחו, בדיקת המבחנה הוקמה גם כדרך להעריך היררכיות דומיננטיות חברתיות בתוך הכלוב⁴. פנוטיפים של בדיקת מבחנה נמצאים בקורלציה עם מדדים אחרים של דומיננטיות חברתית כמו ספרות, תחרות תגמול וייצור שתן בעכברים זכרים⁵. עם זאת, ישנן תוצאות מעורבות של בדיקת המבחנה והמתאם שלה עם תחרות על גישה למזון ומים ותוקפנות ^3,6,7. חשוב לציין, פנוטיפים של בדיקת מבחנה נמצאים בקורלציה עם פנוטיפים חברתיים אחרים כגון חברותיות תלת-קאמרית ^8,9.

היתרון של בדיקת המבחנה הוא שהאנטומיה שלה מוגדרת היטב, מה שהופך אותה לשימושית במיוחד במודלים שונים של עכברים, כולל מודלים של הפרעות על הספקטרום האוטיסטי ומחלות אחרות המאופיינות בליקויים חברתיים כמו דמנציה פרונטו-טמפורלית 8,9,10,11,12,13,14,15,16 . קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) היא מתווך מרכזי בהתנהגות בדיקת מבחנה של עכבר⁶. וואנג ועמיתיו הראו כי פעילות בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית מניעה דומיננטיות חברתית בעכברים⁶, ונתונים עדכניים יותר חידדו תובנה זו על ידי כך שהראו כי קלט תלמי מדיודורסלי לקליפת המוח החגורה הקדם-לימבית והקדמית מניע דומיננטיות חברתית¹⁷. בהתאם לתפקיד מפתח של ה-mPFC בדומיננטיות חברתית של בדיקת צינורית, חריגות בסורגים דנדריטיים, עמוד שדרה דנדריטי, קולטני גלוטמט ו/או ריגוש עצבי, ה-mPFC נקשר לחריגות בבדיקת מבחנה במודלים של מכרסמים של הפרעות בספקטרום האוטיסטי^15,18, דמנציה פרונטו-טמפורלית ^8,19, מתח כרוני²⁰ ובידוד חברתי²¹.

יתרון מרכזי נוסף של בדיקת המבחנה הוא היכולת לבחון דומיננטיות חברתית לפני ואחרי התערבות טיפולית, שכן הדומיננטיות החברתית של העכברים בבדיקת המבחנה יציבה לאורך זמן, ומאפשרת בדיקות חוזרות לפני ואחרי^{התערבות} ניסיונית^. דוגמה אחת לכך מגיעה ממודלים של עכברים הטרוזיגוטיים של פרוגרנולין (Grn^+/-) של דמנציה פרונטו-טמפורלית הנגרמת על ידי מוטציות פרוגרנולין (GRN), מחלת הפלו-אינספיקציה. לעכברים הטרוזיגוטיים של פרוגרנולין יש גירעון דומיננטיות חברתית⁸. ניתן להפוך את הגירעון הזה בבדיקת מבחנה על ידי שחזור פרוגרנולין עם טיפול גנטי AAV-progranulin²², או מתן נוגדנים נגד סורטילין שנועדו להפחית את פירוק הפרוגרנולין²³. דוגמאות אלו מדגימות את התועלת של בדיקת המבחנה בתכנון ניסויים פרה-קליניים למחקר הקשור לדמנציה.

פרוטוקול זה מספק שיטות בסיסיות להפעלת בדיקת מבחנה בין לא-קגמטים כדי להעריך הבדלים בין קבוצות ניסוי, ובין קגמטים להערכת היררכיות דומיננטיות חברתיות בתוך הכלוב.

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם ובוצעו בהתאם לאגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC). עכברים הטרוזיגוטיים של פרוגרנולין נוצרו ונחצו על רקע C57BL/6J כפי שתואר קודם לכן⁹. העכברים ששימשו למחקר זה הוצלבו לאחור על רקע C57BL/6J במשך 12 דורות לפחות. עכברים בגילאי 9-16 חודשים שימשו בנתוני הדגימה. זכרים ונקבות שימשו שניהם במחקר זה. העכברים הוחזקו במחזור אור/חושך של 12:12 שעות עם אורות דולקים בשעה 06:00, וכל הבדיקות נערכו במהלך שלב האור. לעכברים ניתנה גישה אד-ליביטום למזון ומים במהלך כל הניסויים. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. עיצוב גפרור מבחן משפופרת

1. תכנן את התאמות בדיקת המבחנה לפני הבדיקה. ודא שאין הערה גנוטיפית כדי לשמור על הנסיין עיוור לקבוצות (ראה טבלה משלימה 1).
   הערה: אנו בדרך כלל בודקים עכברים מול 3 יריבים ייחודיים מקבוצת הניסוי הנגדית 8,9,22,23, אך חלק מהמחקרים מדווחים על בדיקות נגד מתנגדים נוספים 10,11,13.
2. איזון נגד הקצאת עכברי הניסוי לצד השמאלי והימני של הצינור כדי למנוע השפעות מבלבלות פוטנציאליות של הטיית צד.
3. בעת בדיקת חברים שאינם כלובים, צמצם את תנועת הכלובים כדי למנוע לחץ על עכברים יותר מהנדרש. כדי למזער את תנועת הכלוב, חפיפה בין אותם שני כלובים ככל האפשר.
4. בעת בדיקת כלובים, בדוק כל עכבר מכלוב מול כל עכבר אחר בצורה סיבובית. אם חוזרים על הבדיקה במשך מספר ימים, יש להחליף את צד הצינור שהעכבר מוקצה להיכנס אליו (כלומר, שמאל או ימין) מיום ליום.

2. בחירת צינורות

הערה: בדרך כלל, בדיקת הצינור מתבצעת עם צינורות פלסטיק שקופים זמינים מסחרית עשויים PVC (ראה טבלת חומרים). חשוב לציין כי פרוטוקול זה מותאם לעכברים אך ניתן ליישם אותו על מודלים אחרים של מכרסמים כגון חולדות, נברנים ואוגרים².

1. חותכים את צינורות ה-PVC לאורך של 30.5 ס"מ. צינורות PVC גמישים מעט ומאוחסנים לרוב בגלילים, כך שייתכן שיהיה צורך ליישר אותם לפני השימוש. חימום קל יעזור ליישר צינורות מעוקלים.
2. הקוטר הפנימי של הצינור הוא קריטי להצלחת הבדיקה. ודא שהצינור גדול מספיק כדי שהעכברים יוכלו לעבור דרכו, אך לא גדול מספיק כדי לאפשר לעכברים לחצות זה את זה.
   הערה: הבדיקה לא תעבוד אם הצינור גדול מספיק כדי שהעכברים יוכלו לעבור אחד את השני מבלי להשתתף בתחרות דומיננטיות חברתית. להלן הנחיות משוערות לגדלי צינורות מתאימים בעכברי C57BL/6J: (1) קוטר פנימי של 1 אינץ'/2.5 ס"מ (ID) לעכברים זכרים <בני 6 חודשים, עכברים נקבות <9 חודשים; (2) מזהה 1.25 אינץ'/3.2 ס"מ לעכברים זכרים בני 6-9 חודשים, עכברים נקבות >9 חודשים; ו-(3) מזהה 1.5 אינץ'/3.5 ס"מ לעכברים זכרים בני >9 חודשים.
3. במידת האפשר, השתמש בשפופרת באותו גודל עבור כל הבדיקות בתוך קבוצת עכברים. אם עכברים מצטלבים במהלך המשחקים הראשונים, הפעל את כל המשחקים הבאים עם הצינור הקטן הבא.

3. מיקום הבדיקה

1. בצע את בדיקת הצינור על כל משטח שטוח ויציב או מכסה מנוע מסונן תחת תאורת סביבה.
   הערה: הבדיקה נעשית בדרך כלל במהלך היום בין השעות 8:00-17:00. במקרים שבהם עכברים נבדקים על פני מספר ימים, יש לבדוק כל עכבר באותה שעה ביום עבור כל בדיקה (למשל, בין 11 בבוקר ל-3 אחר הצהריים). למיטב ידיעתנו, השפעות השעה ביום לא נחקרו בעבר.
2. בצע את בדיקת המבחנה במקום שקט עם גירויים חיצוניים מינימליים. באופן אידיאלי, החוקר צריך להיות האדם היחיד בחדר.

4. התרגלות

1. הרגלה היא פרקטיקה חשובה במבחנים התנהגותיים המאפשרת לעכברים להכיר את סביבת הבדיקה, מה שיכול להוביל לתוצאות עקביות ואמינות יותר²⁴. לבדיקת הצינור, התאקלמו העכברים בחדר הבדיקה לפני הבדיקה. אם הבדיקה לא נעשית בחדר המגורים של בעלי החיים, אפשר לעכברים לפחות שעה אחת להתרגל לחדר החדש לפני הבדיקה.
2. (אופציונלי) אם תרצה, ניתן להרגיל את העכברים לצינור לפני הבדיקה. כדי להתרגל לצינור, הנח את העכבר בצינור ללא יריב ואפשר לו לעבור דרך הצינור 2-3 פעמים, 2-3 ימים לפני הבדיקה. זה לא הנוהג הסטנדרטי שלנו.

5. בדיקת מבחנה רגילה

הערה: (אופציונלי) חוקרים חדשים בבדיקת המבחנה עשויים לרצות לתרגל הנחת עכברים בצינור באמצעות קבוצה נפרדת של עכברים לא ניסיוניים. חוקרים צריכים לעתים קרובות לתרגל הכנסת עכברים לצינור. חוקר מנוסה יגרום פחות לחץ בעכברים שעוברים את הבדיקה. מידע נוסף על הכנסת עכברים לצינור ניתן בשלב 5.3.

1. הנח את כל הכלובים המכילים עכברים מאותו המין לבדיקה על עגלה. כלובי הובלה לאזור הבדיקות. נקו את הצינורות ואת אזור הבדיקה עם 2% כלורהקסידין ואחריו 70% אתנול. ניתן לנקות את הצינורות בקלות באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל על ידי דחיפת מגבת נייר דרך הצינור.
2. הנח את שני הכלובים למשחק הראשון על משטח הבדיקה. הסר את המכסים והניח אותם ליד כל כלוב.
3. אתר את שני העכברים לבדיקה. החזק עכבר אחד בכל יד, המתאים לצד שהוקצה לו בצינור. לאחר מציאת העכבר הראשון, החזק בעדינות את זנבו ושמור אותו בכלוב תוך כדי חיפוש אחר השני.
   הערה: החזקת זנב העכבר קרוב למרכז אורכו תאפשר לחוקר לשלוט בעדינות בעכבר מבלי לרסן אותו חזק מדי. החזק את העכבר כך שכל ארבע כפותיו יישארו על מצעי הכלוב כדי למנוע לחץ מיותר על העכבר.
4. הוציאו בו זמנית את שני העכברים מכל כלוב והניחו אותם בעדינות עם ראשיהם בכניסה לצינור.
   הערה: אם העכברים התרגלו או שיש להם ניסיון קודם בבדיקות, הם בדרך כלל נכנסים לצינור תוך מספר שניות. אם העכברים נאיביים לצינור, הם עשויים להסס להיכנס לניסוי הראשון. במידת הצורך, ניתן להעביר את העכברים לצינור הבא בגודלו כדי לעודד כניסת צינור.
5. שמור על אחיזה בזנב של כל עכבר כדי למנוע מהעכברים ליצור מגע בטרם עת. ודא שהעכברים לא נאלצים להיכנס לצינור. עם זאת, ברגע שהם מתחילים להיכנס לצינור, ניתן לדחוף אותם בעדינות כדי לעודד כניסה מלאה לתוך הצינור.
6. כאשר שני העכברים נכנסו לצינור, שחררו את הזנבות והתרחקו מהצינור (איור 1A). שני העכברים צריכים להתקדם לתוך הצינור ולהיפגש ליד המרכז (איור 1B).
   1. צפו במשחק ורשמו את המנצח והמפסיד. עכבר נחשב כמי שאיבד את הגפרור כאשר שתיים מכפות רגליו יוצאות מהשפופרת ובאות במגע עם משטח הבדיקה (איור 1C).
      הערה: עכבר אחד בדרך כלל ידחוף את השני מהצינור, אם כי חלק מהעכברים יבצעו נסיגה לא מאולצת לאחר מגע עם העכבר היריב. מדי פעם, שני העכברים נסוגים בו זמנית, או שעכבר אחד נסוג מיד לאחר הכניסה לצינור מבלי ליצור קשר עם העכבר היריב. אם אחד מהאירועים הללו מתרחש, החזירו את שני העכברים לצינור והתחילו מחדש את ההתאמה. העכברים בדרך כלל יבצעו התאמה סטנדרטית יותר בניסיון השני. אם אף אחד מהעכברים לא נסוג תוך 2 דקות, בטל את המשחק והפעל אותו שוב בסוף ההפעלה.
7. לאחר סיום המשחק, החזירו את העכברים לכלובי הבית שלהם. נקה את הצינור ואת משטח הבדיקה עם 70% אתנול.
8. המשך להפעיל משחקים באמצעות העיצוב המתואר בשלב 1. כל סיבוב מתחיל מיד לאחר הסיבוב הקודם. לאחר שכל ההתאמות ממין אחד בוצעו, החזירו את הכלובים למתלה/עגלה ובדקו את העכברים מהמין השני באותו הליך.
   1. נקה היטב את משטח הבדיקה והצינורות בין עכברים נקבות וזכרים רצים. לאחר השלמת הבדיקה, נקו גם את הצינורות וגם את אזור הבדיקה עם 2% כלורהקסידין.
9. לניתוח סטטיסטי, ספרו את מספר הניצחונות עבור כל קבוצה ונתחו באמצעות המבחן הבינומי כדי להשוות את ההתפלגות הנצפית לעומת הצפויה, כאשר ההתפלגות הצפויה נקבעה על 50% ניצחונות לכל קבוצה.
   1. חשב את אחוז הזכייה עבור כל עכבר על-ידי חלוקת מספר הזכיות במספר המשחקים (בדרך כלל שלושה משחקים, אלא אם כן משחק בוטל עקב עכבר חסר או בעיות אחרות). השווה את אחוז הזכייה עבור כל קבוצה באמצעות מבחן מאן-וויטני.
      הערה: אם חוזרים על עצמם, התאמות אלה מניבות תוצאות דומות בהיעדר מניפולציות ניסיוניות נוספות. לדוגמה, מחקר קודם הבחין כי 40 מתוך 47 התאמות הניבו את אותה תוצאה כאשר נערכו בימים⁸ עוקבים.

6. בדיקת צינור בתוך כלוב להערכת היררכיות דומיננטיות חברתית

הערה: עכברים יוצרים היררכיות דומיננטיות חברתיות יציבות שניתן לחשוף על ידי בדיקת צינור סיבוב של כל העכברים בתוך כלוב ^4,6. גם עכברים זכרים וגם נקבות יוצרים את ההיררכיות הללו⁸. היררכיות דומיננטיות חברתיות מוערכות בצורה הטובה ביותר בכלובים המכילים לפחות 5 עכברים.

1. תכננו התאמות מראש, עם איזון נגדי כמתואר בשלב 1.
2. הפעל התאמות בדיקת מבחנה כמתואר בשלב 5. בדוק כלוב אחד בכל פעם ובדוק את כל העכברים בצורה עגולה. נקה את הצינור ואת אזור הבדיקה עם 70% אתנול בין כל משחק.
3. בדוק כל כלוב פעם ביום למשך 5 ימים לפחות כדי לקבוע את סדרי הדירוג היציבים של כל עכבר.
4. לניתוח סטטיסטי, הערך את מספר הניצחונות לכל עכבר. דרג כל עכבר לפי מספר הזכיות.

7. שימוש בבדיקת הצינור לבדיקה טיפולית פרה-קלינית

הערה: החוסן והיציבות של פנוטיפים של דומיננטיות חברתית במודלים רבים של עכברים, כמו גם הקלות בביצוע בדיקת השפופרה, הופכים את בדיקת המבחנה לפרדיגמה שימושית לבדיקה פרה-קלינית של אסטרטגיות טיפוליות. לשם כך, ניתן לבצע את בדיקת המבחנה באמצעות עיצוב בתוך החיה, שכן ניתן לבצע את הבדיקה באופן סדרתי. אפשר גם לעשות עיצוב מוצלב עם תרופה, ואז לשלוט או להיפך. בדיקת המבחנה שימשה בעבר להערכת טיפולים מגבירי פרוגרנולין בעכברי Grn^{+/- 22,23}, שהראו כי פנוטיפים של דומיננטיות חברתית הפיכים במודל עכבר זה. להבהרת הדיון להלן, עכברים יתוארו כ"ביקורת" (סוג פראי, לא טרנסגני וכו') או "מודל" (נוקאאוט, טרנסגני וכו'), והתערבויות ניסיוניות יתוארו כ"רכב" או "מטופל" (התערבות טיפולית). בעוד שעכברים מכונים "בקרה" ו"מודל" להלן, אידיאלי להשתמש בחברי המלטה עבור כל אחת מהקבוצות הללו.

1. לפני התערבות ניסיונית, בצע בדיקה מקדימה כדי לאשר את נוכחותו של פנוטיפ הדומיננטיות החברתית הצפוי בעכברי המודל שישמשו לבדיקה. בדוק את כל מאגר עכברי הביקורת והמודל זה מול זה והשתמש בנתונים אלה כדי להקצות עכברים לקבוצות טיפול כדי להבטיח שהקבוצות מאוזנות בנקודת ההתחלה.
2. ייתכן שיהיה צורך במשכי טיפול שונים בהתאם לטיפול. לדוגמה, אם התרופה היא AAV, אפשרו לעכברים להתאושש מהניתוח ויש להם זמן עד שהתרופה תיכנס לתוקף. אם התרופה היא מולקולה קטנה, קבע את פרדיגמות הטיפול לפני בדיקת המבחנה²².
3. הקצה עכברים לקבוצות ניסוי כך שלעכברים שטופלו ולעכברים מכל גנוטיפ יש פנוטיפים של דומיננטיות חברתית ברמה דומה. אם עכברים נבדקים מספר פעמים מול כמה יריבים, אחוז הניצחון של כל עכבר (מתואר בשלב 5.9) יכול לשמש ליצירת שתי קבוצות עם פנוטיפים דומים.
   1. לחלוקה אקראית באמת של עכברים לקבוצות על סמך הנחיות ARRIVE, השתמש בפרוטוקול אקראיות בלוק המבוסס על אחוז הזכייה של כל עכבר⁸.
4. לאחר הקצאת הקבוצות, בדוק את העכברים במספר נקודות זמן במהלך הטיפול. לפרטים על השוואות המבוצעות בדרך כלל, עיין בהערה למטה:
   הערה: (1) עכברי בקרת רכב לעומת עכברי דגם רכב (זוהי השוואת בקרה כדי להראות שהטיפול ברכב אינו מטשטש את הפנוטיפ של דגם העכבר); (2) עכברי בקרת רכב לעומת עכברי מודל מטופלים (זה בודק את ההשערה שעכברי המודל המטופלים שונים מקבוצת ביקורת רגילה); (3) עכברי דגם רכב לעומת עכברי מודל מטופלים (זה בודק את ההשערה שהטיפול משנה את הפנוטיפ של מודל העכבר); (4) עכברי בקרת רכב לעומת עכברי ביקורת שטופלו (זוהי השוואת בקרה לקביעת השפעות הטיפול בעכברים ללא פנוטיפ דומיננטיות חברתית).
5. בדרך כלל, הבדיקה תבוצע במשך יומיים, עם כ-6 התאמות ביום, עם השוואות (1-4) המוזכרות בשלב 7.4. כדי להימנע מבדיקת יתר, הפעל את ההשוואות (1) ו-(2) ביום הראשון, ואת ההשוואות (3) ו-(4) ביום השני. מכיוון שעכברי בקרת הרכב נבדקים מול שתי קבוצות הדגמים ביום הראשון, יש לשלב את ההתאמות של כל השוואה.
6. לאחר סיום הבדיקה, החזירו את העכברים לכלובים הביתיים שלהם. נקה את הצינור ואת משטח הבדיקה עם 70% אתנול.

בדיקת הצינור שימשה באופן נרחב במודל עכבר של דמנציה פרונטו-טמפורלית עקב מוטציות פרוגרנולין, Grn^+/-  עכברים 8,9,22,23,25. העכברים האלה מפגינים דומיננטיות חברתית נמוכה עד גיל 9 חודשים (איור 2A-D)⁸. פנוטיפ הדומיננטיות החברתית הנמוכה של עכברי Grn^+/- מבוגרים יציב באמצעות בדיקות חוזרות (איור 2A)⁸, מה שהופך אותו למדד תוצאות ניסוי חזק^22,25.

בדיקות בתוך כלוב בוצעו גם בעכברי Grn^+/- כדי לחקור היררכיות דומיננטיות חברתיות בין קגמטים (איור 3A-D)⁸. חשוב לציין שגם עכברים זכרים (איור 3A,B) וגם עכברים נקבות (איור 3C,D) יוצרים את ההיררכיות האלה, ועכברי Grn^+/− גם מציגים דומיננטיות חברתית נמוכה בקרב הזוגות שלהם (איור 3E). באופן מעניין, לעכברי Grn^−/− לא הייתה החריגה הזו (איור 3E).

פנוטיפ הדומיננטיות החברתית הנמוכה המוצג על ידי עכברי Grn^+/-  מבוגרים יותר (איור 2) הופך אותו למדד תוצאה אטרקטיבי עבור התערבויות טיפוליות מגבירות פרוגרנולין. לפני הזרקת AAV, עכברי Grn^+/−−  מציגים פנוטיפ דומיננטיות חברתית נמוכה (איור 4A). Grn^+/− עכברים שהוזרקו עם וירוס ביקורת עדיין מראים פנוטיפ דומיננטי נמוך (איור 4B). לעכברי Grn^+/-  שהוזרקו להם וירוס כדי להגביר את רמות הפרוגרנולין כבר אין את הפנוטיפ הדומיננטי החברתי הנמוך (איור 4C). כאשר משווים עכברי Grn^+/-  שהוזרקו עם AAV ביקורת לעכברי Grn^+/-  שהוזרקו עם AAV מגביר פרוגרנולין, עכברי Grn^+/-  שהוזרקו עם AAV ביקורת מציגים דומיננטיות חברתית נמוכה (איור 4D).

איור 1: סכימה של בדיקת הצינורית. (A) נסיינים משחררים את העכברים ברגע שהם נכנסו לצינור עם כל ארבע הכפות. הצינור צריך להיות קטן מספיק כדי שעכבר לא יוכל להסתובב או לטפס על עכבר אחר. (B) שני העכברים נעים למרכז הצינור, שם הם נפגשים. (C) העכבר הדומיננטי יותר יישאר בצינור, בעוד שהעכבר הפחות דומיננטי ייסוג. העכבר נספר כמפסיד ברגע ששתי כפות יוצאות מהצינור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות מייצגות באמצעות מבחן המבחנה לזיהוי פנוטיפ דומיננטיות חברתית. מחקר זה היה במודל Grn^+/−  עכבר של דמנציה פרונטו-טמפורלית. עכברים נבדקו 3 סיבובים נגד 3 יריבים חדשים, כמתואר בשלב 1. מוצגים אמצעים שונים להצגת הנתונים. (A) לעכברים Grn^+/-  מעל גיל 9 חודשים יש פנוטיפ דומיננטיות חברתית נמוכה ויציב בבדיקות חוזרות (* = מבחן בינומי, p < 0.05; נקודות נתונים מייצגות את אחוזי הניצחון של כל גנוטיפ). (B) נתונים מצטברים משלושת סבבי הבדיקה המתווים את אחוז הניצחונות הכולל לכל גנוטיפ (*** = מבחן בינומי, p = 0.0004). (C) שרטט את מספר הניצחונות של כל עכבר בכל שלושת המשחקים שלו. לעכברי Grn^+/-  היה מספר נמוך יותר של ניצחונות (**** = מבחן מאן-ויטני, עמ ' < 0.0001). כל נקודה היא עכבר. (D) תרשים של אחוז העכברים בכל גנוטיפ עם אחוז זכייה נתון. לעכברי Grn^+/-  היה סיכוי גבוה יותר להיות אחוז זכייה נמוך. (**** = מבחן מאן-וויטני, עמ' < 0.0001). עכברים בני 9-16 חודשים, n = 58 עכברים לקבוצה. הנתונים מותאמים באישור Arrant et ^al.8. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוצאות מייצגות באמצעות מבחן המבחנה לקביעת היררכיית הדומיננטיות החברתית בתוך הכלוב. כלובים של עכברים זכרים או נקבות (n = 4 כלובים למין של 4-5 עכברים כל אחד) נבדקו בצורה סיבובית במשך 5 ימים כדי לאפשר בדיקה של היררכיית הדומיננטיות החברתית.  (א,ב) ציוני הדומיננטיות החברתית של עכברים זכרים ונקבות נקבעו על פי מספר הזכייה, כאשר 5 הוא העכבר הדומיננטי ביותר ו-1 הוא העכבר הכי פחות דומיננטי בכל כלוב. ביום החמישי, גם עכברים זכרים (A) וגם עכברים נקבות (B) נשארו בדרגה אחת מהציון הראשוני שלהם בממוצע. קידוד צבע הוא לפי דירוג יום 1. (ג, ד) לדרגה ביום החמישי היה מתאם מובהק ביותר עם הדרגה ביום הראשון לשני המינים. (E) באמצעות פרדיגמה זו בתוך הכלוב כדי להעריך כלובים שבהם עכברי Grn^+/+, Grn^+/- ו-Grn^−/−  שוכנו יחד, עכברי Grn^+/− הפגינו גם דומיננטיות חברתית נמוכה (מבחן Kruskal-Wallis, p = 0.0063, * = p < 0.05 על ידי מבחן הפוסט-הוק של דאן). מעניין שדומיננטיות חברתית נמוכה לא נצפתה בעכברי Grn^.  הנתונים מותאמים באישור Arrant et al., 2016⁸. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תוצאות מייצגות באמצעות בדיקת מבחנה להערכת יעילות טיפולית פרה-קלינית. (A) בבדיקות הבסיס לפני הזרקת AAV, לעכברי Grn^+/- הייתה דומיננטיות חברתית נמוכה (* = מבחן מאן-וויטני, p = 0.0157; או * = מבחן בינומי, p = 0.0281). באמצעות אקראיות בלוקים, העכברים הוקצו לאחר מכן לקבוצות טיפול, AAV להגברת רמות חלבון הפרוגרנולין (AAV-Grn), או AAV בקרה (AAV-GFP). (B) לעכברי Grn^+/− שהוזרקו לביקורת AAV-GFP הייתה דומיננטיות חברתית נמוכה (* = מבחן מאן-וויטני, p = 0.0196; או * = מבחן בינומי, p = 0.0330). (C) לעכברי Grn^+/- שהוזרקו ל-AAV-Grn כבר לא הייתה דומיננטיות חברתית נמוכה. (D) כאשר משווים בין עכברי Grn^+/- שהוזרקו עם AAV-GFP לעומת AAV-Grn, לעכברים שהוזרקו AAV-Grn הייתה דומיננטיות חברתית גבוהה יותר בהשוואה לעכברי ביקורת שהוזרקו AAV-GFP (** = Mann-Whitney, p = 0.0034; או ** = בינומי, p = 0.0062). n = 19-36 עכברים לקבוצה. הנתונים מותאמים באישור Arrant et ^al.22. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1 ו-2: תכנון ניסוי. גיליון עיצוב התאמת מבחנה לדוגמה. שימו לב להתפלגות של כל קבוצת ניסוי בין הצד השמאלי והימני של הצינור, ולמאמץ למזער את תנועת הכלובים פנימה והחוצה מאזור הבדיקה. קבוצה א' היא שחורה, וקבוצה ב' מופיעה באדום כדי להמחיש את ההתפלגות הזו. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

מבחן המבחנה לדומיננטיות חברתית מספק בדיקה שמאומצת בקלות ומבוצעת במהירות שהחוקרים עשויים למצוא שימושית כמדד תוצאה ראשוני או כחלק מסוללת מבחני התנהגות במודלים של עכברים. מאמר זה מספק פרוטוקולים בסיסיים לביצוע בדיקת מבחנה בין זרים או בין חברים לכלוב.

החוקרים צריכים להיות מודעים למספר פרמטרים שעשויים להשפיע על התנהגות בדיקת המבחנה. עבור כל הפרמטרים הללו, מומלץ לבצע מחקרי פיילוט כדי לקבוע את השפעותיהם על דגם עכבר מסוים. גם עכברים זכרים וגם נקבות עשויים לבצע את בדיקת המבחנה, אך יש לנתח עכברים מכל מין בנפרד מכיוון שחלק מדגמי העכברים מציגים הבדלים בין המינים בפנוטיפ הדומיננטיות החברתית²⁶, בעוד שאחרים אינם 8,15,27,28. ניתן לחזור על בדיקת המבחנה מספר פעמים באותה חיה, הן במהלך מבחן (המאפשר חישוב אחוז זכייה עבור כל עכבר) והן בין מספר מפגשים (המאפשר בדיקת אורך להערכת גיל או השפעות התערבות). עם זאת, חזרה על הבדיקה עשויה להשפיע על פנוטיפים של דומיננטיות חברתית בחלק מדגמי העכברים ^8,11,26. לבסוף, למתח רקע יש השפעה על התנהגות בדיקת המבחנה, כפי שצוין בפרסום בדיקת המבחנה הראשון³. כל העבודה המתוארת כאן בוצעה בעכברים על רקע C57BL/6J, ומאמרים מכוננים אחרונים על בדיקת המבחנה בוצעו גם בעכברים C57BL/6 או C57BL/6J 4,6,17,29. חוקרים העובדים בזנים אחרים עשויים לרצות לאשר את היציבות והשחזור של התנהגות דומיננטית חברתית לפני שהם ממשיכים לניסויים חדשים.

מדד התוצאה העיקרי של בדיקת המבחנה הוא ניצחון/הפסד. עם זאת, קבוצות אחרות תיעדו את האורך של כל משחק ואפילו תת-התנהגויות בכל משחק. לפיכך, החוקרים עשויים לרצות לאסוף מידע כזה כדי להגדיל את עושר הנתונים המתקבלים מכל בדיקה. וואנג ועמיתיו דיווחו כי ההתאמות היו קצרות יותר כאשר זיווג עכברים עם הבדלים גדולים בהיררכיות בתוך הכלוב מאשר בזיווג עכברים מדורגים צמודים, מה שמראה שהעכברים הדומיננטיים ביותר מנצחים במהירות⁶. ג'ואו ועמיתיו ציינו כמה תת-התנהגויות במבחן המבחנה: "דחיפה-יזומה", "דחיפה לאחור", "התנגדות" ו"נסיגה", ומצאו שעכברים מנצחים עסקו יותר בדחיפה והתנגדות, אך פחות נסוגים מאשר עכברים מאבדים¹⁷. בעוד שהקלטת וידאו של התאמות אינה הכרחית, חוקרים המעוניינים בניתוחים מפורטים יותר של התנהגות דומיננטית חברתית עשויים לרצות להקליט כל התאמה.

כמו במבחנים התנהגותיים רבים, בדיקת המבחנה עלולה להתבלבל על ידי ליקויים אחרים שאינם קשורים להתנהגות חברתית. ליקוי מוטורי עשוי להשפיע על ביצועי בדיקת המבחנה, ולכן ייתכן שהחוקרים ירצו לבצע בדיקה בסיסית לפנוטיפים מוטוריים עם בדיקות כגון מוט רוטה, שדה פתוח, בדיקת מוט וכו'. רמזי ריח הם היבט חשוב בהתנהגות חברתית של עכברים^30,31, ולכן על החוקרים גם לסנן ליקויי ריח שעלולים להשפיע על התנהגות בדיקת המבחנה. דרך פשוטה לעשות זאת היא למדוד את הזמן שעכברים מבלים בחקירת שתן מעכבר לא מוכר לעומת מים⁹.

חוקרים המאפיינים התנהגות חברתית במודלים חדשים של עכברים צריכים לשקול להשתמש בבדיקת המבחנה כחלק מסוללת מבחנים חברתיים. מודלים של עכברים עם חריגות בבדיקת מבחנה מציגים לעתים קרובות התנהגות חברתית חריגה במבחנים אחרים כגון מבחן חברותיות בן שלושה חדרים, מבחן תושב-פולש וניקוד איכותי של אינטראקציה חברתית 9,10,11,12,13,14,15,20,27,32,33,34 ^,35. דומיננטיות חברתית בבדיקת המבחנה נמצאת בקורלציה עם דומיננטיות חברתית במשימות אחרות כמו מספרה, סימון שתן ותחרות על נקודה חמה בכלוב 17,36,37. עם זאת, דומיננטיות חברתית במשימות אחרות, כגון תחרות על מזון, מים או גישה לעכברים נקבות, נמצאת בקורלציה פחות טובה עם דומיננטיות חברתית של בדיקת מבחנה ^7,38. על ידי שימוש בסוללת בדיקות, חוקרים עשויים להשיג מדדים של דומיננטיות חברתית, תוקפנות, חקירה חברתית והכרה חברתית במודלים העכבריים שלהם.

בדיקת המבחנה שימשה כמדד תוצאה עיקרי בבדיקת גישות טיפוליות פרה-קליניות 22,23,25 במודל העכברים Grn^+/- בשל היציבות של פנוטיפים של דומיננטיות חברתית לאורך זמן והיכולת לבדוק עכברים שוב ושוב. חוקרים המעוניינים להשתמש במבחן המבחנה כדי לסנן התערבויות צריכים לקבוע תחילה את היציבות של פנוטיפים של דומיננטיות חברתית על פני בדיקות חוזרות ונשנות במודל העכבר שלהם. כדי לעשות זאת, בדוק תחילה את העכברים, ולאחר מכן בדוק שוב ושוב את אותן התאמות במרווחים של יום, שבוע או חודש. אם יש צורך בלוחות זמנים ניסיוניים ארוכים יותר, ניתן לבצע חזרות אלה במרווחי זמן ארוכים עוד יותר. ניתן לקבוע סטטיסטית את ההתאמה בין התאמות אלה על ידי חישוב ערך הקאפה בין הבדיקות. אם בדיקת הצינור משיגה יציבות מתאימה בדגם העכבר, היא מבצעת בדיקת סינון אידיאלית בשל פשטותה ומהירותה.

אריק ד. רוברסון שימש כיועץ ל-AGTC וללילי וקיבל תמלוגים מג'ננטק.

אנו מודים לג'יימס בלאק ומרים רוברסון על העזרה בגידול עכברים ותחזוקת המושבה, לאנתוני פיליאנו ואלישיה הול על הסיוע במבחני פיילוט לבדיקת צינורות, ולרוברט פארס ג'וניור על אספקת עכברי נוקאאוט של פרוגרנולין. עבודה זו נתמכה על ידי הקונסורציום למחקר FTD ופרויקט Bluefield לריפוי FTD, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (R01NS075487, P30NS047466 ו-F32NS090678), והמכון הלאומי להזדקנות (P30AG086401, R00AG056597 ו-K00AG068428). ניסויי התנהגות בוצעו במתקן הליבה להערכת התנהגות בעלי חיים באוניברסיטת אלבמה בברמינגהם.