Nous visons à développer et à caractériser un modèle basé sur des organoïdes pour imiter le tractus gastro-intestinal et le comparer à des porcs vivants, et à nous concentrer sur les caractéristiques de transport. Le passage d’une expérience animale classique à. Dans notre domaine de la physiologie gastro-intestinale à un.
Modèle in vitro basé sur des organoïdes, qui imite la situation in vivo. Nous avons combiné notre modèle de l’intestin grêle et du gros intestin des organoïdes avec. Ce qui peut être utilisé pour étudier les caractéristiques de transport en temps réel afin de permettre une comparaison de notre modèle et de la situation du porc vivant.
En particulier dans le domaine de la recherche sur l’élevage, les modèles alternatifs aux expériences classiques sur les animaux sont rares. Nous surmontons cette limitation en utilisant notre modèle basé sur les organoïdes du tractus intestinal porcin. Nous prévoyons d’utiliser notre modèle intestinal basé sur les organoïdes pour étudier les effets des bactéries pathogènes porcines.
L’objectif est de comprendre les mécanismes de pathogénicité de ces bactéries. Pour commencer, mélangez la membrane basale fraîchement décongelée dans un rapport de 1:40 avec du PBS stérile glacé dans un tube conique. Ajoutez 200 microlitres de ce mélange dans le compartiment apical de chaque insert à l’intérieur des plaques stériles.
Replacez le couvercle de la plaque du puits et incubez pendant au moins 1,5 heure à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, aspirez soigneusement la solution sans toucher la membrane. Retirez le milieu organoïde des puits contenant les organoïdes tridimensionnels des cryptes.
Pour dissoudre la membrane basale, ajoutez un millilitre de PBS glacé dans le puits et pipetez de haut en bas avec une pointe P1000. Recueillir tous les organoïdes dissous dans un tube de 15 millilitres prérempli de 10 millilitres de PBS glacé. Centrifugez le tube à 250 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans un millilitre d’EDTA tiède à 0,05 %. Incuber le tube pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie, puis placez-le sur de la glace pour arrêter la réaction. Avec une pointe P1000, pipetez de haut en bas 20 fois pour remettre complètement les organoïdes en suspension, puis répétez l’opération 15 fois à l’aide d’une pointe P1000 avec une pointe P200 fixée sur le dessus.
Maintenant, ajoutez 10 millilitres de DMEM glacé complété par 10 % de sérum de veau fœtal, ou FCS. Centrifugez le tube à 1000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu monocouche.
À l’aide d’une chambre Neubauer, suivez les instructions du fabricant pour déterminer le nombre de cellules vivantes par millilitre. Maintenant, remplacez la solution d’enrobage du compartiment apical par 500 microlitres de milieu monocouche, tempéré à 37 degrés Celsius, et ajoutez trois millilitres de milieu monocouche au compartiment latéral basal. Retirez le milieu monocouche apical.
Pour la culture 2D, ajoutez 500 microlitres de milieu monocouche contenant une quantité appropriée de cellules dans la chambre apicale de chaque puits et incubez les cellules. Pour la résistance électrique trans-épithéliale, ou mesure TEAR, nettoyez l’électrode de la baguette avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la sécher complètement. Introduisez le bras court de l’électrode de la baguette dans le compartiment apical et le bras long dans le compartiment latéral basal des inserts.
Ensuite, allumez et laissez le. Équilibrez le compteur pour une mesure stable, puis cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer les valeurs TEAR. Après avoir mesuré le dernier puits, cliquez sur Enregistrer pour stocker les données sur un périphérique USB.
Nettoyez l’électrode après chaque plaque et à la fin de la mesure. Laissez l’électrode sécher complètement avant de la ranger. Soustrayez les valeurs TEAR vides déterminées avant l’ensemencement des cellules des valeurs cellulaires mesurées.
Changez de milieu et mesurez TEAR tous les deux à trois jours, en vous assurant que TEAR est mesuré avant que le milieu ne soit changé. Ajoutez soigneusement 500 microlitres, ou trois millilitres, de milieu de différenciation frais et chaud aux compartiments apical et basal. Le jour 18 pour les organoïdes jéjunaux, ou le jour neuf pour les organoïdes du côlon, après l’ensemencement, procéder aux expériences fonctionnelles.
Réchauffer les solutions tampons muqueuses et sérosales à 37 degrés Celsius et aérer avec du carbogène. Assemblez les chambres individuelles à l’aide d’un insert vide pour chaque chambre individuelle, en vous assurant que les côtés apicaux des puits sont tous orientés dans la même direction. Remplissez toutes les chambres avec cinq millilitres de solution tampon muqueuse préchauffée.
Connectez toutes les électrodes de la pince de tension aux chambres individuelles en suivant les instructions du fabricant. Pour calibrer le logiciel de la chambre d’utilisation, cliquez sur le bouton RFDPI dans le logiciel de la pince de tension. Vérifiez que la résistance de tous les inserts vides est d’environ 70 ohms et que le courant est d’environ zéro millivolts.
Retirez toutes les électrodes et jetez la solution tampon utilisée. Ouvrez les chambres individuelles, retirez les inserts vides et maintenez l’ordre des chambres. Maintenant, sous l’armoire de sécurité, aspirez soigneusement le milieu basolatéral et apical de la plaque.
Lavez les cellules avec 500 microlitres de tampon muqueux chaud dans la chambre apicale et avec trois millilitres de tampon sérosal dans la chambre basolatérale. Retirez les inserts de la plaque et retirez délicatement leurs supports. Placez les inserts dans les chambres Ussing, en vous assurant que l’orientation correspond à la phase d’étalonnage.
Après avoir assemblé les chambres individuelles, remplissez les chambres faisant face au côté basolatéral des cellules avec cinq millilitres de tampon sérosal et celles faisant face au côté apical avec cinq millilitres de tampon muqueux. Connectez les électrodes et les tubes d’aération à chaque chambre individuelle et lancez la mesure dans le logiciel Ussing. Modifiez les conditions du mode circuit ouvert au mode court-circuit dans le logiciel.
Après cinq à 10 minutes d’équilibre, ajoutez 10 micromolaires de forskoline dans la chambre séreuse. Après 15 minutes, arrêtez la mesure, retirez les tubes d’aération et les électrodes des chambres et démontez les chambres. Les valeurs de résistance électrique trans-épithéliale ont progressivement augmenté pendant la culture, culminant à 150 ohms fois centimètre carré pour le jéjunum après 18 jours, et 200 ohms centimètre carré pour les organoïdes du côlon après neuf jours.
Les valeurs de courant basal de court-circuit étaient significativement plus faibles dans les organoïdes du jéjunum que dans les organoïdes du côlon, tandis que les valeurs de résistance basale n’ont montré aucune différence significative. Les traitements à la forskoline ont considérablement augmenté les valeurs de courant de court-circuit basal dans les organoïdes jéjunaux de 0,86 à 27,78 microampères par centimètre carré, et dans les organoïdes du côlon de 3,83 à 28,78 microampères par centimètre carré.
