活细胞中的脂质交换测定

我们研究受体酪氨酸激酶与哺乳动物质膜之间的相互作用。我们想知道脂筏和脂质不对称如何驱动受体定位、激活和信号传导。直接研究脂筏具有挑战性，因为它们体积小、动态且对温度条件敏感。

研究人员通常不得不使用具有大阶域的模型系统来研究交互作用。合成和质膜囊泡是缺乏脂质不对称性和细胞器的细胞膜的不完美表示。通过对活细胞的研究，我们可以准确表示质膜。

它们强调了在活细胞环境中受体信号转导的启动。这让我们深入了解了膜环境对受体及其下游信号通路的影响。首先，使用带有玻璃尖端的外置活塞式移液器将脂质原液分装到硼硅酸盐管中。

将硼硅酸盐管放在设置为约 50 摄氏度的加热块上，并向管中施加氮气流，直到所有明显的氯仿蒸发。将试管移至真空室中，将其置于高真空中 1 小时，以去除任何残留的溶剂。然后将无血清 Ham's F-12 培养基添加到干燥的脂质膜中，以达到 20 毫摩尔的最终浓度。

用盖子或特氟龙胶带盖住试管，并在 70 摄氏度的水浴中加热 5 分钟。接下来，涡旋溶液以悬浮脂质并形成多层囊泡或 MLV。培养基变得浑浊后，将整个体积转移到微量离心管中，并在 4 摄氏度下储存最多三天。

将制备的 MLV 与甲基 α 环糊精混合至终浓度为 40 毫摩尔。将脂质混合物在 37 摄氏度或 55 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。观察介质从浑浊过渡到晴朗。

然后，让脂质交换介质冷却至室温 30 至 60 分钟。获得在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下生长的中国仓鼠卵巢胰岛素受体细胞，补充每升葡萄糖 4.5 克的 DMEM。在 60 毫米板中接种 1.5 乘以 10 倍的 6 个细胞，并孵育以获得 80% 至 90% 的汇合度。

然后，用 1 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次。在 2 毫升无血清 Ham's F-12 培养基中将细胞饥饿过夜。用 PBS 洗涤细胞 3 次后，加入 1 毫升制备好的交换培养基。

将细胞在室温下孵育 1 小时，每 15 分钟旋转一次，以确保均匀暴露于交换介质中。然后，用 1 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次。从细胞培养板中完全取出 PBS，并将板以 45 度角放置 10 分钟或直至完全干燥。

去除残留缓冲液后，向干燥的细胞中加入 1 毫升己烷异丙醇溶液，并在摇床上室温孵育 10 分钟。现在将溶液转移到硼硅酸盐管中。盖上管子后，将其存放在零下 20 摄氏度。

接下来，使用 500 微升一种正常氢氧化钠溶解剩余的细胞碎片。在室温下摇动容器 10 分钟，以确保完全溶解。为了检查交换效率，将 100 毫升氯仿甲醇 30% 氢氧化铵溶液倒入玻璃薄层色谱槽中。

盖紧水箱，让蒸汽平衡至少一小时。在氮气流下，将加热块上的脂质提取物样品以较低的设置干燥，直到有机溶剂蒸发。然后，将脂质膜溶解在 50 μL 的一对一氯仿甲醇溶液中。

使用 10 微升 Hamilton 注射器，将 1 至 10 微升样品加载到二氧化硅高性能 TLC 板上。将样品涂在 1 厘米的条带上，每 20 厘米板最多加载 10 条条带。将 TLC 板直立放入 TLC 槽中，让溶剂前沿移动 8 厘米以分离磷脂种类。

然后，让板干燥 10 分钟，并喷洒 3% 乙酸铜和 8% 磷酸的水溶液。让板在室温下或用热风枪再次干燥 30 分钟。板应从半透明蓝色变为不透明白色。

接下来，在 180 至 200 摄氏度回火的烤箱中将板烧焦 5 至 10 分钟，或直到看到黑色脂质带。将处理过的细胞与 500 μL 100 纳摩尔胰岛素在无血清培养基中在室温下孵育 5 分钟。用冰冷的 PBS 洗涤细胞后，将它们放在冰上以停止刺激。

然后加入 1 毫升冰冷的 PBS，并使用细胞刮刀收获细胞。在 4 摄氏度下以 3000 G 的浓度沉淀细胞 5 分钟。接下来，向细胞沉淀中加入 100 至 200 μL 完全 RIPA 裂解缓冲液，并重悬 30 至 40 次以裂解细胞。

将裂解物在冰上孵育 10 分钟后，在 4 摄氏度下以 16， 000 G 离心 10 分钟以分离碎片。将上清液收集在新管中。确定蛋白质浓度后，将裂解物与 5 倍 laemmli 缓冲液混合，并在 95 摄氏度下加热 5 分钟。

将每个样品等量的蛋白质上样到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在电泳缓冲液中以 100 至 150 伏电压运行凝胶，直到蛋白质在 100 至 250 道尔顿之间得到充分分离。然后，使用转印缓冲液将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用适当的抗体对膜进行染色。

当脑鞘磷脂交换时，中国仓鼠卵巢 IR 细胞中的脂质交换导致鞘磷脂带强度增加和磷脂酰胆碱带强度降低。相反，当 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或 DOPC 交换时，磷脂酰胆碱条带强度增加，而鞘磷脂条带强度降低。与 DOPC 交换的细胞显示胰岛素依赖性 IR 自磷酸化降低。

相比之下，脑鞘磷脂交换细胞维持或适度增加 IR 磷酸化。通过将 pYpY IR 强度除以蛋白质印迹数据的 IR β 强度来确定归一化磷酸化水平。