优化低温电子显微镜的样品制备

该方案提出了一种以 Methanocaldococcus jannaschii （MjsHSP16.5） 为例，通过样品制备优化解决颗粒分布不均匀的问题，为研究人员使用低温电子显微镜 （cryo-EM） 有效阐明大分子结构提供参考。

低温电子显微镜 （cryo-EM） 通过在近天然条件下研究悬浮在玻璃体冰中的大分子结构，彻底改变了结构生物学。该技术允许在不需要结晶的情况下对蛋白质和其他生物分子进行高分辨率可视化，从而为了解它们的功能和机制提供重要见解。单颗粒分析的最新进展，加上改进的计算数据处理，使冷冻电镜成为现代结构生物学中不可或缺的工具。尽管冷冻电镜的采用率越来越高，但它仍面临着可能限制其有效性的持续挑战，尤其是颗粒分布不均匀。此问题通常会导致分辨率差和重建蛋白质结构的准确性降低。本文以 Methanocaldococcus jannaschii （MjsHSP16.5） 的小热休克蛋白为例，概述了一种简单实用的方法来应对这一挑战。该方法优化了样品制备，以最大限度地减少优先吸附，确保更均匀的颗粒分布和更高质量的蛋白质冷冻电镜结构。这项技术为旨在克服结构研究中类似挑战的研究人员提供了有价值的指导。

随着仪器硬件 ^1,2 和图像处理软件 ^3,4,5 的最新进展，低温电子显微镜（冷冻电镜）已成为现代结构生物学中一种流行且强大的工具。尽管取得了这些突破，但在使用冷冻电镜实现高分辨率大分子结构方面仍然存在瓶颈。其中一个重大挑战是不均匀的粒子分布，包括取向偏好现象，这主要在气-水界面处观察到 6,7,8,9。

在样品玻璃化过程中，一些分子表现出沿网格上的特定轴排列的趋势。这会导致最终数据集中粒子视图的分布不均匀。某些取向可能代表性过高，而其他取向代表性不足或完全不存在，导致总蛋白质结构的采样不完整。优先朝向电子束的蛋白质区域在密度图中显得更加突出，而远离电子束的区域可能分辨率差或完全缺失^10,11。因此，不均匀的粒子分布会在最终重建的三维 （3D） 结构中引入潜在的偏差和伪影。值得注意的是，α 螺旋和 β 折叠等关键结构元件可能变得歪斜，氨基酸或核苷酸链可能出现片段化，特定蛋白质或核酸片段的密度可能出现扭曲¹²。最终，这些虚假陈述对准确解开生物分子的结构和功能构成了重大挑战。

目前使用各种实验方法来克服这些挑战，包括样品制备优化 13,14,15，^网格处理 16,17,18,19,20,21,22 和数据收集策略 ²³。值得注意的是，建议在可行的情况下在样品制备阶段解决这一挑战⁷.样品制备中的常见优化包括修改缓冲液组成、引入小分子或大分子结合伴侣、生成分子内交联和改变去污剂。膜蛋白^24,25 也是如此，尽管去污剂必须专门用于纯化和稳定目的。其中，蛋白质缓冲液优化的可定制性、成本效益和广泛的可及性使其成为大多数实验室的首选策略。这种方法允许精确和即时地调整各种参数，以满足每个蛋白质样品的特定要求。通过迭代优化，研究人员可以系统地测试不同的缓冲条件并调整各种参数，以最大限度地减少首选方向并提高冷冻电镜数据的整体质量。简单地改变蛋白质缓冲液成分并调整其浓度已被证明可以通过调节表面电荷来影响蛋白质稳定性，从而影响玻璃体内的蛋白质行为²⁵。因此，优化蛋白质缓冲液组成被认为是解决冷冻电镜中常见挑战的最方便、最直接的方法之一。

在这里，提出了一种方案来解决冷冻电镜中的一个常见障碍——克服不均匀的颗粒分布。在该方案中，使用来自Methanocaldococcus jannaschii（MjsHSP16.5）²⁶的小热休克蛋白作为案例研究（图1），概述了蛋白质制备和缓冲液筛选的关键程序，并辅以网格制备（图1）。这种 sHSP 天然稳定，每个单体的分子量为 16.5 kDa，并组装成一个 24 聚体八面体笼^26,27，使其成为冷冻电镜结构分析的有吸引力的候选者。然而，在冷冻电镜数据收集过程中观察到颗粒分布不均匀是意料之中的，这在实验过程中成为一个重大挑战。此外，还讨论了有利于研究人员应对类似挑战的潜在方法，从而有助于使用冷冻电镜有效阐明大分子结构。

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 蛋白质纯化

1. 在 大肠 杆菌 BL21 （DE3） 中诱导重组 MjsHSP16.5 的表达，并使用镍螯合色谱柱纯化蛋白质，如前所述²⁶。在体积排阻色谱 （SEC） 色谱柱²⁶ 上纯化后，通过将 5 μL 峰级分加载到 12.5% SDS-PAGE 凝胶上并通过标准考马斯蓝染色²⁸ 进行可视化来检查蛋白质纯度（图 2）。
2. 根据制造商的说明，使用截留分子量为 50 kDa 的离心过滤器，在 4 °C 下将含有 MjsHSP16.5 的池级分浓缩至约 65 mg/mL（参见 材料表）。
   注：离心过程中每 5 分钟轻轻移液一次蛋白质溶液，以防止蛋白质聚集。
3. 浓缩后，将样品在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟以去除聚集体，将上清液分装成 50 μL 体积的 0.2 mL 薄壁 PCR 管中，在液氮中快速冷冻试管，并将样品储存在 -80 °C 直至进一步使用。

2. 用于透射电子显微镜 （TEM） 成像的蛋白质制备

1. 在冰上解冻两根冷冻蛋白管。解冻后，轻轻弹动试管数次以轻轻混合溶液以确保均匀性，并在 4 °C 下以 16,000 × g 离心蛋白质溶液 10 分钟以去除聚集体。
2. 将上清液注入 SEC 色谱柱上，收集 0.5 mL 洗脱馏分。
3. 收集与在 280 nm 处表现出最高 UV 吸光度的峰相对应的洗脱级分，并使用 Bradford 测定法²⁹ 测量这些级分中的蛋白质浓度。
   注：为确保下游应用在单个峰馏分中具有足够的蛋白质浓度，必须将大量蛋白质样品上样到 SEC 色谱柱上，同时保持在色谱柱的推荐容量范围内。

3. 缓冲液更换

1. 准备所需的缓冲溶液（9 mM MOPS-Tris （pH 7.2）、50 mM NaCl 和 0.1 mM EDTA），将缓冲液分装到 50 mL 烧杯中，并将缓冲烧杯保持在 4 °C。
   注：根据目标蛋白生物化学的先验知识，制备各种具有不同成分（缓冲液类型、pH 值和离子强度）的缓冲溶液，例如 20 mM 的 HEPES （pH 7.5）、100 mM 的 NaCl 和 0-5 mM 的 DTT，以确定在下游网格制备中促进最佳蛋白质溶解度、均一性和稳定性的条件。
2. 按照制造商的说明准备透析膜（参见 材料表）。
3. 用剪刀将透析膜剪成 30 mm x 30 mm 的小块。通过在蒸馏水或缓冲溶液中孵育来平衡这些膜（图 3A）。
4. 将 55 μL 蛋白质溶液（约 2.5 mg/mL）添加到 50 μL 微量透析按钮的腔室中（图 3B）。
5. 使用镊子垂直握住透析膜，轻轻地将膜的一侧边缘与薄纸接触以排出多余的液体（图 3C）。小心地用膜盖住微量透析按钮，确保没有气泡进入微量透析室（图 3D）。将 O 形圈放在透析膜的顶部。轻轻地将 O 形圈滚动到按钮边缘的凹槽中。
6. 替代方法：将 O 形圈沿高尔夫球座的轴线放置，并将高尔夫球座倒置在膜上（图 3E）。轻轻地将 O 形圈滑下高尔夫球座，直到它滑落到按钮的边缘上（图 3F）。小心地将 O 形圈引导到按钮边缘的凹槽中（图 3G）。
7. 将每个透析按钮浸入含有目标缓冲液的单独烧杯中，膜面朝上（图 3H）。
8. 在透析过程中将烧杯保持在 4 °C。2 小时后更换透析缓冲液并继续透析过夜。
9. 使用带有细针的注射器（例如，汉密尔顿注射器或胰岛素注射器）小心地打孔膜并从微透析室中回收蛋白质溶液（图 3I）。将蛋白质样品储存在冰上的微量离心管中，直到进一步使用。使用 Bradford 测定法²⁹ 测量蛋白质浓度。

4. 网格准备

1. 选择适当的网格类型。
   注意：铜支架上的无定形孔碳膜是常用的。应根据所需的冰厚度选择碳膜厚度、孔径和网格数。Holey 碳涂层网格用于 MjsHSP16.5 的样品制备。
2. 用镊子轻轻抓住网格的边缘，以免损坏网格孔。将网格放置在网格支架上，碳面朝上。将网格支架放入辉光放电系统的腔室中。
3. 在 15 mA 下进行 60 秒的辉光放电，以使网格具有亲水性。在此过程中，建议施加负电荷。
   注意：推荐参数可作为本研究中使用的辉光放电系统的起点。根据辉光放电仪器的类型，可能需要进行优化，以达到特定网格材料所需的亲水性水平。对于等离子体清洁，请考虑测试替代气体或气体混合物，例如氢气或氩氧混合物。
4. 可选步骤：将额外的化学溶液（例如打开的玻璃瓶中的 99% 戊胺）引入与网格支架相邻的腔室中，以专门在网格上产生净正电荷。
5. 在 0.5-1 小时内使用放电的网格以确保最佳性能。

5. 负染色网格制备

1. 将 5 μL 样品（50-300 nM 或 20-120 ng/mL）上样到辉光放电网格上。让样品在网格表面上不受干扰地放置 1 分钟，以促进蛋白质的沉淀。
2. 在石蜡薄膜片上准备三滴 50 μL 的水滴。通过将网格表面摩擦第一个水滴的表面，轻轻清洗网格上的样品。用剩余的两个水滴重复洗涤步骤。
   注意：洗涤时间可以根据每个实验的具体要求进行优化。
3. 将 5 μL 过滤后的 1% （w/v） 乙酸铀酰溶液加载到网格上，并立即移出乙酸铀酰溶液。
4. 将另外 5 μL 的 1% （w/v） 乙酸铀酰溶液加载到网格上。让网格在乙酸铀酰溶液中孵育 90 秒以进行染色。
   注：染色时间可根据特定样品进行调整和优化。
5. 用滤纸轻轻接触网格的镊子侧，以去除多余的染色液。让网格在室温下完全风干。将干燥的网格在室温下储存在网格容器中，直至观察。

6. 样品玻璃化

1. 将蛋白质样品稀释至所需浓度。
   注：蛋白质浓度应足够高，以使每个孔中的颗粒数量最大化，但又应足够低，以确保单个颗粒的分布。冷冻电镜蛋白浓度通常为 0.5 至 2 mg/mL。然而，某些蛋白质，根据其分子量和特定的样品制备条件，可能需要超出此范围的浓度。
2. 将样品在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟以去除任何聚集体。
3. 打开切入式冷冻仪器。用蒸馏水填充加湿器储液罐。将带环的滤纸安装在印迹垫上。设置玻璃化参数（温度：4 °C，湿度：100%，印迹时间：6 秒，印迹力：5 个单位，等待时间：10 秒）。
   注：印迹时间和印迹力是玻璃化装置优化的重要参数，因为从网格中去除水分和颗粒暴露于空气-水界面会引起解离或方向偏倚。
4. 将制冷剂容器组件（包括黄铜杯、网格盒支架、蜘蛛网装置和防污染环）组装到底座托盘中。用液氮填充托盘来冷却容器组件。用 Cryogen（液态乙烷）填充黄铜杯。一旦制冷剂达到熔化温度，就取下蜘蛛单元。
5. 将镊子和网格组件安装到仪器上，将样品（通常为 4 μL）加载到网格的碳侧，然后开始切入冷冻过程。
6. 小心地从仪器上拔下镊子，将网格放在存储网格盒上，并用盖子密封盒子。将包含玻璃化样品的网格盒储存在液氮中。

7. 将网格加载到 TEM

1. 组装 autogrid 组装站并用液氮冷却。
2. 放置装有玻璃化网格的网格盒，小心拧开盖子以接触网格。在附近放置一个空的 autogrid 存储盒，以便于转移组装好的网格。
3. 将自动网格环放在装配站为环指定的切口空间中。小心地将玻璃化网格从网格盒中移出，并将其放入自动网格环中。确保网格和环对齐。
4. 对齐光盘，将圆开口定位在 autogrid 环和网格组件的顶部。要将网格固定到自动网格环中，请将 C 形夹插入工具放在网格顶部，然后轻轻按下以单击内部的 C 形夹。
5. 将圆盘向后旋转，将组装好的网格移动到 autogrid 存储盒中。
6. 组装装样盒站，并用液氮冷却装样站。
7. 将 autogrid 存储箱放入装载站。将网格组件从 autogrid 存储盒移动到盒中，然后轻轻敲击网格以确保正确放置。
8. 使用手柄将盒放入自动加载机胶囊中。检查自动加载机中的销钉以确认其自由移动并确保它没有冻结。
9. 将自动进样器胶囊对接到 TEM 以进行网格观察。

为了确定 MjsHSP16.5 的最佳网格条件，进行了初步冷冻电镜筛选，主要侧重于检查各种蛋白质缓冲液条件：（1） 最终纯化缓冲液，确保 MjsHSP16.5 的稳定性和均一性，对其结晶很重要³⁰;（2） 适应于高衍射质量 MjsHSP16.5 晶体生长所需条件的缓冲液³⁰;（3） 以前用于 MjsHSP16.5 电子显微镜 （EM） 研究的缓冲液^31,32

所有蛋白质结构研究都从蛋白质纯化开始，这是一个迭代过程，旨在实现在分离高纯度和均一性蛋白质靶标的同时保留其天然功能之间的平衡。尽管在纯化过程中精心挑选了用于纯化和保存蛋白质样品的缓冲液成分，但这些缓冲液在随后的冷冻电镜样品制备和成像过程中经常会带来挑战⁶。这个问题是由于缓冲液组分与最佳冷冻电镜分析的先决条件不匹?...

作者没有什么可披露的。

我们感谢研究设施合作中心 （CCRF）（韩国成均馆大学）慷慨地允许我们使用他们的冷冻电镜设施。这项工作得到了韩国政府 （MSIT） 资助给 KKK 的韩国国家研究基金会 （NRF） 赠款（编号 2021M3A9I4022936）的支持。NEXUS 联盟的冷冻电镜设施的使用得到了韩国国家研究基金会拨款 RS-2024-00440289 的支持。