אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

פרוטוקול זה מציג שיטה מעשית המשתמשת ב-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק התייחסות לחוקרים להבהיר ביעילות מבנים מקרומולקולריים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM).

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) חולל מהפכה בביולוגיה מבנית בכך שאפשר לחקור מבנים מקרומולקולריים בתנאים כמעט טבעיים, תלויים בקרח זגוגי. טכניקה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים וביו-מולקולות אחרות ללא צורך בהתגבשות, ומציעה תובנות משמעותיות לגבי תפקודם ומנגנוןם. ההתקדמות האחרונה בניתוח חלקיקים בודדים, יחד עם עיבוד נתונים חישובי משופר, הפכו את cryo-EM לכלי הכרחי בביולוגיה מבנית מודרנית. למרות האימוץ ההולך וגובר שלו, cryo-EM מתמודד עם אתגרים מתמשכים שיכולים להגביל את יעילותו, במיוחד פיזור חלקיקים לא אחיד. בעיה זו מובילה לעתים קרובות לרזולוציה ירודה ולדיוק מופחת במבני חלבון משוחזרים. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומעשית להתמודדות עם אתגר זה, תוך שימוש בחלבון הלם חום קטן מ- Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה. השיטה מייעלת את הכנת הדגימה כדי למזער ספיחה מועדפת, ומבטיחה פיזור חלקיקים הומוגני יותר ומבני cryo-EM חלבון איכותיים יותר. טכניקה זו מציעה הדרכה חשובה לחוקרים השואפים להתגבר על אתגרים דומים במחקרים מבניים.

עם ההתקדמות האחרונה הן בחומרת המכשיר ^1,2 והן בתוכנת עיבוד תמונה ^3,4,5, מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) התגלה ככלי פופולרי ורב-עוצמה בביולוגיה מבנית מודרנית. למרות פריצות הדרך הללו, צווארי בקבוק נמשכים בהשגת מבנים מקרומולקולריים ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-EM. אתגר משמעותי אחד כזה הוא התפלגות החלקיקים הלא אחידה, כולל תופעת העדפת הכיוון, הנצפית בעיקר בממשק אוויר-מים 6,7,8,9.

במהלך זיגוג הדגימה, חלק מהמולקולות מפגינות נטייה ליישר את עצמן לאורך צירים ספציפיים ברשת. זה מוביל להתפלגות לא אחידה של תצוגות חלקיקים במערך הנתונים הסופי. כיוונים מסוימים עשויים להיות מיוצגים יתר על המידה בעוד שאחרים אינם מיוצגים או נעדרים לחלוטין, וכתוצאה מכך דגימה לא שלמה של ארכיטקטורת החלבון הכוללת. אזורים של החלבון המכוונים באופן מועדף לכיוון אלומת האלקטרונים ייראו בולטים יותר במפת הצפיפות, בעוד שאזורים המכוונים הרחק מהקרן עשויים להיות לא מזוהים או חסרים לחלוטין^10,11. כתוצאה מכך, התפלגות חלקיקים לא אחידה מכניסה הטיות וחפצים פוטנציאליים למבנה התלת מימדי המשוחזר הסופי (3D). יש לציין כי אלמנטים מבניים מרכזיים כגון סלילי אלפא ויריעות בטא עשויים להיות מוטים, שרשראות חומצות אמינו או נוקלאוטידים עשויות להיראות מקוטעות, וצפיפות של מקטעי חלבון או חומצות גרעין ספציפיות עלולות להפגין עיוות¹². בסופו של דבר, מצגי שווא אלה מהווים אתגר גדול לפענוח מדויק של המבנה והתפקוד של מולקולות ביולוגיות.

כיום נעשה שימוש בגישות ניסיוניות שונות כדי להתגבר על אתגרים כאלה, כולל אופטימיזציה של הכנת דגימות ^13,14,15, טיפול ברשת 16,17,18,19,20,21,22 ואסטרטגיית איסוף נתונים²³. יש לציין כי מומלץ להתייחס לאתגר בשלב הכנת הדגימה במידת האפשר⁷. אופטימיזציות נפוצות בהכנת הדגימה כוללות שינוי הרכב המאגר, הכנסת שותפי קשירה מולקולריים קטנים או מקרומולקולריים, יצירת קישורים צולבים תוך-מולקולריים וחומרי ניקוי משתנים. זה נכון גם לגבי חלבוני ממברנה^24,25, אם כי יש להשתמש בחומרי ניקוי במיוחד למטרות טיהור וייצוב. בין אלה, ההתאמה האישית, העלות-תועלת והנגישות הנרחבת של אופטימיזציה של מאגר חלבון הופכים אותה לאסטרטגיה מועדפת ברוב המעבדות. גישה זו מאפשרת התאמה מדויקת ומיידית של הפרמטרים השונים כך שיתאימו לדרישה הספציפית של כל דגימת חלבון. באמצעות חידוד איטרטיבי, חוקרים יכולים לבדוק באופן שיטתי תנאי חיץ מגוונים ולהתאים פרמטרים שונים שמטרתם למזער כיוונים מועדפים ולשפר את האיכות הכוללת של נתוני cryo-EM. פשוט שינוי רכיבי חיץ חלבון והתאמת ריכוזיהם הוכיח יעילות בהשפעה על יציבות החלבון על ידי אפנון מטען פני השטח, וכתוצאה מכך השפעה על התנהגות החלבון בתוך קרח זגוגית²⁵. לכן, אופטימיזציה של הרכב מאגר החלבון נחשבת לאחת הגישות הנוחות והפשוטות ביותר להתמודדות עם אתגרים נפוצים ב-cryo-EM.

כאן, מוצע פרוטוקול לטיפול במכשול נפוץ ב-cryo-EM - התגברות על פיזור חלקיקים לא אחיד. בפרוטוקול זה, נהלי מפתח להכנת חלבון וסינון חוצץ, בתוספת הכנת רשת, מתוארים באמצעות חלבון הלם חום קטן מ-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)²⁶ כמחקר מקרה (איור 1). sHSP זה יציב מבחינה טבעית, בעל מסה מולקולרית של 16.5 kDa למונומר, ומתאסף לכלוב אוקטהדרלי^{של 24 mer 26,27}, מה שהופך אותו למועמד אטרקטיבי לניתוח מבני על ידי cryo-EM. עם זאת, התצפית על התפלגות חלקיקים לא אחידה במהלך איסוף נתוני cryo-EM לא הייתה צפויה, והיא התגלתה כאתגר משמעותי במהלך הניסויים. יתר על כן, נדונות גישות פוטנציאליות מועילות לחוקרים המתמודדים עם אתגרים דומים, ובכך מקלות על הבהרה יעילה של מבנים מקרומולקולריים באמצעות cryo-EM.

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיהור חלבונים

1. לגרום לביטוי של MjsHSP16.5 רקומביננטי ב-E. coli BL21(DE3) ולטהר את החלבון באמצעות עמודת כרומטוגרפיה של ניקל-כלאט כפי שתואר קודם לכן²⁶. לאחר הטיהור בעמודה²⁶ של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC), בחנו את טוהר החלבון על ידי העמסת 5 מיקרוליטר של שברי שיא על ג'ל SDS-PAGE 12.5% והדמיה על ידי צביעה כחולה סטנדרטית של Coomassie²⁸ (איור 2).
2. רכז את שברי המאגר המכילים MjsHSP16.5 ב-4 מעלות צלזיוס עד כ-65 מ"ג/מ"ל באמצעות מסננים צנטריפוגליים עם חתך משקל מולקולרי של 50 kDa, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
   הערה: יש להניח בעדינות תמיסת חלבון פיפטה כל 5 דקות במהלך הצנטריפוגה כדי למנוע צבירת חלבון.
3. לאחר הריכוז, צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים, הוציא את הסופרנטנט לנפחים של 50 מיקרוליטר בצינורות PCR דקים של 0.2 מ"ל, הקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי ואחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

2. הכנת חלבונים להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)

1. הפשירו שתי שפופרות חלבון קפואות על קרח. לאחר ההפשרה, ערבבו בעדינות את התמיסה על ידי לחיצה על הצינור מספר פעמים כדי להבטיח הומוגניות וצנטריפוגה של תמיסת החלבון ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים.
2. הזרקו את הסופרנטנט לעמודת SEC ואספו שברי פליטה של 0.5 מ"ל.
3. אסוף את שברי הפליטה המתאימים לשיא המציג את ספיגת ה-UV הגבוהה ביותר ב-280 ננומטר ומדוד את ריכוז החלבון בשברים אלה באמצעות מבחן ברדפורד²⁹.
   הערה: כדי להבטיח ריכוז חלבון מספיק בשבר שיא יחיד עבור היישומים במורד הזרם, יש צורך בטעינת כמות גבוהה של דגימת חלבון על עמודת ה-SEC תוך שמירה על הקיבולת המומלצת של העמודה.

3. חילופי מאגר

1. הכן את תמיסת החיץ הרצויה (9 מ"מ של MOPS-Tris (pH 7.2), 50 מ"מ של NaCl ו-0.1 מ"מ של EDTA), החלק את המאגרים לכוסות של 50 מ"ל ושמור את כוסות החיץ ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: בהתבסס על ידע מוקדם של הביוכימיה של חלבון המטרה, הכינו מגוון תמיסות חיץ עם הרכבים שונים (סוגי חיץ, pH וחוזק יוני), כגון 20 מ"מ של HEPES (pH 7.5), 100 מ"מ של NaCl ו-0-5 מ"מ של DTT, כדי לזהות את התנאים המקדמים מסיסות חלבון אופטימלית, הומוגניות ויציבות בהכנת הרשת במורד הזרם.
2. הכן את קרום הדיאליזה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
3. חותכים את קרום הדיאליזה לחתיכות בגודל 30 מ"מ על 30 מ"מ בעזרת מספריים. איזון הממברנות הללו על ידי דגירה במים מזוקקים או בתמיסות חיץ (איור 3A).
4. הוסף 55 מיקרוליטר מתמיסת החלבון (כ-2.5 מ"ג/מ"ל) לתא של לחצני מיקרודיאליזה של 50 מיקרוליטר (איור 3B).
5. החזיקו את קרום הדיאליזה אנכית באמצעות מלקחיים וגעו בעדינות בקצה אחד של הממברנה בנייר טישו כדי לנקז עודפי נוזלים (איור 3C). כסו בזהירות את כפתור המיקרודיאליזה עם הממברנה, וודאו שלא יוחדרו בועות אוויר לתא המיקרודיאליזה (איור 3D). הנח את טבעת ה-O על גבי קרום הדיאליזה. גלגל בעדינות את טבעת ה-O לתוך החריץ בקצה הכפתור.
6. שיטה חלופית: הניחו את טבעת ה-O לאורך הציר של חולצת גולף ומקמו את חולצת הגולף הפוכה על הממברנה (איור 3E). החלק בעדינות את טבעת ה-O במורד טי הגולף עד שהיא מחליקה על שפת הכפתור (איור 3F). הנח בזהירות את טבעת ה-O לתוך החריץ בקצה הכפתור (איור 3G).
7. טבלו כל כפתור דיאליזה בכוס נפרדת המכילה את מאגר היעד כשצד הממברנה פונה כלפי מעלה (איור 3H).
8. שמור את הכוסות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך תהליך הדיאליזה. החלף את מאגר הדיאליזה לאחר שעתיים והמשך בדיאליזה למשך הלילה.
9. השתמשו במזרק עם מחט דקה (למשל, מזרק המילטון או מזרק אינסולין) כדי לנקב בזהירות את הממברנה ולשחזר את תמיסת החלבון מתא המיקרודיאליזה (איור 3I). אחסן את דגימת החלבון בצינור מיקרוצנטריפוגה על קרח עד לשימוש נוסף. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד²⁹.

4. הכנת רשת

1. בחר את סוג הרשת המתאים.
   הערה: בדרך כלל נעשה שימוש בסרט פחמן חורי אמורפי על תומך נחושת. יש לבחור את עובי סרט הפחמן, גודל החור ומספר הרשת על סמך עובי הקרח הרצוי. רשתות מצופות פחמן Holey שימשו להכנת דגימה של MjsHSP16.5.
2. אחזו בעדינות ברשתות בקצוות בעזרת פינצטה כדי למנוע נזק לחורי הרשת. מקם את הרשתות על מחזיק רשת כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה. הנח את מחזיק הרשת בתא של מערכת פריקת הזוהר.
3. בצע פריקת זוהר למשך 60 שניות ב-15 mA כדי להפוך את הרשת להידרופילית. מומלץ להחיל מטען שלילי במהלך תהליך זה.
   הערה: הפרמטרים המומלצים משמשים כנקודת התחלה למערכת פריקת הזוהר המשמשת במחקר זה. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה בהתאם לסוג מכשיר פריקת הזוהר וכדי להשיג את רמת ההידרופיליות הרצויה עבור חומרי רשת ספציפיים. לניקוי פלזמה, שקול לבדוק גזים חלופיים או תערובות גז כגון תערובות מימן או ארגון-חמצן.
4. שלב אופציונלי: הכנס תמיסות כימיות נוספות, כגון 99% עמילמין בבקבוק זכוכית פתוח, לתוך תא הסמוך למחזיק הרשת כדי לייצר באופן ספציפי מטען חיובי נטו על הרשת.
5. השתמש ברשתות המשוחררות תוך 0.5-1 שעה כדי להבטיח ביצועים מיטביים.

5. הכנת רשת כתמים שליליים

1. טען 5 מיקרוליטר מהדגימה (50-300 ננומטר או 20-120 ננוגרם/מ"ל) על הרשת המשוחררת מהזוהר. אפשר לדגימה לנוח ללא הפרעה על פני הרשת למשך דקה אחת כדי להקל על שקיעת החלבונים.
2. הכינו שלוש טיפות מים של 50 מיקרוליטר כל אחת על יריעת סרט פרפין. שטפו בעדינות את הדגימה על הרשת על ידי שפשוף משטח הרשת על פני טיפת המים הראשונה. חזור על שלב הכביסה עם שתי טיפות המים הנותרות.
   הערה: זמני הכביסה עשויים להיות אופטימליים בהתאם לדרישות הספציפיות של כל ניסוי.
3. טען 5 מיקרוליטר מתמיסת אורניל אצטט המסוננת 1% (w/v) על הרשת ופיפטה מיד את תמיסת האורניל אצטט.
4. טען עוד 5 מיקרוליטר מתמיסת אורניל אצטט 1% (w/v) על הרשת. אפשר לרשת לדגור בתמיסת אורניל אצטט למשך 90 שניות לצביעה.
   הערה: ניתן לכוונן ולייעל את זמן הצביעה בהתאם לדוגמאות ספציפיות.
5. גע בעדינות בצד הפינצטה של הרשת עם נייר סינון כדי להסיר תמיסת כתמים עודפת. הניחו לרשת להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר. אחסן את הרשת המיובשת במיכל רשת בטמפרטורת החדר עד לתצפית.

6. ויטריפיקציה לדוגמא

1. לדלל את דגימת החלבון לריכוז הרצוי.
   הערה: ריכוז החלבון צריך להיות גבוה מספיק כדי למקסם את מספר החלקיקים בכל חור, אך נמוך מספיק כדי להבטיח פיזור של חלקיקים בודדים. ריכוזי חלבון Cryo-EM נעים בדרך כלל בין 0.5 ל-2 מ"ג/מ"ל. עם זאת, חלבונים מסוימים, בהתאם למשקלם המולקולרי ולתנאי הכנת הדגימה הספציפיים שלהם, עשויים לדרוש ריכוזים מחוץ לטווח זה.
2. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים.
3. הפעל את מכשיר הקפאת הצלילה. מלאו את מאגר מכשיר האדים במים מזוקקים. הרכיבו ניירות סינון עם טבעות על רפידות כתמים. הגדר את הפרמטרים לזיגוג (טמפרטורה: 4 מעלות צלזיוס, לחות: 100%, זמן כתם: 6 שניות, כוח כתם: 5 יחידות, זמן המתנה: 10 שניות).
   הערה: זמן וכוח הכתם הם פרמטרים חשובים לאופטימיזציה של מכשיר הזיגוג, שכן הוצאת מים מהרשת וחשיפת חלקיקים לממשק אוויר-מים יכולים לגרום להטיית דיסוציאציה או כיוון.
4. הרכיבו את רכיבי מיכל הקריוגן, כולל הפליז, מחזיק קופסת הרשת, יחידת העכביש וטבעת נגד זיהום, לתוך מגש הבסיס. מצננים את מכלול המיכל על ידי מילוי המגש בחנקן נוזלי. מלאו את הפליז בקריוגן (אתאן נוזלי). הסר את יחידת העכביש ברגע שהקריוגן מגיע לטמפרטורת ההיתוך.
5. הרכיבו את הפינצטה ומכלול הרשת על המכשיר, טענו את הדגימה (בדרך כלל 4 מיקרוליטר) על צד הפחמן של הרשת, והתחילו את תהליך הקפאת הצלילה.
6. נתק בזהירות את הפינצטה מהמכשיר, הנח את הרשת על קופסת רשת אחסון ואטום את הקופסה במכסה. אחסן את קופסת הרשת המכילה את הדגימות המזוגגות בחנקן נוזלי.

7. טעינת הרשתות ל-TEM

1. הרכיבו את תחנת ההרכבה של autogrid וקררו אותה עם חנקן נוזלי.
2. הנח את קופסת הרשת המכילה רשתות מזוגגות ופתח את המכסה בזהירות כדי לגשת לרשתות. מקם תיבת אחסון אוטומטית ריקה בקרבת מקום להעברה קלה של רשתות מורכבות.
3. הנח את טבעת הרשת האוטומטית בחלל החיתוך המיועד לטבעת בתחנת ההרכבה. הזיזו בזהירות את הרשת המזוגגת מתיבת הרשת והתאימו אותה לטבעת הרשת האוטומטית. ודא שהרשת והטבעת מיושרות.
4. יישר את הדיסק כדי למקם את פתח העיגול על גבי טבעת הרשת האוטומטית ומכלול הרשת. כדי לקבע את הרשת בטבעת הרשת האוטומטית, הניחו את כלי הכנסת מהדק C על גבי הרשת ולחצו בעדינות כלפי מטה כדי ללחוץ על קליפ ה-C שבתוכו.
5. סובב את הדיסק לאחור והעבר את הרשתות המורכבות לתוך תיבת האחסון של הרשת האוטומטית.
6. הרכיבו את עמדת טעינת הקלטות וקררו את עמדת הטעינה בחנקן נוזלי.
7. הנח את תיבת האחסון האוטומטית בתחנת הטעינה. העבר את מכלול הרשת מקופסת האחסון של הרשת האוטומטית לקלטת והקש בעדינות על הרשת כדי להבטיח מיקום נכון.
8. השתמש בידית כדי למקם את הקסטה בקפסולת הטוען האוטומטי. בדוק את הסיכה בטעינה האוטומטית כדי לאשר את תנועתו החופשית ולוודא שהיא אינה קפואה.
9. עגן את קפסולת המטען האוטומטי ל-TEM לתצפית ברשת.

כדי לזהות תנאי רשת אופטימליים עבור MjsHSP16.5, נערכה סריקה ראשונית של cryo-EM, שהתמקדה בעיקר בבחינת תנאי חיץ חלבונים שונים: (1) מאגר הטיהור הסופי, המבטיח את היציבות וההומוגניות של MjsHSP16.5 וחשוב להתגבשותו³⁰; (2) מאגרים המותאמים לתנאים הדרושים לגידול גבישי MjsHSP16.5 באיכות עקי...

כל מחקרי מבני החלבון מתחילים בטיהור חלבון, תהליך איטרטיבי להשגת איזון בין בידוד מטרות חלבון עם טוהר והומוגניות גבוהים תוך שמירה על הפונקציונליות הטבעית שלהם. למרות שהרכבי החיץ לטיהור ושימור דגימות חלבון נבחרים בקפידה במהלך תהליך הטיהור, מאגרים אלה מהווים לעתים קרובות ?...

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים למרכז השיתופי למתקני מחקר (CCRF) (אוניברסיטת סונגקיונקוואן, קוריאה) על שהעניק לנו בנדיבות גישה למתקן ה-cryo-EM שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) ל-K.K.K. (מס' 2021M3A9I4022936). השימוש במתקני cryo-EM של קונסורציום NEXUS נתמך על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה RS-2024-00440289.