Purification du réticulum sarco-endoplasmique Ca²⁺-ATPase du muscle de lapin

Ce protocole décrit une méthode de purification SERCA améliorée, qui inclut le disaccharide tréhalose dans l’étape finale de centrifugation. Ce glucide stabilise les protéines dans des conditions difficiles. Le SERCA purifié était catalytiquement actif et présentait une grande pureté, ce qui le rendait adapté aux études structurelles et fonctionnelles.

Certaines ATPases de type P, telles que le réticulum sarco/endoplasmique Ca²⁺-ATPase (SERCA), sont des protéines membranaires intrinsèquement labiles qui nécessitent des conditions physicochimiques spécifiques lors de la purification pour les obtenir avec une pureté et une qualité structurelle élevées et sous une forme catalytiquement active. Le disaccharide tréhalose est un soluté compatible qui est synthétisé et accumulé en fortes concentrations dans le cytoplasme de la levure pour stabiliser les membranes et les protéines. L’utilisation du tréhalose comme additif dans le protocole de purification de la membrane plasmique H⁺-ATPase permet d’obtenir une préparation de haute qualité, dont la structure hexamérique est mise en évidence par les méthodes d’analyse biochimique. Le tréhalose peut donc être utilisé comme additif stabilisant pour la purification des protéines membranaires (P-ATPases). Ce protocole décrit la modification du protocole classique de purification du SERCA en soumettant le SERCA à une centrifugation sur un gradient de concentration de tréhalose. L’inclusion de ce glucide a conduit à la purification de SERCA sous une forme catalytiquement active de haute pureté et, surtout, sous une forme stable. La caractérisation biochimique partielle du SERCA PURIFIÉ (SDS-PAGE, cinétique enzymatique, marquage FITC, spectroscopie de dichroïsme circulaire) a montré que l’enzyme est adaptée aux études fonctionnelles et structurales. L’utilisation du tréhalose dans le protocole de purification des ATPases de type P et d’autres protéines membranaires labiles (et cytosoliques) est suggérée.

Les protéines/enzymes membranaires sont des composants biologiques essentiels des cellules car elles jouent un rôle essentiel dans divers processus ^1,2,3. Certaines des fonctions peuvent inclure le transport d’ions et de molécules à l’intérieur et à l’extérieur des compartiments cellulaires/internes (actifs/passifs), la reconnaissance cellule-cellule, la liaison intercellulaire, l’ancrage/l’attachement, et la détection de l’environnement externe par intégration avec la machinerie de transduction du signal dans des conditions physiques et chimiques normales et difficiles (sel élevé, eau faible, température élevée, résistance aux médicaments, etc.)³ Par conséquent, la détermination de la structure tridimensionnelle (3D) des protéines et/ou des enzymes membranaires est devenue d’une grande importance pour la recherche fondamentale et appliquée ^4,7,6. Il est important de noter que les protéines/enzymes membranaires ont été largement utilisées comme cibles pour la découverte de médicaments (qu’elles soient naturelles ou intentionnelles)^7,8,9. C’est-à-dire que les protéines membranaires ont une importance inhérente à la santé ^9,10,11.

Le caractère hydrophobe des protéines/enzymes membranaires est la propriété physicochimique la plus difficile sur le plan technique pour le laboratoire expérimental 12,13,14, encore plus lorsqu’il s’agit de travailler avec des protéines membranaires intégrales oligomères et/ou hautement labiles ^15,16. Il est hautement souhaitable d’isoler des quantités appropriées de la protéine/enzyme membranaire avec la meilleure qualité possible pour les essais expérimentaux fonctionnels et les études structurales¹⁷. Les protéines membranaires, étant intrinsèquement hydrophobes, sont très difficiles à purifier, et le choix du détergent est généralement l’une des questions les plus importantes à prendre en compte 17,18,19,20. À cet égard, les méthodes de laboratoire utilisées pour isoler les protéines membranaires causent généralement un certain degré de dommages à l’arrangement structurel 3D de la protéine²¹. Certaines de ces méthodes comprennent l’utilisation (a) de sonications (ondes ultrasonores à haute fréquence/énergie), (b) de détergents solubilisants de protéines (durs, moyens ou doux)²², (c) de pressions relativement élevées dans la chromatographie sur colonne et l’ultracentrifugation à grande vitesse²³, (d) de molécules précipitantes, (e) d’enzymes digestives, et d’autres²¹. Tous ces processus peuvent contribuer ou être la principale cause de déstabilisation des protéines lors de la purification²¹. À cet égard, certains protocoles semblent fonctionner relativement bien pour une protéine membranaire donnée. Cependant, l’optimisation est toujours la bienvenue lors de l’utilisation de nouveaux tests modernes ou de méthodes qui nécessitent une préparation de protéines membranaires de meilleure qualité pour obtenir des résultats satisfaisants²⁴. Les étapes d’optimisation peuvent inclure, sans s’y limiter, l’amélioration de la conception des constructions, la recherche de conditions optimales pour l’expression des protéines membranaires, l’établissement de meilleures conditions de manipulation (pH, température, etc.), la recherche du meilleur détergent compatible, l’ajustement des étapes de purification telles que le temps de sonication, la vitesse de centrifugation, la reformulation des solutions tampons par l’ajout d’agents stabilisants, etc.25,26,27. Par conséquent, tout changement dans la méthodologie de purification qui conduit à une augmentation de la qualité (pureté) et de l’activité de la protéine/enzyme membranaire purifiée est important.

Dans la famille des ATPases de type P, la membrane plasmique de levure H⁺-ATPase semble être l’un des membres les plus labiles^28,29. La H⁺-ATPase perd son activité d’hydrolyse de l’ATP lors de la déshydratation (lyophilisation), du choc thermique, ^etc.28,29. L’utilisation du tréhalose comme stabilisateur protéique a été testée dans l’isolement de la membrane plasmique H⁺-ATPase de la levure K. lactis^30,31 ; la préparation de H⁺-ATPase obtenue était de grande pureté et catalytiquement active. Il est important de noter que cela a permis de résoudre l’état oligomérique de l’enzyme par des méthodes biochimiques, révélant qu’il s’agit d’un hexamère et confirmé plus tard par cryo-microscopie électronique 31,32,33,34,35. Par conséquent, il semble probable que l’arrangement tridimensionnel délicat (3D) des protéines membranaires puisse être perdu dans des conditions relativement difficiles lors de la purification³⁶. Une cinétique d’inactivation biphasique est observée pour la H⁺-ATPase lors de l’inactivation induite par la chaleur²⁹. Dans les cellules de levure, comme dans de nombreux autres organismes, le disaccharide tréhalose s’accumule à des concentrations élevées dans des conditions de stress environnemental 37,38,39. Le tréhalose maintient l’intégrité de la membrane et la fonction de transport en stabilisant les protéines (à la fois intégrées dans la membrane et cytosoliques) et les membranes cellulaires^40,41. Le mécanisme de stabilisation du tréhalose a été étudié de manière approfondie par plusieurs groupes et par notre laboratoire ^42,43,44,45. Des expériences avec la H⁺-ATPase et d’autres enzymes ont montré que le tréhalose est le stabilisateur protéique le plus efficace parmi les mono- et disaccharides^28,29. Cela a conduit à son inclusion dans le protocole de purification H⁺-ATPase³⁰. Récemment, le tréhalose a également été utilisé dans la purification du réticulum sarcoplasmique Ca²⁺-ATPase (SERCA) du muscle à contraction rapide du lapin avec de bons résultats en termes de pureté et d’activité^{des protéines 46}. Par conséquent, le tréhalose semble être un bon additif approprié pour la purification des ATPases de type P et probablement d’autres protéines membranaires et cytosoliques.

Pour les P-ATPases, l’existence de domaines cytoplasmiques structurels est un avantage expérimental, en particulier pour les études d’interaction substrat/ligand⁴⁷ ; La liaison à l’ATP a été étudiée dans les domaines N recombinants hautement purs ^47,48,49, éliminant ainsi les considérations techniques pour la purification des enzymes membranaires entières 47,48,50, entre autres ⁵¹. Malheureusement, certaines études fonctionnelles (conversion catalytique/énergétique) et structurelles (arrangement des sous-unités et interaction avec d’autres protéines) nécessitent encore l’intégralité de la P-ATPase^52,53. À cet égard, la purification de SERCA a été réalisée par plusieurs groupes de recherche 54,55,56,57,58. Cependant, des améliorations peuvent encore être mises en œuvre⁴⁶, par exemple, augmenter l’intégrité de l’ATPase⁵⁹ purifiée, éviter la dénaturation/perturbation des protéines des complexes protéiques²⁵, augmenter la solubilisation sans dénaturation de la protéine membranaire (c’est-à-dire éviter la formation d’agrégats macromoléculaires)⁶⁰, conduire à une meilleure compatibilité avec les dosages et autres méthodes analytiques en aval⁶¹ De plus, au fur et à mesure que de nouvelles stratégies expérimentales, additifs, inhibiteurs d’enzymes, etc. apparaissent dans la littérature scientifique 61,62,63,64,65,66, ils doivent parfois être testés avec l’ensemble de la P-ATPase. Ce travail décrit le protocole de purification de SERCA et l’utilisation du tréhalose comme additif pour stabiliser la structure protéique et l’activité de l’ATPase ; C’est-à-dire qu’en plus d’augmenter la qualité enzymatique (structurelle), le tréhalose aide à prévenir la perte de structure et d’activité enzymatiques pendant l’isolement et le stockage des enzymes, ce qui permet d’économiser du matériel biologique et donc de réduire le nombre de purifications enzymatiques.

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives internationales et locales (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) pour la manipulation des animaux dans les laboratoires expérimentaux 51,67,68. Du tissu musculaire a été obtenu à partir d’Oryctolagus cuniculus de type sauvage provenant d’une unité locale de manipulation d’animaux (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)⁴⁶. Un vétérinaire spécialisé dans la gestion des animaux de laboratoire a effectué la dissection et le traitement musculaires initiaux. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolement du réticulum sarcoplasmique à partir d’un muscle de lapin à contraction rapide (Durée, 7 - 9 h)

REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, voir Champeil et ^al.69.

1. Obtenez du tissu musculaire à contraction rapide (~70 g des deux pattes arrière par animal) à partir d’Oryctolagus cuniculus de type sauvage.
   REMARQUE : L’identification visuelle préalable des muscles à disséquer est requise^70,71.
2. Faites macérer le muscle à contraction rapide dans un mélangeur en le suspendant en trois volumes de 100 mM de KCl, avec 1 min de marche et 1 min de repos glacé, répétez trois fois⁷².
3. Retirer les débris tissulaires par centrifugation (1500 × g) à 4 °C pendant 5 min ; Une seconde centrifugation (4200 × g) est effectuée si nécessaire.
4. Prélever le surnageant et l’homogénéiser à l’aide d’un broyeur à mouchoirs (10 coups à basse vitesse, c’est-à-dire 500-1 500 tr/min)^72,73. Centrifuger l’homogénat (10 000 × g) à 4 °C pendant 15 min.
   REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de l’homogénéisation, car l’utilisation d’une vitesse relativement élevée peut entraîner des dommages au système et à l’opérateur.
5. Centrifuger le surnageant (contenant le réticulum sarcoplasmique) (33 000 × g) à 4 °C pendant 120 min.
6. Mettre les pastilles en suspension dans 40 mL de 0,5 M de saccharose et centrifuger (12 000 × g) à 4 °C pendant 15 min. Diluer le surnageant (0,6 M de KCl et 0,15 M de saccharose) et centrifuger la suspension (34 000 × g) à 4 °C pendant 165 min.
7. Mettre en suspension la pastille contenant les feuilles de vésicules du réticulum sarcoplasmique (SRV) dans 0,3 M de saccharose, 0,1 M de KCl et 5 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Déterminez la concentration en protéines en utilisant le test de Lowry⁷⁴ et l’albumine sérique humaine comme étalon protéique.
8. Aliquote les SRV (30-32 mg/mL) dans un volume de 1 mL. Stockez les échantillons SRV à -72 °C pour un traitement ultérieur.
   REMARQUE : Le rendement en protéines est de 100 à 110 mg de SRV par animal.

2. Purification SERCA (Durée, 18 - 20 h)

REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter Rivera-Morán et ^al.46.

1. Diluer la suspension de SRV à 2 mg de protéines/mL en utilisant 75 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M de KCl, 6 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA et 0,1 % (p/v) de désoxycholate (COD). Incuber la suspension SRV sur de la glace pendant 10 min et agiter doucement. Centrifuger la suspension SRV (100 000 × g) à 4 °C pendant 60 min.
   REMARQUE : Le DOC doit être ajouté goutte à goutte.
2. Mettre les pastilles en suspension dans <3 mL de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M de KCl, 45 % de glycérol (v/v) et 2 mM d’EDTA. Homogénéiser la suspension et l’ajuster à un volume final de 10 mL. Déterminez la concentration en protéines, puis ajustez-la à 6,5 mg/mL. Ajouter de l’azolectine à 5 mg/mL et 0,85 (p/p) de Zwittergent 3-14.
   REMARQUE : L’azolectine et le Zwittergent 3-14 doivent être ajoutés goutte à goutte.
3. Homogénéiser la suspension et centrifuger (100 000 × g) à 4 °C pendant 60 min. Prélever le surnageant et diluer 1:2 avec 2 mM d’EGTA (pH 7,2).
4. Verser délicatement la suspension sur un gradient discontinu de concentration de tréhalose (45, 40, 35 et 30 % p/v) dans 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM d’EDTA, 0,1 % de désoxycholate et 1 mg/mL d’azolectine. Centrifugeuse (100 000 × g) à 4 °C pendant 14 h. Récupérez la pastille transparente, légèrement jaunâtre, formée au fond des tubes.
   REMARQUE : La formation du gradient de tréhalose et l’ajout de la suspension de l’échantillon doivent être effectués à l’aide de techniques appropriées. Une centrifugation de nuit est recommandée.
5. Suspendre doucement la pastille dans un petit volume (<1,5 mL) de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 de M KCl, 45 % de glycérol et 2 mM d’EDTA. Déterminer la concentration en protéines. Ajuster la concentration en protéines par dilution à 2 mg/mL. Prélever des aliquotes (~50 μL) de la suspension et stocker le SERCA purifié à -72 °C jusqu’à son utilisation.
6. Réaliser la fiche de données de sécurité du SERCA⁷² purifié, et des échantillons de protéines prélevés aux différentes étapes de la purification. Teignez le gel avec Coomassie Blue⁷².
   REMARQUE : L’utilisation de 0,6 M de tréhalose au lieu de glycérol dans le tampon de suspension augmente la stabilité de l’enzyme pendant le stockage et les cycles de congélation-décongélation^28,29.

3. Dosage de l’activité ATPase (Timing, 1 - 2 h)

1. Dosage enzymatique : ATPase-Piruvate kinase-lactate déshydrogénase
   1. Préparez le mélange réactionnel (1 mL) : 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 5 mM de phosphoénolpyruvate, 250 μM de NADH. Inclure des concentrations variables d’ATP (0,001 à 0,25 mM).
   2. Homogénéiser soigneusement le test de réaction par vortex. Incuber le test de réaction à 37 °C pendant 10 min. Ajouter 0,9 U de L-lactate déshydrogénase (LDH) et 1,5 U de pyruvate kinase (PK).
   3. Initier la réaction ATPase par l’ajout de 10 μg de SERCA.
   4. Déterminer la formation du NADH. Suivez l’évolution de l’intensité de l’absorbance toutes les secondes pendant 600 s à une longueur d’onde (λ) de 340 nm au fil du temps à l’aide d’un spectrophotomètre muni d’un support de cellule thermostaté.
      REMARQUE : L’intervalle de temps pour la mesure de l’absorbance peut varier, mais essayez d’enregistrer autant de points de données que possible pour tracer la ligne droite initiale de la réaction ATPase.
2. Déterminer le taux d’hydrolyse de l’ATP
   REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter Rivera-Morán et ^al.46.
   1. Calculez la valeur de la pente (Δabs/min) de la portion linéaire dans chaque courbe formée. Utilisez le coefficient d’extinction molaire (ε) du NADH (λ = 6 220 M⁻¹·cm⁻¹) pour déterminer l’activité de l’ATPase (μmoles ATP hydrolysées/min.mg prot.)
3. Déterminer les paramètres cinétiques K,_m et V_max.
   1. Tracez les données de vitesse en fonction de la concentration d’ATP à l’aide d’un logiciel d’analyse de données et de graphiques.
   2. Ajustez les données par régression non linéaire à l’équation de Michaelis-Menten (équation 1)⁴⁶ :
      
      où v est la vitesse, V_max est la vitesse maximale, [S] est la concentration d’ATP et K_m est la constante de Michaelis-Menten.
   3. Déterminez K,_m et V_max par itération.
      REMARQUE : L’inclusion de DOC peut augmenter la réponse du taux d’ATPase ; il est recommandé de tester différentes concentrations de COD pour trouver l’optimum.

4. Test de marquage de SERCA avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Timing, 30 - 45 min, uniquement pour le marquage FITC)

REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, reportez-vous à 54,75,76.

1. Mettre en suspension SERCA (20 μg) dans 50 μL (volume final) de tampon d’étiquetage (100 mM de KCl, 5 mM de MgCl₂ et 30 mM de Tris-HCl, pH 8,9) contenant 1 mM de FITC. Mélanger par vortex.
2. Incuber les échantillons à différents moments (15 min, 10 min, 7 min, 5 min et 2 min) dans l’obscurité et à température ambiante.
3. Arrêtez la réaction de marquage en ajoutant 1 volume de tampon d’arrêt glacé (480 mM de saccharose et 48 mM de MOPS, pH 7,0), contenant de l’ATP (5 mM). Incuber sur glace pendant 5 min dans l’obscurité.
4. Soumettre le SERCA labellisé FITC à la FDS-PAGE⁷². Exposez les gels transparents à la lumière UV (λ = 302 nm). Documentez le résultat avec une photo.
5. Teindre le gel avec du bleu Coomassie. Documentez le résultat avec une photo.
   REMARQUE : L’exécution du marquage FITC dans une pièce sombre peut améliorer la qualité du signal de fluorescence.

5. Spectres de dichroïsme circulaire (CD) (Timing, 30 min)

REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, reportez-vous à^11,77.

1. Suspendre SERCA (3 μM) dans 400 μL de tampon phosphate 10 mM (pH 7,0) à 25 °C.
2. Chargez l’échantillon dans une cellule de 0,1 cm de longueur de trajet. Réglez la plage λ des spectres UV lointains entre 190 et 260 nm. Réglez la résolution interne et la bande passante sur 1 nm.
3. Enregistrez le signal CD à 50 nm/min à 25 °C.

FDS-PAGE de SERCA à différents stades de purification (Figure 1). Le gel coloré en bleu de Coomassie montre l’enrichissement de la bande protéique SERCA (poids moléculaire apparent >100 kDa) au fur et à mesure de la progression du protocole de purification. La bande protéique correspondant à SERCA présente une pureté de >90 % après centrifugation sur un gradient de concentration de tréhalose. Graphique du taux d’hydrolyse de l’ATP en f...

La plupart des molécules et des ions ne peuvent pas traverser librement les membranes cellulaires, par exemple, le proton (H⁺) nécessite un transporteur membranaire dans la membrane plasmique d’une variété d’organismes et d’organites tels que les mitochondries^83,84. Les membranes cellulaires sont sélectives, et les molécules et les ions qui traversent les membranes cellulaires sont diversifiés, de sorte qu...

L’auteur déclare qu’il n’a pas d’intérêts financiers concurrents.

L’auteur remercie Edmundo Mata-Morales pour l’aide qu’il a apportée au montage de la vidéo, à VM, à Valentín de la Cruz-Torres pour la purification des SRV, à Miguel A. Rivera-Moran pour la purification et l’analyse du SERCA, et à Juan C. Gonzalez-Castro, Franco E. Juarez, Alejandra Nevarez, Nicolas Rocha-Vizuet et Jocelin I. Ramírez-Alonso pour la production vidéo. Aucun financement, subvention ou autre soutien n’a été reçu pour mener cette étude.