우리는 수용체 티로신 키나아제와 포유류 원형질막 사이의 상호 작용을 연구합니다. 우리는 지질 뗏목과 지질 비대칭이 어떻게 수용체 국소화, 활성화 및 신호 전달을 주도하는지 알고 싶습니다. 지질 뗏목은 작고 동적이며 온도 조건에 민감하기 때문에 직접 연구하기가 어렵습니다.
연구원들은 종종 상호 작용을 연구하기 위해 큰 차수 영역을 가진 모델 시스템을 사용해야 합니다. 합성 및 원형질막 소포(plasma membrane vesicles)는 지질 비대칭과 소기관이 없는 세포막의 불완전한 표현입니다. 살아있는 세포로 작업하여 원형질막을 정확하게 표현할 수 있습니다.
그들은 살아있는 세포의 맥락에서 수용체 신호의 시작을 강조합니다. 이를 통해 멤브레인 환경이 수용체와 다운스트림 신호 경로에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 먼저 유리 팁이 있는 용적식 피펫을 사용하여 지질 스톡을 붕규산 튜브로 분취합니다.
붕규산 튜브를 약 섭씨 50도로 설정된 가열 블록에 놓고 모든 명백한 클로로포름이 증발할 때까지 튜브에 질소 가스 흐름을 적용합니다. 튜브를 진공 챔버로 옮기고 1시간 동안 고진공에 노출시켜 남아 있는 용매를 제거합니다. 그런 다음 건조된 지질 필름에 무혈청 Ham의 F-12 배지를 첨가하여 최종 농도인 20밀리몰에 도달합니다.
튜브를 뚜껑이나 테프론 테이프로 덮고 섭씨 70도의 수조에서 5분 동안 가열합니다. 다음으로, 용액을 와류로 분리하여 지질을 현탁시키고 다층 소포 또는 MLV를 형성합니다. 매체가 흐려진 후 전체 볼륨을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 최대 3일 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.
준비된 MLV를 메틸 알파 사이클로덱스트린과 최종 농도 40밀리몰까지 혼합합니다. 지질 혼합물을 섭씨 37도 또는 섭씨 55도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 미디어가 흐림에서 맑은 상태로 전환되는 것을 관찰합니다.
그런 다음 지질 교환 매체를 30-60분 동안 실온으로 식힙니다. 섭씨 37도에서 자란 중국 햄스터 난소 인슐린 수용체 세포와 5%의 이산화탄소를 1리터당 4.5g의 포도당을 함유한 DMEM을 얻습니다. 60mm 플레이트에 6 개의 세포의 힘으로 1.5 곱하기 10을 파종하고 80-90 % 농도를 얻기 위해 배양합니다.
그런 다음 PBS 1ml로 세포를 세 번 씻습니다. 2ml의 혈청이 없는 Ham의 F-12 배지에 하룻밤 동안 세포를 굶겨 죽입니다. PBS로 세포를 세 번 세척한 후 준비된 교환 배지 1ml를 첨가합니다.
실온에서 1시간 동안 세포를 배양하고 15분마다 소용돌이치며 교환 배지에 균일하게 노출되도록 합니다. 그런 다음 PBS 1ml로 세포를 세 번 씻습니다. 세포 배양 플레이트에서 PBS를 완전히 제거하고 플레이트를 45도 각도로 10분 동안 또는 완전히 마를 때까지 설정합니다.
잔류 완충액을 제거한 후 건조된 세포에 헥산 이소프로판올 용액 1ml를 첨가하고 실온의 셰이커에서 10분 동안 배양합니다. 이제 용액을 붕규산 튜브로 옮깁니다. 튜브를 덮은 후 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
다음으로, 500마이크로리터의 일반 수산화나트륨 하나를 사용하여 남은 세포 파편을 용해합니다. 용기를 실온에서 10분 동안 흔들어 완전히 용해되도록 합니다. 교환 효율을 확인하려면 클로로포름 메탄올 30% 수산화암모늄 용액 100ml를 유리 박층 크로마토그래피 탱크에 붓습니다.
탱크를 단단히 덮고 증기가 적어도 1 시간 동안 평형을 이루도록하십시오. 유기 용매가 증발할 때까지 질소 가스 흐름 아래에서 낮은 설정으로 가열 블록에서 지질 추출물 샘플을 건조합니다. 그런 다음 지질 필름을 50 마이크로 리터의 일대일 클로로포름 메탄올 용액에 용해시킵니다.
10마이크로리터 해밀턴 주사기를 사용하여 1-10마이크로리터의 샘플을 실리카 고성능 TLC 플레이트에 로드합니다. 20cm 플레이트당 최대 10개의 밴드를 로드하여 샘플을 1cm 밴드로 적용합니다. TLC 플레이트를 TLC 탱크에 똑바로 세우고 용매 전면이 8cm 이동하여 인지질 종을 분리하도록 합니다.
그런 다음 플레이트를 10분 동안 건조시키고 3% 아세트산 구리와 8% 인산의 수용액을 뿌립니다. 접시를 실온에서 30분 동안 또는 히트 건으로 다시 건조시킵니다. 접시는 반투명 파란색에서 불투명 흰색으로 바뀌어야 합니다.
다음으로, 섭씨 180도에서 200도로 템퍼링한 오븐에서 5-10분 동안 또는 검은색 지질 띠가 보일 때까지 접시를 숯불로 굽습니다. 처리된 세포를 500마이크로리터의 100나노몰 인슐린으로 실온에서 5분 동안 무혈청 배지에 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 씻은 후 얼음 위에 올려 자극을 멈춥니다.
그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 3000G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 펠렛화합니다. 다음으로, 100-200마이크로리터의 완전한 RIPA 용해 완충액을 세포 펠릿에 추가하고 30-40회 재현탁하여 세포를 용해합니다.
얼음에 용해물을 10 분 동안 배양 한 후, 16, 000 G에서 4 섭씨 온도에서 10 분 동안 원심 분리하여 파편을 분리합니다. 새 튜브에 상층액을 모으십시오. 단백질 농도를 결정한 후, 용해물을 5 배 laemmli 완충액과 혼합하고 섭씨 95도에서 5 분 동안 가열합니다.
전기영동을 위해 시료당 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel에 로드합니다. 단백질이 100에서 250 킬로달톤 사이에서 잘 분해될 때까지 실행 버퍼에서 100-150볼트로 겔을 실행합니다. 그런 다음 전달 완충액을 사용하여 분해된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 옮기고 적절한 항체로 멤브레인을 염색합니다.
중국 햄스터 난소 IR 세포의 지질 교환은 뇌 스핑고미엘린을 교환할 때 스핑고미엘린 밴드 강도를 증가시키고 포스파티딜콜린 밴드 강도를 감소시켰습니다. 반대로, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 또는 DOPC를 교환했을 때, phosphatidylcholine 띠 강도는 증가한 반면, sphingomyelin 띠 강도는 감소했다. DOPC와 교환된 세포는 인슐린 의존성 IR 자가인산화(insulin dependent IR autophosphorylation)의 감소를 보여주었습니다.
대조적으로, 뇌 스핑고미엘린은 IR 인산화를 유지하거나 적당히 증가시킨 세포를 교환했습니다. 정규화된 인산화 수준은 pYpY IR 강도를 웨스턴 블롯 데이터로부터의 IR 베타 강도로 나누어 측정하였다.
