Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudo-virus de la grippe aviaire H5 hautement pathogène et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite de la limitation du dépannage et des modifications de ces tests. Les agents pathogènes hautement pathogènes doivent être effectués dans le laboratoire de biosécurité de niveau trois, tandis que les pseudo-virus peuvent être manipulés en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité de niveau deux.
Pour commencer, fabriquez une suspension unicellulaire de cellules HEK293 FT dans un milieu DMEM complet. Ajouter 10 millilitres de suspension unicellulaire dans une fiole T75, puis procéder à une incubation à 37 degrés Celsius. Deux heures avant la transfection, remplacez l’ancien milieu par 10 millilitres de milieu complet frais avec de la chloroquine.
Mélanger les réactifs et l’ADN plasmidique comme décrit dans le manuscrit puis transférer ce mélange dans le milieu au-dessus des cellules et rocher doucement. Après l’incubation, remplacez le milieu par 15 millilitres de milieu DMEM complet frais. Après 65 heures, récolter le surnageant par centrifugation.
Recueillez le surnageant et aliquote-le. Pour détecter l’expression de la protéine hémagglutinine, ajoutez 50 microlitres de PBS dans les colonnes deux à 12 d’une plaque inférieure ronde de 96 puits. Ajouter 100 microlitres de pseudo-virus dans les puits de la première colonne.
Ensuite, transférez 50 microlitres de pseudo-virus de la première colonne dans les puits de la deuxième colonne. Effectuer cette double dilution jusqu’à la colonne 11, suivie d’un mélange doux. Jetez ensuite les 50 microlitres supplémentaires de la colonne 11.
Ajouter 50 microlitres d’érythrocyte à 0,5% dans chaque puits, puis mélanger doucement. Après 30 à 60 minutes d’incubation à température ambiante, observer et enregistrer les titres d’hémagglutinine du pseudovirus. Pour le titrage pseudo-virus, fabriquer une suspension unicellulaire de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre de cellules MDCK dans un milieu DMEM complet.
Ajoutez 1, 250, 2, 500, 5 000, 10, 000, 20, 000 et 40 000 cellules à différents puits d’une plaque de 96 puits à fond plat. Après incubation, décongeler et vortex le pseudo-virus. Ajouter six UAH de pseudo-virus à chaque puits d’une plaque de fond ronde de 96 puits et reconstituer chaque puits avec du DMEM complet jusqu’à 120 microlitres.
Transférer 100 microlitres du mélange dans les cellules de la plaque de 96 puits. Incuber la plaque de culture pendant 48, 60 et 72 heures pour l’infection virale et effectuer un test de luciférase. Pour effectuer le dosage de la luciférase, lavez les cellules en retirant soigneusement le milieu et en le rinçant avec 200 microlitres de PBS.
Retirez autant de PBS que possible, puis ajoutez 50 millilitres de tampon de lyse à chaque puits. Le lendemain, équilibrer les plaques à température ambiante pendant deux heures, puis secouer les plaques de culture plusieurs fois et transférer tous les lysats cellulaires sur des plaques opaques de 96 puits. Ajoutez 50 microlitres de substrat à chaque assiette et mélangez bien.
Enregistrez les titres de luciférase du pseudo-virus à l’aide du luminomètre. Ajouter 100 microlitres de la suspension unicellulaire de cellules MDCK à chaque puits d’une plaque de fond plat de 96 puits et incuber pendant 20 heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, décongeler et vortex le pseudo-virus et les sérums stockés à moins 80 degrés Celsius.
Diluer les sérums 20 fois dans un milieu complet. Ajouter 100 microlitres de milieu DMEM aux colonnes trois à 10. Ajouter 200 microlitres de sérum dilué dans les puits de la deuxième colonne et effectuer une dilution en série.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu DMEM à la 11ème colonne comme témoin négatif. Ajoutez 100 microlitres de pseudo-virus à chaque puits et mélangez-le. Transférer 100 microlitres du mélange de la plaque de fond ronde à 96 puits vers le puits correspondant de la plaque de culture cellulaire de 96 puits.
Après 60 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, effectuez le test de luciférase. Le test d’hémagglutinine a montré que 643 unités d’HA par millilitre de pseudo-virus de la grippe sont présentes dans les stocks de pseudo-virus de la grippe. Les rapports HA et Gag P24 se situaient dans une fourchette normale.
Le test Western blot a montré la présence de quatre types de protéines, y compris les protéines HA0, HA1, HA2 et NA, ce qui indique la similitude des pseudo-virus grippaux avec ceux des virus de type sauvage. Les résultats du titrage pseudo-viral indiquent que les conditions appropriées pour l’activité relative la luciférase la plus élevée comprennent l’alimentation de 5 000 cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits et la détection des lectures de l’activité relative de la luciférase après 60 heures d’infection virale. Les sérums immuns du groupe DDV présentaient des titres de neutralisation élevés contre la souche pseudo-virale A Thailand 1 Can 104, tandis que les sérums du groupe témoin ne présentaient aucune activité de neutralisation.
L’activité neutralisante des sérums immunitaires était puissante par rapport aux sérums témoins, ce qui indique que beaucoup d’anticorps étaient dirigés vers la tête de l’HA dans les sérums immunitaires. Les différences significatives entre les sérums immunitaires et les témoins lors de l’évaluation de l’entrée virale indiquent que les anticorps sont dirigés vers la région souche HA dans les sérums immuns. Lors de l’exécution de cette procédure, n’oubliez pas de maintenir le pH de la solution de transfection et du milieu de culture stable.
