Optimización de la preparación de muestras para microscopía electrónica criogénica

Este protocolo presenta un método práctico que utiliza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como ejemplo para abordar la distribución desigual de partículas a través de la optimización de la preparación de muestras, proporcionando una referencia para que los investigadores diluciden de manera eficiente estructuras macromoleculares utilizando microscopía electrónica criogénica (crio-EM).

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) ha revolucionado la biología estructural al permitir el estudio de estructuras macromoleculares en condiciones casi nativas, suspendidas en hielo vítreo. Esta técnica permite la visualización de alta resolución de proteínas y otras biomoléculas sin necesidad de cristalización, lo que ofrece información significativa sobre su función y mecanismo. Los avances recientes en el análisis de una sola partícula, junto con un mejor procesamiento de datos computacionales, han hecho de la crio-EM una herramienta indispensable en la biología estructural moderna. A pesar de su creciente adopción, la crio-EM se enfrenta a desafíos persistentes que pueden limitar su efectividad, en particular la distribución desigual de las partículas. Este problema a menudo conduce a una resolución deficiente y una precisión reducida en las estructuras de proteínas reconstruidas. Este artículo describe un enfoque simple y práctico para abordar este desafío, utilizando la pequeña proteína de choque térmico de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como ejemplo. El método optimiza la preparación de la muestra para minimizar la adsorción preferencial, lo que garantiza una distribución más homogénea de las partículas y estructuras crio-EM de proteínas de mayor calidad. Esta técnica ofrece una valiosa orientación para los investigadores que buscan superar desafíos similares en los estudios estructurales.

Con los recientes avances tanto en el hardware de instrumentos ^1,2 como en el software de procesamiento de imágenes ^3,4,5, la microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se ha convertido en una herramienta popular y poderosa en la biología estructural moderna. A pesar de estos avances, persisten cuellos de botella en el logro de estructuras macromoleculares de alta resolución mediante el uso de crio-EM. Uno de estos desafíos significativos es la distribución desigual de las partículas, incluido el fenómeno de preferencia de orientación, que se observa predominantemente en la interfaz aire-agua 6,7,8,9.

Durante la vitrificación de muestras, algunas moléculas muestran una tendencia a alinearse a lo largo de ejes específicos de la rejilla. Esto conduce a una distribución desigual de las vistas de partículas en el conjunto de datos final. Ciertas orientaciones pueden estar sobrerrepresentadas, mientras que otras están infrarrepresentadas o completamente ausentes, lo que da lugar a un muestreo incompleto de la arquitectura total de la proteína. Las regiones de la proteína que están orientadas preferentemente hacia el haz de electrones aparecerán más prominentes en el mapa de densidad, mientras que las regiones orientadas lejos del haz pueden estar mal resueltas o faltar por completo^10,11. En consecuencia, la distribución desigual de las partículas introduce posibles sesgos y artefactos en la estructura tridimensional (3D) final reconstruida. En particular, los elementos estructurales clave, como las hélices alfa y las láminas beta, pueden estar sesgados, las cadenas de aminoácidos o nucleótidos pueden aparecer fragmentadas y las densidades de segmentos específicos de proteínas o ácidos nucleicos pueden exhibir distorsión¹². En última instancia, estas tergiversaciones plantean un gran desafío para desentrañar con precisión la estructura y la función de las moléculas biológicas.

Actualmente se utilizan varios enfoques experimentales para superar estos desafíos, incluida la optimización de la preparación de muestras 13,14,15, el tratamiento de la red 16,17,18,19,20,21,22 y la estrategia de recopilación de datos²³. En particular, se recomienda abordar el desafío en la etapa de preparación de la muestra siempre que sea posible⁷. Las optimizaciones comunes en la preparación de muestras incluyen la modificación de la composición del tampón, la introducción de socios de unión de moléculas pequeñas o macromoleculares, la generación de enlaces cruzados intramoleculares y la variación de detergentes. Esto también es cierto para las proteínas de membrana^24,25, aunque los detergentes deben usarse específicamente con fines de purificación y estabilización. Entre ellas, la personalización, la rentabilidad y la amplia accesibilidad de la optimización del tampón proteico la convierten en la estrategia preferida en la mayoría de los laboratorios. Este enfoque permite ajustes precisos e inmediatos de los diversos parámetros para que coincidan con los requisitos específicos de cada muestra de proteína. A través del refinamiento iterativo, los investigadores pueden probar sistemáticamente diversas condiciones de amortiguación y ajustar varios parámetros destinados a minimizar las orientaciones preferidas y mejorar la calidad general de los datos crio-EM. El simple hecho de variar los componentes del tampón proteico y ajustar sus concentraciones ha demostrado su eficacia para influir en la estabilidad de la proteína mediante la modulación de la carga superficial, lo que repercute en el comportamiento de la proteína dentro del hielo vítreo²⁵. Por lo tanto, la optimización de la composición del tampón de proteínas se considera uno de los enfoques más convenientes y sencillos para abordar los desafíos comunes en la crio-EM.

Aquí, se sugiere un protocolo para abordar un obstáculo común en la crio-EM: superar la distribución desigual de partículas. En este protocolo, se describen los procedimientos clave para la preparación de proteínas y el cribado de tampones, complementados con la preparación de la cuadrícula, utilizando una pequeña proteína de choque térmico de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)²⁶ como estudio de caso (Figura 1). Este sHSP es nativamente estable, tiene una masa molecular de 16,5 kDa por monómero y se ensambla en una jaula octaédrica de 24 meros ^26,27, lo que lo convierte en un candidato atractivo para el análisis estructural por crio-EM. Sin embargo, no se anticipó la observación de una distribución desigual de partículas durante la recopilación de datos crio-EM, y surgió como un desafío significativo durante los experimentos. Además, se discuten los posibles enfoques beneficiosos para los investigadores que abordan desafíos similares, facilitando así la elucidación eficiente de estructuras macromoleculares utilizando crio-EM.

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Purificación de proteínas

1. Inducir la expresión de MjsHSP16.5 recombinante en E. coli BL21(DE3) y purificar la proteína utilizando una columna de cromatografía quelante de níquel como se describió anteriormente²⁶. Después de la purificación en una columna²⁶ de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), examine la pureza de la proteína cargando 5 μL de fracciones pico en un gel SDS-PAGE al 12,5% y visualizando mediante una tinción estándar con azul de Coomassie²⁸ (Figura 2).
2. Concentrar las fracciones de la piscina que contengan MjsHSP16.5 a 4 °C a aproximadamente 65 mg/mL utilizando filtros centrífugos con un límite de peso molecular de 50 kDa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Pipetear suavemente la solución de proteínas cada 5 minutos durante la centrifugación para evitar la agregación de proteínas.
3. Después de la concentración, centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los agregados, alícuota del sobrenadante en volúmenes de 50 μL en tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mL, congelar rápidamente los tubos en nitrógeno líquido y almacenar las muestras a -80 °C hasta su uso posterior.

2. Preparación de proteínas para imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)

1. Descongele dos tubos de proteína congelados con hielo. Una vez descongelada, mezcle suavemente la solución agitando el tubo varias veces para garantizar la homogeneidad y centrifugue la solución proteica a 16.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los agregados.
2. Inyecte el sobrenadante en una columna SEC y recoja fracciones de elución de 0,5 mL.
3. Recoja las fracciones de elución correspondientes al pico que exhibe la absorbancia UV más alta a 280 nm y mida la concentración de proteínas en estas fracciones utilizando el ensayo de Bradford²⁹.
   NOTA: Para garantizar una concentración suficiente de proteína en una sola fracción máxima para las aplicaciones posteriores, es necesario cargar una gran cantidad de muestra de proteína en la columna SEC mientras se mantiene dentro de la capacidad recomendada de la columna.

3. Intercambio de tampón

1. Prepare la solución tampón deseada (9 mM de MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM de NaCl y 0,1 mM de EDTA), alícuota de los tampones en vasos de precipitados de 50 mL y mantenga los vasos tampón a 4 °C.
   NOTA: Sobre la base del conocimiento previo de la bioquímica de la proteína objetivo, prepare una variedad de soluciones tampón con diferentes composiciones (tipos de tampón, pH y fuerza iónica), como 20 mM de HEPES (pH 7,5), 100 mM de NaCl y 0-5 mM de DTT, para identificar las condiciones que promueven la solubilidad, homogeneidad y estabilidad óptimas de la proteína en la preparación de la red posterior.
2. Prepare la membrana de diálisis siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
3. Corte la membrana de diálisis en trozos de 30 mm x 30 mm con unas tijeras. Equilibre estas membranas incubándolas en agua destilada o soluciones tampón (Figura 3A).
4. Añadir 55 μL de la solución proteica (aproximadamente 2,5 mg/mL) a la cámara de botones de microdiálisis de 50 μL (Figura 3B).
5. Sostenga la membrana de diálisis verticalmente con pinzas y toque suavemente un borde de la membrana contra el papel de seda para drenar el exceso de líquido (Figura 3C). Cubra cuidadosamente el botón de microdiálisis con la membrana, asegurándose de que no se introduzcan burbujas de aire en la cámara de microdiálisis (Figura 3D). Coloque la junta tórica en la parte superior de la membrana de diálisis. Enrolle suavemente la junta tórica en la ranura del borde del botón.
6. Método alternativo: Coloque la junta tórica a lo largo del eje de un tee de golf y coloque el tee de golf boca abajo en la membrana (Figura 3E). Deslice suavemente la junta tórica por el tee de golf hasta que se deslice hacia el borde del botón (Figura 3F). Guíe con cuidado la junta tórica en la ranura en el borde del botón (Figura 3G).
7. Sumerja cada botón de diálisis en un vaso de precipitados separado que contenga el tampón de destino con el lado de la membrana hacia arriba (Figura 3H).
8. Mantenga los vasos de precipitados a 4 °C durante el proceso de diálisis. Cambie el tampón de diálisis después de 2 h y continúe la diálisis durante la noche.
9. Utilice una jeringa con una aguja fina (p. ej., jeringa Hamilton o jeringa de insulina) para perforar cuidadosamente la membrana y recuperar la solución proteica de la cámara de microdiálisis (Figura 3I). Guarde la muestra de proteína en un tubo de microcentrífuga sobre hielo hasta su uso posterior. Mida la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford²⁹.

4. Preparación de la red

1. Elija el tipo de cuadrícula adecuado.
   NOTA: Se usa comúnmente una película de carbono amorfa y agujereada sobre un soporte de cobre. El espesor de la película de carbono, el tamaño del orificio y el número de malla deben elegirse en función del espesor de hielo deseado. Se utilizaron rejillas recubiertas de carbono Holey para la preparación de muestras de MjsHSP16.5.
2. Sujete las rejillas suavemente por los bordes con unas pinzas para evitar dañar los orificios de la rejilla. Coloque las rejillas en un soporte de rejilla con el lado de carbono hacia arriba. Coloque el soporte de rejilla en la cámara del sistema de descarga incandescente.
3. Realice una descarga incandescente durante 60 s a 15 mA para hacer que la red sea hidrófila. Se recomienda aplicar una carga negativa durante este proceso.
   NOTA: Los parámetros recomendados sirven como punto de partida para el sistema de descarga incandescente utilizado en este estudio. La optimización puede ser necesaria dependiendo del tipo de instrumento de descarga incandescente y para lograr el nivel deseado de hidrofilicidad para materiales de red específicos. Para la limpieza con plasma, considere probar gases alternativos o mezclas de gases, como hidrógeno o mezclas de argón y oxígeno.
4. Paso opcional: introducir soluciones químicas adicionales, como amilamina al 99% en una botella de vidrio abierta, en una cámara adyacente al soporte de la rejilla para producir específicamente una carga neta positiva en la rejilla.
5. Utilice las rejillas descargadas en un plazo de 0,5-1 h para garantizar un rendimiento óptimo.

5. Preparación de la rejilla de tinción negativa

1. Cargue 5 μL de la muestra (50-300 nM o 20-120 ng/mL) en la rejilla de descarga incandescente. Deje que la muestra descanse inalterada en la superficie de la rejilla durante 1 minuto para facilitar la sedimentación de las proteínas.
2. Prepare tres gotas de agua de 50 μL cada una en una hoja de película de parafina. Lave suavemente la muestra en la rejilla frotando la superficie de la rejilla contra la superficie de la primera gota de agua. Repita el paso de lavado con las dos gotas de agua restantes.
   NOTA: Los tiempos de lavado pueden optimizarse de acuerdo con los requisitos específicos de cada experimento.
3. Cargue 5 μL de la solución filtrada de acetato de uranilo al 1% (p/v) en la rejilla e inmediatamente pipetee la solución de acetato de uranilo.
4. Cargue otros 5 μL de la solución de acetato de uranilo al 1% (p/v) en la rejilla. Deje que la rejilla se incube en la solución de acetato de uranilo durante 90 s para la tinción.
   NOTA: El tiempo de tinción se puede ajustar y optimizar de acuerdo con muestras específicas.
5. Toque suavemente el lado de la pinza de la rejilla con papel de filtro para eliminar el exceso de solución de tinción. Deje que la rejilla se seque completamente al aire a temperatura ambiente. Guarde la rejilla seca en un recipiente de rejilla a temperatura ambiente hasta su observación.

6. Vitrificación de muestras

1. Diluya la muestra de proteína hasta la concentración deseada.
   NOTA: La concentración de proteína debe ser lo suficientemente alta como para maximizar el número de partículas en cada orificio, pero lo suficientemente baja para garantizar la distribución de partículas individuales. Las concentraciones de proteínas crio-EM suelen oscilar entre 0,5 y 2 mg/mL. Sin embargo, ciertas proteínas, dependiendo de su peso molecular y de las condiciones específicas de preparación de la muestra, pueden requerir concentraciones fuera de este rango.
2. Centrifugar la muestra a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los agregados.
3. Encienda el instrumento de congelación por inmersión. Llene el depósito del humidificador con agua destilada. Monte los papeles de filtro con anillos en las almohadillas de secado. Ajuste los parámetros para la vitrificación (temperatura: 4 °C, humedad: 100%, tiempo de secado: 6 s, fuerza de secado: 5 unidades, tiempo de espera: 10 s).
   NOTA: El tiempo y la fuerza de transferencia son parámetros importantes para la optimización del dispositivo de vitrificación, ya que la eliminación de agua de la rejilla y la exposición de partículas a la interfaz aire-agua pueden inducir disociación o sesgo de orientación.
4. Ensamble los componentes del contenedor criogénico, incluida la copa de latón, el soporte de la caja de rejilla, la unidad de araña y el anillo anticontaminación, en la bandeja base. Enfríe el conjunto del recipiente llenando la bandeja con nitrógeno líquido. Llene la taza de latón con criógeno (etano líquido). Retire la unidad de araña una vez que el criógeno alcance la temperatura de fusión.
5. Monte las pinzas y el conjunto de la rejilla en el instrumento, cargue la muestra (normalmente 4 μL) en el lado de carbono de la rejilla e inicie el proceso de congelación por inmersión.
6. Desacople con cuidado las pinzas del instrumento, coloque la rejilla en una caja de rejilla de almacenamiento y selle la caja con la tapa. Guarde la caja de rejilla que contiene las muestras vitrificadas en nitrógeno líquido.

7. Cargando las rejillas en TEM

1. Ensamble la estación de ensamblaje de autogrid y enfríela con nitrógeno líquido.
2. Coloque la caja de rejilla que contiene rejillas vitrificadas y desenrosque la tapa con cuidado para acceder a las rejillas. Coloque una caja de almacenamiento de autogrid vacía cerca para facilitar la transferencia de las rejillas ensambladas.
3. Coloque el anillo de rejilla automática en el espacio de recorte designado para el anillo en la estación de montaje. Mueva con cuidado la rejilla vitrificada de la caja de rejilla y colóquela dentro del anillo de rejilla automática. Asegúrese de que la rejilla y el anillo estén alineados.
4. Alinee el disco para colocar la abertura del círculo en la parte superior del anillo de rejilla automática y el ensamblaje de rejilla. Para fijar la rejilla en el anillo de rejilla automática, coloque la herramienta de inserción de clip en C en la parte superior de la rejilla y presione suavemente hacia abajo para hacer clic en el clip en C en el interior.
5. Gire el disco hacia atrás y mueva las rejillas ensambladas a la caja de almacenamiento de autogrid.
6. Ensamble la estación de carga de casetes y enfríe la estación de carga con nitrógeno líquido.
7. Coloque la caja de almacenamiento autogrid en la estación de carga. Mueva el conjunto de rejilla de la caja de almacenamiento autogrid al casete y golpee suavemente la rejilla para garantizar una colocación adecuada.
8. Utilice el asa para colocar el casete en la cápsula del cargador automático. Verifique el pin en el cargador automático para confirmar su libre movimiento y asegurarse de que no esté congelado.
9. Acople la cápsula del cargador automático al TEM para la observación de la cuadrícula.

Para identificar las condiciones óptimas de la red para MjsHSP16.5, se llevó a cabo un cribado inicial de crio-EM, centrándose principalmente en el examen de varias condiciones del tampón de proteínas: (1) el tampón de purificación final, que garantiza la estabilidad y homogeneidad de MjsHSP16.5 y es importante para su cristalización³⁰; (2) tampones adaptados de las condiciones necesarias para el crecimiento de cristales MjsHSP16.5 de alta calidad de difra...

Todos los estudios estructurales de proteínas comienzan con la purificación de proteínas, un proceso iterativo para lograr un equilibrio entre el aislamiento de objetivos proteicos con alta pureza y homogeneidad, al tiempo que se preserva su funcionalidad nativa. A pesar de que las composiciones de tampones para purificar y preservar las muestras de proteínas se seleccionan cuidadosamente durante el proceso de purificación, estos tampones suelen plantear desafíos durante la posteri...

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos al Centro Cooperativo de Instalaciones de Investigación (CCRF) (Universidad de Sungkyunkwan, Corea) por concedernos generosamente el acceso a sus instalaciones de crio-EM. Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) a K.K.K. (No. 2021M3A9I4022936). El uso de las instalaciones crio-EM del consorcio NEXUS fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea RS-2024-00440289.