Этот протокол позволяет исследователям генерировать псевдотипные вирусы, которые могут быть безопасно использованы для изучения вирусных событий вступления высоко патогенных вирусов, таких как саль коронавирус и большинство коронавирусов. Эта универсальная техника основана на легкой установке переходной трансфекции. Эта система также может быть применена для производства частиц псевдотипов с белками синтеза других вирусов, а не только коронавирус S.Для наилучших результатов важно контролировать здоровье клеток и плотность для трансфекции, а также для псевдотипа вирусной инфекции.
Демонстрацией этой процедуры будет Тиффани Тан и Лакшми Натан. Аспиранты из моей лаборатории. Для начала тщательно промыть клетки HEK293T с 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию, предварительно разогретые DPBS дважды.
Далее, аспирировать супернатант и прикрепить клетки с одним миллилитр 25%трипсин раствор, который был предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию. Чем, инкубировать колбу клеток при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды в течение трех-пяти минут, пока клетки начинают отделяться. Добавьте четыре миллилитров полного DMEM для деактивации трипсиного раствора.
А затем подсчитайте клетки с помощью слайда подсчета клеток и светового микроскопа. Разбавить клетки до 500 000 клеток на миллилитр с полным DMEM. Далее, семена два миллилитра на колодец клеточного раствора в 6-хорошо ткани культуры пластины.
И осторожно перемещать пластину вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки. После убедившись, что клетки равномерно распределены инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа окружающей среды в одночасье или от 16 до 18 часов. Для преформы трех плазмидных котрансфекции первая смесь вычислила объемы плазмидов и пониженную среду культуры клеток сыворотки в микро центрифуге.
Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте три микролитров на колодец липидного реагенция на основе трансфекции до 47 микролитров на колодец среды культуры клеток сыворотки. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут.
Далее, в микро центрифуге трубки, смешать равное количество трансфекции реагента и плазмидных растворов трубы заголовок вверх и вниз несколько раз. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. После ночной инкубации клеточной пластины используйте перевернутый световой микроскоп для изучения клеток на их морфологию и плотность.
Затем, аспирировать провел среды клеток и осторожно добавить один миллилитр на колодец предварительно разогретой снижение культуры клеток сыворотки среды для каждого хорошо. Далее добавьте 100 микролитров трансфектного раствора, чтобы каждый хорошо упал мудрым. И инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение четырех-шести часов.
В конце инкубации добавьте один миллилитр предварительно разогретой антибиотиков свободной трансфекции DMEM, при 37 градусах Цельсия к каждой хорошо. И инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 48 часов. Для начала сбора псевдотипных частиц используйте перевернутый световой микроскоп для обследования клеток на их морфологию и общее состояние.
Цвет среды должен быть светло-розовый или слегка оранжевый. Затем перенесите супернатанты трансфицированных клеток в 50 миллилитров конических центрифугных трубок. Центрифуга труб в 290 раз тяжести в течение семи минут, чтобы удалить клеточный мусор.
Далее фильтр уточнил супернатант через стерильный фильтр размером 0,45 микрона. Сделайте небольшие объемные алициты псевдотипного вирусного раствора в крио-флаконах. И хранить их при отрицательных 80 градусов по Цельсию.
Для выполнения псевдотипной инфекции частиц, первые клетки экзамена под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что есть слияние ковер клеток. Затем трижды промыть клетки 0,5 миллилитров предварительно разогретого DPBS при 37 градусах цельсия. Далее аспирируют супернатанты клеток и прививают клетки 200 микролитров раствора талых псевдотипированных частиц.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного-двух часов. После инкубации добавьте 300 микролитров предварительно разогретого DMEMc при 37 градусах Цельсия. И инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 72 часов.
Наконец аспирировать супернатанты инфицированных клеток. И предшествуют люциферазы репортер анализа. Для количественной оценки инфекционности псевдотипических частиц сначала оттепель люциферина субстрата, хранящегося при температуре минус 80 градусов по Цельсию, в пять раз люцифераза анализ лиза буфер хранится при минус 20 градусов по Цельсию до комнатной температуры.
Затем разбавьте буфер анализа люциферазы до одной концентрации стерильной водой. Затем добавьте 100 микролитров разбавленного буфера к каждой колодец. И инкубировать при комнатной температуре на рокере в течение 15 минут.
Для выполнения измерения активности люциферазы, по одному хорошо за один раз, сначала добавьте 20 микролитров люциферина субстрата в микро центрифугу трубки. Затем добавьте в трубку 10 микролитров лизата. Смешайте содержимое, аккуратно стряхивая трубки.
И поместил трубку в люминометрное устройство. Закройте крышку и измерьте значение люминесценции трубки. Завехать измерение относительных световых единиц и предшествовать анализу данных.
Инфекционные анализы ТОРС-СПП и БВРС-Спп в восприимчивых клетках-хозяинах показали сильную среднюю инфекционность по сравнению с ожидаемыми положительными контрольными частицами. Неин инфицированные элементы управления и отрицательные контрольные частицы, не имеющие вирусных гликопротеинов оболочки. Также анализы активности люциферазы показали концентрационную зависимость от инфекции ТОРС-Спп и БВРС-Спп.
Увеличение инфекционности ТОРС-СПП или БВРС-Спп в плохо разрешительных целевых клетках, трансфицированных для выражения рецептора ACE2 ТОРС-Сппа, или рецептора DPP4 БВРС-Спп, подтверждает, что использование рецепторов псевдовирусов аналогично использованию вирусов НАТО для посредничества в крепления и ввода псевдовирусов. Двойные расчеты проверки перед выполнением этого шага. И убедитесь, что все решения смешиваются хорошо во время шага.
Западный анализ помарки может быть выполнен на концентрированных псевдотипированных частицах для оценки включения S гликопротеина в псевдовирии. Хотя псевдотипные частицы, описанные здесь, являются более безопасными суррогатами, чем вирусы НАТО, они по-прежнему требуют мер предосторожности уровня биобезопасности.
