Optimisation de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique cryogénique

Ce protocole présente une méthode pratique utilisant Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) comme exemple pour traiter la distribution inégale des particules par l’optimisation de la préparation des échantillons, fournissant une référence aux chercheurs pour élucider efficacement les structures macromoléculaires à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM).

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) a révolutionné la biologie structurale en permettant l’étude des structures macromoléculaires dans des conditions proches de leur origine, suspendues dans de la glace vitrée. Cette technique permet de visualiser à haute résolution des protéines et d’autres biomolécules sans avoir besoin de cristallisation, offrant ainsi des informations significatives sur leur fonction et leur mécanisme. Les progrès récents de l’analyse des particules uniques, associés à l’amélioration du traitement des données informatiques, ont fait de la cryo-EM un outil indispensable en biologie structurale moderne. Malgré son adoption croissante, la cryo-EM est confrontée à des défis persistants qui peuvent limiter son efficacité, en particulier la distribution inégale des particules. Ce problème conduit souvent à une mauvaise résolution et à une précision réduite dans les structures protéiques reconstruites. Cet article décrit une approche simple et pratique pour relever ce défi, en utilisant la petite protéine de choc thermique de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) à titre d’exemple. La méthode optimise la préparation des échantillons pour minimiser l’adsorption préférentielle, assurant une distribution plus homogène des particules et des structures cryo-EM protéiques de meilleure qualité. Cette technique offre des conseils précieux aux chercheurs qui souhaitent surmonter des défis similaires dans les études structurales.

Avec les progrès récents du matériel d’instrument ^1,2 et de son logiciel de traitement d’image ^3,4,5, la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) est devenue un outil populaire et puissant en biologie structurale moderne. Malgré ces percées, des goulets d’étranglement persistent dans la réalisation de structures macromoléculaires à haute résolution à l’aide de la cryo-EM. L’un de ces défis importants est la distribution inégale des particules, y compris le phénomène de préférence d’orientation, qui est principalement observé à l’interface air-eau 6,7,8,9.

Lors de la vitrification de l’échantillon, certaines molécules ont tendance à s’aligner le long d’axes spécifiques sur la grille. Cela conduit à une distribution inégale des vues de particules dans l’ensemble de données final. Certaines orientations peuvent être surreprésentées tandis que d’autres sont sous-représentées ou complètement absentes, ce qui entraîne un échantillonnage incomplet de l’architecture totale des protéines. Les régions de la protéine qui sont préférentiellement orientées vers le faisceau d’électrons apparaîtront plus proéminentes dans la carte de densité, tandis que les régions orientées à l’opposé du faisceau peuvent être mal résolues ou complètement absentes^10,11. Par conséquent, une distribution inégale des particules introduit des biais et des artefacts potentiels dans la structure tridimensionnelle (3D) finale reconstruite. Notamment, des éléments structurels clés tels que les hélices alpha et les feuillets bêta peuvent devenir asymétriques, les chaînes d’acides aminés ou de nucléotides peuvent apparaître fragmentées et les densités de segments spécifiques de protéines ou d’acides nucléiques peuvent présenter une distorsion¹². En fin de compte, ces fausses déclarations posent un défi majeur pour démêler avec précision la structure et la fonction des molécules biologiques.

Diverses approches expérimentales sont actuellement utilisées pour surmonter ces défis, notamment l’optimisation de la préparation des échantillons 13,14,15, le traitement par grille 16,17,18,19,20,21,22 et la stratégie de collecte de données²³. Il est notamment conseillé de relever le défi au stade de la préparation de l’échantillon dans la mesure du possible⁷. Les optimisations courantes dans la préparation des échantillons comprennent la modification de la composition du tampon, l’introduction de partenaires de liaison de petites molécules ou macromoléculaires, la génération de réticulations intramoléculaires et la variation des détergents. Cela est également vrai pour les protéines membranaires^24,25, bien que les détergents doivent être utilisés spécifiquement à des fins de purification et de stabilisation. Parmi ceux-ci, la personnalisation, la rentabilité et l’accessibilité généralisée de l’optimisation des tampons protéiques en font une stratégie privilégiée dans la plupart des laboratoires. Cette approche permet des ajustements précis et immédiats des différents paramètres pour répondre aux besoins spécifiques de chaque échantillon de protéines. Grâce à un raffinement itératif, les chercheurs peuvent tester systématiquement diverses conditions tampons et ajuster divers paramètres visant à minimiser les orientations préférées et à améliorer la qualité globale des données cryo-EM. Le simple fait de varier les composants du tampon protéique et d’ajuster leurs concentrations a démontré son efficacité à influencer la stabilité des protéines en modulant la charge de surface, ce qui a eu un impact sur le comportement des protéines dans la glace vitrée²⁵. Par conséquent, l’optimisation de la composition du tampon protéique est considérée comme l’une des approches les plus pratiques et les plus simples pour relever les défis courants de la cryo-EM.

Ici, un protocole est suggéré pour résoudre un obstacle courant dans la cryo-EM : surmonter la distribution inégale des particules. Dans ce protocole, les principales procédures de préparation des protéines et de criblage des tampons, complétées par la préparation de la grille, sont décrites à l’aide d’une petite protéine de choc thermique de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)²⁶ à titre d’étude de cas (Figure 1). Ce sHSP est nativement stable, a une masse moléculaire de 16,5 kDa par monomère et s’assemble en une cage octaédrique de^{24 mers 26,27}, ce qui en fait un candidat intéressant pour l’analyse structurale par cryo-EM. Cependant, l’observation d’une distribution inégale des particules lors de la collecte de données cryo-EM n’a pas été anticipée, et elle est apparue comme un défi important au cours des expériences. De plus, des approches potentielles bénéfiques pour les chercheurs qui s’attaquent à des défis similaires sont discutées, facilitant ainsi l’élucidation efficace des structures macromoléculaires à l’aide de la cryo-EM.

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Purification des protéines

1. Induire l’expression de MjsHSP16.5 recombinant chez E. coli BL21(DE3) et purifier la protéine à l’aide d’une colonne de chromatographie chélatrice au nickel comme décrit précédemment²⁶. Après la purification sur une colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC)²⁶, examiner la pureté de la protéine en chargeant 5 μL de fractions de pic sur un gel SDS-PAGE à 12,5 % et en visualisant par coloration au bleu de Coomassie^{standard 28} (Figure 2).
2. Concentrer les fractions de piscine contenant du MjsHSP16.5 à 4 °C à environ 65 mg/mL à l’aide de filtres centrifuges avec une limite de poids moléculaire de 50 kDa, conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Pipetez doucement la solution protéique toutes les 5 minutes pendant la centrifugation pour éviter l’agrégation des protéines.
3. Après la concentration, centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les agrégats, aliquoter le surnageant dans des volumes de 50 μL dans des tubes PCR à paroi mince de 0,2 mL, congeler les tubes dans de l’azote liquide et stocker les échantillons à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.

2. Préparation des protéines pour l’imagerie en microscopie électronique à transmission (MET)

1. Décongeler deux tubes de protéines congelés sur de la glace. Une fois décongelée, mélangez doucement la solution en agitant le tube plusieurs fois pour assurer l’homogénéité et centrifugez la solution protéique à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les agrégats.
2. Injecter le surnageant dans une colonne SEC et recueillir des fractions d’élution de 0,5 mL.
3. Collectez les fractions d’élution correspondant au pic présentant l’absorbance UV la plus élevée à 280 nm et mesurez la concentration en protéines dans ces fractions à l’aide du test Bradford²⁹.
   REMARQUE : Pour garantir une concentration suffisante de protéines dans une fraction de pic unique pour les applications en aval, il est nécessaire de charger une grande quantité d’échantillon de protéines sur la colonne SEC tout en restant dans les limites de la capacité recommandée de la colonne.

3. Échange de tampon

1. Préparez la solution tampon souhaitée (9 mM de MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM de NaCl et 0,1 mM d’EDTA), aliquotez les tampons dans des béchers de 50 ml et maintenez les béchers tampons à 4 °C.
   REMARQUE : Sur la base de connaissances préalables de la biochimie de la protéine cible, préparez une variété de solutions tampons avec différentes compositions (types de tampons, pH et force ionique), telles que 20 mM de HEPES (pH 7,5), 100 mM de NaCl et 0-5 mM de DTT, afin d’identifier les conditions qui favorisent la solubilité, l’homogénéité et la stabilité optimales des protéines dans la préparation de la grille en aval.
2. Préparez la membrane de dialyse en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
3. Coupez la membrane de dialyse en morceaux de 30 mm x 30 mm à l’aide de ciseaux. Équilibrez ces membranes en les incubant dans de l’eau distillée ou des solutions tampons (Figure 3A).
4. Ajouter 55 μL de la solution protéique (environ 2,5 mg/mL) dans la chambre des boutons de microdialyse de 50 μL (figure 3B).
5. Tenez la membrane de dialyse verticalement à l’aide d’une pince et touchez doucement un bord de la membrane contre du papier de soie pour drainer l’excès de liquide (Figure 3C). Couvrez soigneusement le bouton de microdialyse avec la membrane, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite dans la chambre de microdialyse (Figure 3D). Placez le joint torique sur la membrane de dialyse. Enroulez doucement le joint torique dans la rainure sur le bord du bouton.
6. Méthode alternative : Placez le joint torique le long de l’axe d’un tee de golf et positionnez le tee de golf à l’envers sur la membrane (Figure 3E). Faites glisser doucement le joint torique le long du tee de golf jusqu’à ce qu’il glisse sur le bord du bouton (Figure 3F). Guidez avec précaution le joint torique dans la rainure située sur le bord du bouton (Figure 3G).
7. Immergez chaque bouton de dialyse dans un bécher séparé contenant le tampon de destination, le côté de la membrane vers le haut (Figure 3H).
8. Maintenez les béchers à 4 °C pendant le processus de dialyse. Changez le tampon de dialyse après 2 h et poursuivez la dialyse pendant la nuit.
9. À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille fine (p. ex. seringue Hamilton ou seringue à insuline), poinçonner soigneusement la membrane et récupérer la solution protéique de la chambre de microdialyse (figure 3I). Conservez l’échantillon de protéines dans un tube de microcentrifugation sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Mesurez la concentration en protéines à l’aide du test Bradford²⁹.

4. Préparation de la grille

1. Choisissez le type de grille approprié.
   REMARQUE : Un film de carbone troué amorphe sur un support en cuivre est couramment utilisé. L’épaisseur du film de carbone, la taille du trou et le nombre de mailles doivent être choisis en fonction de l’épaisseur de glace souhaitée. Des grilles recouvertes de carbone Holey ont été utilisées pour la préparation des échantillons de MjsHSP16.5.
2. Saisissez doucement les grilles sur les bords à l’aide d’une pince à épiler pour éviter d’endommager les trous de la grille. Positionnez les grilles sur un support de grille avec le côté carbone vers le haut. Placez le support de grille dans la chambre du système de décharge lumineuse.
3. Effectuez une décharge de lueur pendant 60 s à 15 mA pour rendre la grille hydrophile. Il est recommandé d’appliquer une charge négative au cours de ce processus.
   REMARQUE : Les paramètres recommandés servent de point de départ pour le système de décharge luminescente utilisé dans cette étude. Une optimisation peut être nécessaire en fonction du type d’instrument à décharge luminescente et pour atteindre le niveau d’hydrophilie souhaité pour des matériaux de grille spécifiques. Pour le nettoyage au plasma, envisagez de tester des gaz alternatifs ou des mélanges de gaz tels que l’hydrogène ou les mélanges argon-oxygène.
4. Étape facultative : introduire des solutions chimiques supplémentaires, telles que de l’amylamine à 99 % dans une bouteille en verre ouverte, dans une chambre adjacente au support de la grille pour produire spécifiquement une charge positive nette sur la grille.
5. Utilisez les grilles déchargées dans un délai de 0,5 à 1 h pour garantir des performances optimales.

5. Préparation de la grille de coloration négative

1. Chargez 5 μL de l’échantillon (50-300 nM ou 20-120 ng/mL) sur la grille de décharge luminescente. Laisser reposer l’échantillon sans être dérangé sur la surface de la grille pendant 1 min pour faciliter la sédimentation des protéines.
2. Préparez trois gouttes d’eau de 50 μL chacune sur une feuille de film de paraffine. Lavez délicatement l’échantillon sur la grille en frottant la surface de la grille contre la surface de la première goutte d’eau. Répétez l’étape de lavage avec les deux gouttes d’eau restantes.
   REMARQUE : Les temps de lavage peuvent être optimisés en fonction des exigences spécifiques de chaque expérience.
3. Chargez 5 μL de la solution d’acétate d’uranyle filtrée à 1 % (p/v) sur la grille et pipetez immédiatement la solution d’acétate d’uranyle.
4. Chargez 5 μL supplémentaires de la solution d’acétate d’uranyle à 1 % (p/v) sur la grille. Laisser la grille incuber dans la solution d’acétate d’uranyle pendant 90 s pour la coloration.
   REMARQUE : Le temps de coloration peut être ajusté et optimisé en fonction d’échantillons spécifiques.
5. Touchez doucement le côté pince à épiler de la grille avec du papier filtre pour éliminer l’excès de solution de coloration. Laissez la grille sécher complètement à l’air libre à température ambiante. Conservez la grille séchée dans un récipient à grille à température ambiante jusqu’à observation.

6. Vitrification de l’échantillon

1. Diluez l’échantillon de protéines à la concentration souhaitée.
   REMARQUE : La concentration en protéines doit être suffisamment élevée pour maximiser le nombre de particules dans chaque trou, mais suffisamment faible pour assurer la distribution des particules individuelles. Les concentrations en protéines Cryo-EM varient généralement de 0,5 à 2 mg/mL. Cependant, certaines protéines, en fonction de leur poids moléculaire et des conditions spécifiques de préparation des échantillons, peuvent nécessiter des concentrations en dehors de cette plage.
2. Centrifugez l’échantillon à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer tous les agrégats.
3. Allumez l’instrument de congélation plongeante. Remplissez le réservoir de l’humidificateur avec de l’eau distillée. Montez les papiers filtres avec anneaux sur des tampons tamponneux. Réglez les paramètres de vitrification (température : 4 °C, humidité : 100 %, temps de transfert : 6 s, force de transfert : 5 unités, temps d’attente : 10 s).
   REMARQUE : Le temps et la force du transfert sont des paramètres importants pour l’optimisation du dispositif de vitrification, car l’élimination de l’eau de la grille et l’exposition des particules à l’interface air-eau peuvent induire une dissociation ou un biais d’orientation.
4. Assemblez les composants du conteneur cryogénique, y compris la coupelle en laiton, le support de boîte grillagée, l’unité d’araignée et l’anneau anti-contamination, dans le plateau de base. Refroidissez l’ensemble du récipient en remplissant le plateau d’azote liquide. Remplissez la coupelle en laiton de cryogène (éthane liquide). Retirez l’unité araignée une fois que le cryogène atteint la température de fusion.
5. Montez la pince à épiler et la grille sur l’instrument, chargez l’échantillon (généralement 4 μL) sur le côté carbone de la grille et lancez le processus de congélation en plongée.
6. Retirez soigneusement la pince à épiler de l’instrument, placez la grille sur une boîte de grille de stockage et fermez la boîte avec le couvercle. Rangez la boîte grillagée contenant les échantillons vitrifiés dans de l’azote liquide.

7. Chargement des réseaux dans la GDT

1. Assemblez la station d’assemblage de l’autogrid et refroidissez-la avec de l’azote liquide.
2. Placez la boîte à grille contenant les grilles vitrifiées et dévissez soigneusement le couvercle pour accéder aux grilles. Placez une boîte de rangement autogrid vide à proximité pour faciliter le transfert des grilles assemblées.
3. Placez l’anneau de grille automatique dans l’espace de découpe désigné pour l’anneau au poste de montage. Déplacez avec précaution la grille vitrifiée de la boîte de grille et insérez-la dans l’anneau de grille automatique. Assurez-vous que la grille et l’anneau sont alignés.
4. Alignez le disque pour positionner l’ouverture du cercle sur le dessus de l’anneau de grille automatique et de l’ensemble de grille. Pour fixer la grille dans l’anneau de la grille automatique, placez l’outil d’insertion du clip C sur le dessus de la grille et appuyez doucement pour cliquer sur le clip C à l’intérieur.
5. Faites pivoter le disque vers l’arrière et déplacez les grilles assemblées dans la boîte de rangement de la grille automatique.
6. Assemblez la station de chargement de cassettes et refroidissez la station de chargement avec de l’azote liquide.
7. Placez la boîte de stockage autogrid dans la station de chargement. Déplacez l’ensemble de grille de la boîte de rangement de l’autogrid vers la cassette et tapotez doucement la grille pour assurer un bon placement.
8. Utilisez la poignée pour placer la cassette dans la capsule du chargeur automatique. Vérifiez la goupille du chargeur automatique pour confirmer sa liberté de mouvement et assurez-vous qu’elle n’est pas gelée.
9. Amarrez la capsule de l’autoloader au TEM pour l’observation du réseau.

Afin d’identifier les conditions de grille optimales pour MjsHSP16.5, un premier criblage cryo-EM a été effectué, se concentrant principalement sur l’examen de diverses conditions de tampon protéique : (1) le tampon de purification final, qui assure la stabilité et l’homogénéité de MjsHSP16.5 et est important pour sa cristallisation³⁰ ; (2) tampons adaptés aux conditions nécessaires à la croissance de cristaux MjsHSP16.5 de haute qualité de diffr...

Toutes les études structurales des protéines commencent par la purification des protéines, un processus itératif permettant d’atteindre un équilibre entre l’isolement des cibles protéiques de haute pureté et d’homogénéité tout en préservant leur fonctionnalité native. Même si les compositions tampons permettant de purifier et de préserver les échantillons de protéines sont soigneusement sélectionnées au cours du processus de purification, ces tampons posent souven...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous remercions le Cooperative Center for Research Facilities (CCRF) (Université Sungkyunkwan, Corée) de nous avoir généreusement accordé l’accès à leur installation de cryo-EM. Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) à K.K.K. (N° 2021M3A9I4022936). L’utilisation des installations de cryo-EM du consortium NEXUS a été soutenue par une subvention RS-2024-00440289 de la Fondation nationale de recherche de Corée.