Ce protocole permet aux chercheurs de générer des virus pseudotypes qui peuvent être utilisés en toute sécurité pour étudier les événements d’entrée virale de virus hautement pathogènes, tels que le coronavirus sal et la plupart des coronavirus. Cette technique polyvalente est basée sur la passation transitoire facile d’installation. Ce système peut également être appliqué pour produire des particules pseudotypées avec des protéines de fusion d’autres virus, pas seulement le coronavirus S.Pour de meilleurs résultats, il est important de surveiller la santé cellulaire et la densité de la transfection ainsi que pour l’infection par le virus pseudotype.
Tiffany Tang et Lakshmi Nathan feront la démonstration de cette procédure. Des étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer, lavez soigneusement les cellules HEK293T avec 10 millilitres de 37 degrés Celsius, DPBS préchauffé deux fois.
Ensuite, aspirez le supernatant et fixez les cellules avec un millilitre de solution trypsine de 25% qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Que, incuber le flacon de cellules à 37 degrés Celsius dans l’environnement de dioxyde de carbone de 5% pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher. Ajoutez quatre millilitres de DMEM complet pour désactiver la solution trypsine.
Et puis compter les cellules à l’aide d’une diapositive de comptage cellulaire et d’un microscope léger. Diluer les cellules à 500 000 cellules par millilitre avec un DMEM complet. Ensuite, graine deux millilitres par puits de la solution cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 6 puits.
Et déplacez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules. Après s’être assuré que les cellules sont réparties uniformément incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant la nuit ou 16 à 18 heures. Pour préformer trois cotransfection plasmide, le premier mélange a calculé des volumes de plasmides et le milieu réduit de culture cellulaire de sérum dans un tube de micro centrifugeuse.
Incuber le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite trois microlitres par puits du réagent transfection à base de lipides à 47 microlitres par puits du milieu réduit de culture cellulaire sérique. Incuber le mélange à température ambiante pendant cinq minutes.
Ensuite, dans un tube de micro centrifugeuse, mélanger des quantités égales du réaccente de transfection et les solutions plasmides par tuyau se dirigeant de haut en bas à plusieurs reprises. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 minutes. Après l’incubation nocturne de la plaque cellulaire, utilisez un microscope à lumière inversée pour examiner les cellules pour leur morphologie et leur densité.
Ensuite, aspirez le milieu dépensé des cellules et ajoutez doucement un millilitre par puits du milieu de culture réduit préchauffé de cellules sériques à chaque puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution de transfection à chaque puits goutte sage. Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant quatre à six heures.
À la fin de l’incubation, ajouter un millilitre de transfection sans antibiotiques préchauffé DMEM, à 37 degrés Celsius à chaque puits. Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant 48 heures. Pour commencer la collecte des particules pseudotype utiliser un microscope à lumière inversée pour vérifier les cellules pour leur morphologie et leur état général.
La couleur du milieu doit être rose clair ou légèrement orange. Ensuite, transférez les supernatants des cellules transfected aux tubes coniques de centrifugeuse de 50 millilitres. Centrifuger les tubes à 290 fois la gravité pendant sept minutes pour enlever les débris cellulaires.
Ensuite, filtre clarifié supernatant à travers un filtre stérile de 0,45 micron pore taille. Faire de petits aliquots volume de solution de virus pseudotype dans les flacons cryo. Et les stocker à 80 degrés Celsius négatifs.
Pour effectuer l’infection pseudotypée de particule, premières cellules d’examen sous le microscope léger pour confirmer qu’il y a un tapis confluent des cellules. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 0,5 millilitres du DPBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez les supernatants des cellules et inoculez les cellules avec 200 microlitres de la solution de particules pseudotypées décongelées.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant une à deux heures. Après la période d’incubation, ajouter 300 microlitres du DMEMc préchauffé à 37 degrés Celsius. Et incuber les cellules infectées à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant 72 heures.
Enfin aspirer les supernatants des cellules infectées. Et précéder à luciferase journaliste analyse. Quantifier l’infectiosité des particules pseudotypées d’abord décongeler le substrat de luciferine, stocké à moins 80 degrés Celsius, à cinq reprises luciferase analyse tampon de lyse stocké à moins 20 degrés Celsius à température ambiante.
Ensuite, diluer le tampon de lyse d’analyse de luciferase à une fois la concentration avec de l’eau stérile. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du tampon dilué à chaque puits. Et incuber à température ambiante sur un rocker pendant 15 minutes.
Pour effectuer la mesure de l’activité de la luciferase, un puits à la fois, ajoutez d’abord 20 microlitres de substrat de luciferine à un tube de micro centrifugeuse. Ajouter ensuite 10 microlitres du lysate au tube. Mélanger le contenu en faisant glisser doucement les tubes.
Et placé le tube dans un dispositif de luminomètre. Fermez le couvercle et mesurez la valeur de luminescence du tube. Enregistrez la mesure relative des unités lumineuses et précèdez l’analyse des données.
Les analyses d’infectiosité du SRAS-Spp et du MERS-Spp dans les cellules hôtes sensibles ont montré une forte infectiosité moyenne, comparativement aux particules de contrôle positives attendues. Contrôles non infectés et particules de contrôle négatives dépourvues de glycoprotéines enveloppe virale. Les analyses d’activité de luciferase ont également montré la dépendance de concentration de l’infectiosité de SRAS-Spp et de MERS-Spp.
Une augmentation de l’infectiosité du SRAS-Spp ou du MERS-Spp dans les cellules cibles mal permissives, transfectées pour exprimer le récepteur ACE2 du SRAS-Spp, ou récepteur DPP4 du MERS-Spp, confirme que l’utilisation des pseudovirions par les récepteurs est similaire à celle des virus de l’OTAN pour la médiation de l’attachement et l’entrée des pseudovirions. Vérifiez les calculs avant d’effectuer cette étape. Et assurez-vous que toutes les solutions sont bien mélangées pendant l’étape.
Un essai occidental de tache peut être exécuté sur les particules pseudotypées concentrées pour évaluer l’incorporation de glycoprotéine de S dans les pseudovirions. Bien que les particules pseudotypées décrites ici soient des substituts plus sûrs que les virus de l’OTAN, elles nécessitent toujours des précautions de niveau de biosécurité deux.
