Cette méthode peut aider à déchiffrer les étapes de l’échange de brins d’ADN et révèle les rôles des molécules des différentes protéines impliquées dans la combinaison pendant la réparation. Avec cette technique, nous pouvons surveiller l’échange de brins d’ADN en temps réel sans aucune perturbation de la réaction et utiliser le bloc utilisant pour déterminer la cinétique de chaque étape de réaction. Avec quelques ajustements mineurs, cette technique peut être appliquée pour étudier les activités des protéines de recombinaison purifiées dérivées d’autres espèces, telles que les mammifères et les plantes.
La démonstration de la procédure sera Kentaro Ito, un post-doc de mon laboratoire. Pour commencer, préparez le tampon de réaction A selon le protocole de texte. Ensuite, ajoutez 36 nanomole 16FA-oligonucleotide au tampon pour l’analyse d’appariement de l’ADN.
Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter la protéine RAD-51 à une concentration finale de 1,5 micro grains de beauté au mélange et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter la protéine SWI5-SFR1 à une concentration finale de 0,15 micro taupe au mélange et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires.
Transférer 1,5 millilitres du mélange dans une cuvette de quartz de 1,0 cm par 1,0 cm contenant un agitateur magnétique. Insérer la cuvette dans un spectrofluoromètre et procéder à l’ajustement du contrôleur de température et de l’agitateur magnétique. Enregistrez le changement des émissions de fluorescence fam à 525 nanomètres lors de l’excitation à 493 nanomètres à un intervalle de seconde pendant 100 secondes.
Enfin, à l’aide d’une seringue, injecter de l’ADN double brin étiqueté ROX à une concentration finale de 36 nano taupes dans la cuvette. Enregistrez le changement d’émission de fluorescence à un intervalle d’une seconde pendant 30 minutes. Pour comparer les spectres de fluorescence entre les substrats et les produits finaux, insérez chaque cuvette contenant les 16 fa-oligonucléotides avec ou sans RAD-51 dans un spectrofluoromètre et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, enregistrez l’émission de fluorescence FAM à 500 à 600 nanomètres lors de l’excitation à 493 nanomètres. Pour tester l’effet du RAD-51 sur les spectres de fluorescence, ajoutez rad-51 à une concentration finale de 1,5 micro grains de beauté. Et incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Enfin, enregistrez les spectres de fluorescence de 500 à 600 nanomètres lors de l’excitation à 493 nanomètres. L’efficacité maximale du FRET est obtenue en mesurant la réduction maximale de l’intensité de fluorescence lorsque tous les substrats d’ADN à brin unique sont convertis en ADN à double brin dans l’analyse d’appariement. Ou en mesurant l’augmentation maximale de l’intensité lorsque tous les substrats d’ADN à double brin sont convertis en ADN à brin unique dans l’analyse de déplacement.
Dans les deux analyses, l’ajout de protéines RAD-51 n’a pas affecté l’émission de fluorescence du FAM, ni son efficacité d’assaison par les roches. Les effets des réactions spontanées entre les AD du substrat et le blanchiment photo subséquent sont faibles. Comme le montrent les changements négligeables dans l’émission de FAM sans RAD-51, par rapport aux changements substantiels observés avec rad-51.
L’ajout du complexe SWI5-SFR1 stimule fortement l’activité d’appariement du RAD-51. La réaction d’appariement est simulée à l’aide d’un modèle en trois étapes, composé de la formation du premier intermédiaire à trois brins, de la transition vers le deuxième intermédiaire et de la libération de l’ADN à brin unique et de la formation du duplex hétéro. Une comparaison du modèle en trois étapes avec un modèle en deux étapes indique que le modèle en trois étapes est un meilleur ajustement pour simuler l’appariement de l’ADN, sans ou avec le complexe SWI5-SFR1.
La constante d’équilibre calculée de chaque étape de réaction, avec ou sans SWI5-SFR1, montre que le complexe SWI5-SFR1 ne stimule pas la formation du premier intermédiaire à trois brins, mais stimule fortement la transition entre les deux intermédiaires à trois brins, et la libération de l’ADN SS. Il est essentiel de vérifier que chaque lot de protéines purifiées est exempt de nucléase et de contamination par l’hélicase.
