L’isolement et la prolifération des cellules souches dérivées du tissu adipeux produisent un grand nombre de cellules souches qui peuvent être utilisées pour plusieurs applications et techniques expérimentales en aval. Une utilisation majeure prévue pour les adipocytes différenciés dans ce protocole est les tests métaboliques tels que l’absorption de glucose stimulée par l’insuline, la lipogenèse et la lipolyse stimulée. Pour commencer, créez un environnement de travail stérile en désinfectant la hotte de biosécurité et tous les outils.
Pipeter environ 10 millilitres de tampon PBS cinq dans quatre boîtes de culture cellulaire de 100 millimètres. Transférez un échantillon adipeux de 50 grammes dans l’un des plats et lavez-le quatre fois en le transférant séquentiellement sur les autres plats contenant cinq PBS. Ensuite, transférez le tissu adipeux lavé dans une boîte de culture propre de 100 millimètres et hachez-le soigneusement à l’aide de ciseaux ou de pinces stériles.
Transférer une section d’un à trois centimètres du tissu haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 13 millilitres de tampon collagénase. Rincez le reste du tissu de la boîte de culture avec deux millilitres de tampon collagénase pour assurer un volume total de 15 millilitres. Bien mélanger l’échantillon à l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres et incuber le tube à 37 degrés Celsius sur une bascule pendant 30 à 60 minutes.
Afin de neutraliser l’activité enzymatique, ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance ADSC dans le tube après l’incubation et mélangez-le bien avec une pipette pour séparer les agrégats tissulaires. Transférer la partie liquide dans un nouveau tube conique stérile de 50 millilitres, en laissant le tissu solide. Lavez le mouchoir trois fois en utilisant sept millilitres de deux PBS et transférez le liquide dans le nouveau tube.
Ensuite, centrifugez le tube à 500 fois G pendant cinq minutes et retirez soigneusement autant de surnageant que possible sans déranger la pastille. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse de globules rouges ou de globules rouges 1X et incuberez-la à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules deux fois en ajoutant cinq millilitres de milieu de croissance ADSC au tube et en centrifugeant pour éliminer le surnageant.
Après le dernier lavage, remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de croissance ADSC et filtrez-la à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Rincez la passoire avec deux millilitres supplémentaires du milieu et transférez quatre millilitres de suspension dans une boîte de culture stérile de 100 millilitres. Rincer le tube conique deux fois avec trois millilitres de milieu pour recueillir un volume total de 10 millilitres dans le plat de culture.
Observez les cellules collectées sous un microscope inversé à un grossissement de 10X pour vérifier la présence de cellules flottantes. Incuber les cellules pendant 24 heures dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité relative. Pour assurer la stérilité des milieux de culture, inclure une plaque avec des milieux seuls.
Après 24 heures, observez les cellules au microscope inversé pour vérifier l’adhérence des cellules. Retirer et remplacer le milieu par un milieu chaud toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 à 90 %. Pour la prolifération, retirez le milieu de croissance des cellules ADSC confluentes et lavez-les deux fois avec deux millilitres de PBS stérile à température ambiante.
Aspirer le PBS et ajouter deux millilitres d’EDTA à 0,25% de trypsine dans chaque plaque de culture, couvrant toute la surface de la plaque. Incuber la plaque pendant sept minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, puis déloger mécaniquement les cellules trypsinisées par pipetage forcé. Ajouter deux millilitres de milieu de croissance ADSC et mélanger délicatement les cellules.
Transférer les cellules dans un tube conique de 50 millilitres, rincer la boîte avec deux millilitres supplémentaires de milieu pour assurer une récupération maximale des cellules de la plaque. Ensuite, centrifuger le tube à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et décanter le surnageant pour obtenir la pastille de cellule. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq à six millilitres de milieu de croissance ADSC par million de cellules.
Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquez-les comme décrit dans le manuscrit du texte. Une fois que les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, aspirez le milieu de croissance et rincez les cellules avec du PBS stérile à température ambiante, puis ajoutez 10 millilitres de milieu de différenciation ADSC. Remplacez le milieu tous les trois jours pendant environ 14 à 21 jours.
Observez les cellules pour la présence de gouttelettes lipidiques sous le microscope inversé à un grossissement de 40X. Les adipocytes matures sont généralement observés après 14 jours. Le jour du placage, les ADSC n’étaient pas adhérents et flottaient en culture.
Les cellules sont devenues confluentes à 80% après 72 heures et étaient prêtes pour la différenciation adipocytes. Après 14 jours de différenciation ADSC, les adipocytes matures présentaient de fortes caractéristiques adipogènes qui ont été observées sous grossissement 40X. Le jour 14, les cellules ont été colorées et fixées avec Oil Red O et BODIPY pour la visualisation des gouttelettes lipidiques.
Des adipocytes différenciés ont pu être observés sous grossissement 20X. Lors de la tentative de ce protocole, il est important de se rappeler qu’un environnement de travail stérile est essentiel pour un isolement sain, une expansion adéquate et une différenciation efficace des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Suite à cette procédure, ces cellules peuvent être utilisées pour plusieurs tests métaboliques tels que l’absorption du glucose, la lipogenèse et la lipolyse, qui est un axe majeur de nos recherches.
Cette technique permet d’étudier l’impact de l’alcool chronique et du VIS sur la capacité métabolique des adipocytes.
