Nous étudions les interactions entre les récepteurs tyrosine kinases et la membrane plasmique des mammifères. Nous voulons savoir comment les radeaux lipidiques et l’asymétrie lipidique déterminent la localisation, l’activation et la signalisation des récepteurs. Il est difficile d’étudier directement les radeaux lipidiques car ils sont petits, dynamiques et sensibles aux conditions de température.
Les chercheurs doivent souvent utiliser des systèmes modèles avec de grands domaines d’ordre pour étudier les interactions. Les vésicules synthétiques et les vésicules à membrane plasmique sont des représentations imparfaites des membranes cellulaires dépourvues d’asymétrie lipidique et d’organites. En travaillant avec des cellules vivantes, nous obtenons une représentation précise de la membrane plasmique.
Ils mettent en évidence l’initiation de la signalisation des récepteurs dans le contexte de cellules vivantes. Cela donne un aperçu de l’effet des environnements membranaires sur les récepteurs et leurs voies de signalisation en aval. Pour commencer, aliquote le stock lipidique dans un tube en borosilicate à l’aide d’une pipette à déplacement positif avec une pointe en verre.
Placez le tube en borosilicate sur un bloc chauffant réglé à environ 50 degrés Celsius et appliquez un courant d’azote gazeux dans le tube jusqu’à ce que tout le chloroforme apparent s’évapore. Transférez le tube dans une chambre à vide et exposez-le à un vide poussé pendant une heure pour éliminer tout solvant restant. Ajoutez ensuite le milieu F-12 de Ham sans sérum au film lipidique séché pour atteindre une concentration finale de 20 millimolaires.
Couvrez le tube avec un couvercle ou du ruban adhésif en téflon et chauffez-le dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, vortex la solution pour suspendre les lipides et former des vésicules multilamellaires ou MLV. Une fois que le support devient trouble, transférez tout le volume dans un micro-tube à centrifuger et stockez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à trois jours.
Mélangez les MLV préparés avec de la méthylalpha-cyclodextrine jusqu’à une concentration finale de 40 millimolaires. Incuber le mélange lipidique pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius ou 55 degrés Celsius. Observez le milieu passer du trouble au clair.
Ensuite, laissez le milieu d’échange de lipides refroidir à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Obtenez des cellules réceptrices de l’insuline ovarienne de hamster chinois cultivées à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans du DMEM supplémenté contenant 4,5 grammes par litre de glucose. Ensemencez 1,5 fois 10 à la puissance six cellules dans des plaques de 60 millimètres et incubez-les pour obtenir 80 à 90 % de confluence.
Ensuite, lavez les cellules trois fois avec un millilitre de PBS. Affamez les cellules pendant la nuit dans deux millilitres de milieu F-12 de Ham sans sérum. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, ajoutez un millilitre du milieu d’échange préparé.
Incuber les cellules pendant une heure à température ambiante, en les remuant toutes les 15 minutes pour assurer une exposition uniforme au milieu d’échange. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec un millilitre de PBS. Retirez complètement le PBS de la plaque de culture cellulaire et réglez la plaque à un angle de 45 degrés pendant 10 minutes ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche.
Après avoir retiré le tampon résiduel, ajoutez un millilitre d’une solution d’hexane isopropanol aux cellules séchées et incubez pendant 10 minutes sur un agitateur à température ambiante. Transférez maintenant la solution dans un tube en borosilicate. Après avoir couvert le tube, rangez-le à moins 20 degrés Celsius.
Ensuite, dissolvez les débris cellulaires restants à l’aide de 500 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal. Agitez le récipient pendant 10 minutes à température ambiante pour assurer une dissolution complète. Pour vérifier l’efficacité de l’échange, versez 100 millilitres d’une solution d’hydroxyde d’ammonium à 30 % de méthanol de chloroforme dans un réservoir de chromatographie sur couche mince de verre.
Couvrez hermétiquement le réservoir et laissez la vapeur s’équilibrer pendant au moins une heure. Sécher l’échantillon d’extrait lipidique sur un bloc chauffant à basse température sous un courant d’azote gazeux jusqu’à ce que le solvant organique s’évapore. Ensuite, dissolvez le film lipidique dans 50 microlitres d’une solution individuelle de chloroforme et de méthanol.
À l’aide d’une seringue Hamilton de 10 microlitres, chargez un à 10 microlitres de l’échantillon sur une plaque CCM haute performance en silice. Appliquez l’échantillon en bandes d’un centimètre en chargeant un maximum de 10 bandes par plaque de 20 centimètres. Placez la plaque TLC à la verticale dans le réservoir TLC et laissez le front du solvant se déplacer de huit centimètres pour séparer les espèces de phospholipides.
Ensuite, laissez sécher la plaque pendant 10 minutes et vaporisez-la d’une solution aqueuse de 3 % d’acétate cuivrique et de 8 % d’acide phosphorique. Laissez sécher à nouveau la plaque pendant 30 minutes à température ambiante ou avec un pistolet thermique. La plaque doit passer du bleu translucide au blanc opaque.
Ensuite, faites griller la plaque dans un four tempéré à 180 à 200 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes, ou jusqu’à ce que des bandes lipidiques noires deviennent visibles. Incuber les cellules traitées avec 500 microlitres d’insuline 100 nanomolaires dans un milieu exempt de sérum pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules avec du PBS glacé, placez-les sur de la glace pour arrêter la stimulation.
Ajoutez ensuite un millilitre de PBS glacé et récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire. Granulez les cellules à 3000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de tampon de lyse RIPA complet à la pastille cellulaire et remettez en suspension 30 à 40 fois pour lyser les cellules.
Après avoir incubé le lysat sur de la glace pendant 10 minutes, centrifugez-le à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour séparer les débris. Recueillir le surnageant dans un tube frais. Après avoir déterminé la concentration en protéines, mélangez le lysat avec cinq fois le tampon laemmli et chauffez-le à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Chargez des quantités égales de protéines par échantillon sur un gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium pour l’électrophorèse. Faites fonctionner le gel à 100 à 150 volts dans un tampon jusqu’à ce que les protéines soient bien résolues entre 100 et 250 kilodaltons. Ensuite, transférez les protéines résolues sur une membrane de fluorure de polyvinylidène à l’aide d’un tampon de transfert et colorez la membrane avec les anticorps appropriés.
L’échange de lipides dans les cellules IR de l’ovaire du hamster chinois a entraîné une augmentation de l’intensité de la bande de sphingomyéline et une diminution de l’intensité de la bande de phosphatidylcholine lors de l’échange de sphingomyéline dans le cerveau. À l’inverse, lors de l’échange de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ou DOPC, l’intensité de la bande phosphatidylcholine augmentait, tandis que l’intensité de la bande de sphingomyéline diminuait. Les cellules échangées avec le DOPC ont montré une diminution de l’autophosphorylation IR insulino-dépendante.
En revanche, les cellules échangées par la sphingomyéline cérébrale ont maintenu ou modérément augmenté la phosphorylation des IR. Les niveaux de phosphorylation normalisés ont été déterminés en divisant l’intensité de l’IR pYpY par l’intensité bêta de l’IR à partir des données du western blot.
