Aufreinigung des Sarko-endoplasmatischen Retikulums Ca²⁺-ATPase aus dem Kaninchenmuskel

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte SERCA-Aufreinigungsmethode, bei der das Disaccharid Trehalose in den letzten Zentrifugationsschritt einbezogen wird. Dieses Kohlenhydrat stabilisiert Proteine unter rauen Bedingungen. Das gereinigte SERCA war katalytisch aktiv und wies eine hohe Reinheit auf, wodurch es sich für strukturelle und funktionelle Studien eignete.

Einige P-Typ-ATPasen, wie z. B. Sarko-/endoplasmatisches Retikulum^Ca-2+-ATPase (SERCA), sind inhärent labile Membranproteine, die während der Reinigung spezifische physikalisch-chemische Bedingungen erfordern, um sie mit hoher Reinheit und struktureller Qualität und in katalytisch aktiver Form zu erhalten. Das Disaccharid Trehalose ist ein kompatibler gelöster Stoff, der synthetisiert und in hohen Konzentrationen im Zytoplasma der Hefe akkumuliert wird, um die Membranen und Proteine zu stabilisieren. Die Verwendung von Trehalose als Additiv im Protokoll zur Reinigung der Plasmamembran H⁺-ATPase führt zu einem hochwertigen Präparat, dessen hexamere Struktur durch biochemische Analysemethoden gezeigt wird. Trehalose kann daher als stabilisierendes Additiv für die Aufreinigung von Membranproteinen (P-ATPasen) eingesetzt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Modifikation des klassischen Protokolls für die SERCA-Reinigung, indem SERCA einer Zentrifugation an einem Trehalose-Konzentrationsgradienten unterzogen wird. Die Aufnahme dieses Kohlenhydrats führte zur Reinigung von SERCA in einer katalytisch aktiven Form mit hoher Reinheit und vor allem in einer stabilen Form. Eine partielle biochemische Charakterisierung des gereinigten SERCA (SDS-PAGE, Enzymkinetik, FITC-Markierung, Zirkulardichroismusspektroskopie) zeigte, dass das Enzym für funktionelle und strukturelle Studien geeignet ist. Die Verwendung von Trehalose im Aufreinigungsprotokoll von P-Typ-ATPasen und anderen labilen Membran- (und zytosolischen) Proteinen wird vorgeschlagen.

Membranproteine/Enzyme sind essentielle biologische Bestandteile von Zellen, da sie in verschiedenen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen ^1,2,3. Einige der Funktionen können den Transport von Ionen und Molekülen in und aus der Zelle/den inneren Kompartimenten (entweder aktiv/passiv), die Zell-Zell-Erkennung, die interzelluläre Bindung, die Verankerung/Bindung und die Wahrnehmung der äußeren Umgebung durch Integration mit der Signaltransduktionsmaschinerie unter normalen und rauen physikalischen und chemischen Bedingungen (hoher Salzgehalt, niedriger Wassergehalt, hohe Temperatur, Arzneimittelresistenz, usw.)³ Daher ist die Bestimmung der dreidimensionalen (3D) Struktur von Membranproteinen und/oder Enzymen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die angewandte Forschung von großer Bedeutung geworden ^4,7,6. Wichtig ist, dass Membranproteine/-enzyme in großem Umfang als Ziele für die Wirkstoffforschung (ob natürlich oder beabsichtigt) verwendet ^werden7,8,9. Das heißt, Membranproteine haben eine inhärente Bedeutung für die Gesundheit ^9,10,11.

Der hydrophobe Charakter von Membranproteinen/-enzymen ist die technisch anspruchsvollste physikalisch-chemische Eigenschaft für das Experimentallabor 12,13,14, umso mehr bei der Arbeit mit oligomeren und/oder hochlabilen integralen Membranproteinen ^15,16. Die Isolierung geeigneter Mengen des Membranproteins/Enzyms mit höchstmöglicher Qualität für funktionelle experimentelle Assays und Strukturstudien ist sehr wünschenswert¹⁷. Membranproteine, die von Natur aus hydrophob sind, sind sehr schwer zu reinigen, und die Wahl des Detergens ist in der Regel eines der wichtigsten Punkte, die berücksichtigt werden müssen 17,18,19,20. In dieser Hinsicht verursachen die Labormethoden, die zur Isolierung von Membranproteinen verwendet werden, typischerweise einen gewissen Grad an Schädigung der 3D-Strukturanordnung des Proteins²¹. Einige dieser Verfahren umfassen die Verwendung von (a) Beschallung (hochfrequente/energiereiche Ultraschallwellen), (b) proteinlösliche Detergenzien (entweder scharf, mittel oder schonend)²², (c) relativ hohe Drücke in der Säulenchromatographie und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation²³, (d) fällende Moleküle, (e) Verdauungsenzyme^{und andere 21}. All diese Prozesse können zur Destabilisierung von Proteinen während der Reinigung beitragen oder die Hauptursache dafür sein²¹. In dieser Hinsicht scheinen einige Protokolle für ein bestimmtes Membranprotein relativ gut zu funktionieren. Eine Optimierung ist jedoch immer willkommen, wenn neue moderne Assays oder Methoden verwendet werden, die eine höhere Qualität der Membranproteinpräparation erfordern, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen²⁴. Zu den Optimierungsschritten gehören unter anderem die Verbesserung des Konstruktdesigns, die Suche nach optimalen Bedingungen für die Expression von Membranproteinen, die Etablierung besserer Handhabungsbedingungen (d. h. pH-Wert, Temperatur usw.), die Suche nach dem am besten kompatiblen Detergensmittel, die Anpassung von Reinigungsschritten wie Beschallungszeit, Zentrifugationsgeschwindigkeit, Neuformulierung von Pufferlösungen durch Zugabe von Stabilisierungsmitteln usw.25,26,27. Daher ist jede Änderung der Reinigungsmethodik, die zu einer Steigerung der Qualität (Reinheit) und Aktivität des gereinigten Membranproteins/Enzyms führt, wichtig.

In der Familie der P-Typ-ATPase scheint die Hefe-Plasmamembran H⁺-ATPase eines der labilsten Mitglieder zu sein^28,29. Die H⁺-ATPase verliert ihre hydrolysierende ATP-Aktivität bei Dehydratisierung (Gefriertrocknung), Hitzeschock ^usw.28,29. Die Verwendung von Trehalose als Proteinstabilisator wurde bei der Isolierung der Plasmamembran H⁺-ATPase aus der Hefe K. lactis^30,31 getestet; Das erhaltene H⁺-ATPase-Präparat war von hoher Reinheit und katalytisch aktiv. Wichtig ist, dass dies ermöglichte, den oligomeren Zustand des Enzyms durch biochemische Methoden aufzulösen, wodurch es sich als Hexamer entpuppte und später durch Kryo-Elektronenmikroskopie bestätigt wurde 31,32,33,34,35. Daher scheint es wahrscheinlich, dass die empfindliche dreidimensionale (3D) Anordnung von Membranproteinen unter relativ rauen Bedingungen während der Reinigung verloren gehen^{kann 36}. Eine biphasische Inaktivierungskinetik wird für H⁺-ATPase während der hitzevermittelten Inaktivierung beobachtet²⁹. In Hefezellen, wie in vielen anderen Organismen, reichert sich das Disaccharid Trehalose in hohen Konzentrationen unter Umweltstressbedingungen an 37,38,39. Trehalose erhält die Integrität der Membran und die Transportfunktion aufrecht, indem sie Proteine (sowohl membraneingebettete als auch zytosolische) und Zellmembranen stabilisiert^40,41. Der stabilisierende Mechanismus von Trehalose wurde von mehreren Gruppen und von unserem Labor ausführlich untersucht ^42,43,44,45. Experimente mit der H⁺-ATPase und anderen Enzymen haben gezeigt, dass Trehalose der effektivste Proteinstabilisator unter den Mono- und Disacchariden ist^28,29. Dies führte zur Aufnahme in das H⁺-ATPase-Aufreinigungsprotokoll³⁰. In jüngster Zeit wurde Trehalose auch bei der Reinigung des sarkoplasmatischen Retikulums Ca²⁺-ATPase (SERCA) aus schnell zuckenden Kaninchenmuskeln mit guten Ergebnissen in Bezug auf Proteinreinheit und -aktivität verwendet⁴⁶. Daher scheint Trehalose ein gutes und geeignetes Additiv für die Aufreinigung von P-Typ-ATPasen und wahrscheinlich anderen Membran- und zytosolischen Proteinen zu sein.

Für P-ATPasen ist das Vorhandensein struktureller zytoplasmatischer Domänen ein experimenteller Vorteil, insbesondere für Substrat/Liganden-Interaktionsstudien⁴⁷; Die ATP-Bindung wurde in hochreinen rekombinanten N-Domänen ^untersucht 47,48,49, wodurch die technischen Überlegungen zur Reinigung ganzer Membranenzyme 47,48,50 u.a. 51 entfallen. Leider benötigen einige funktionelle (katalytische/Energieumwandlung) und strukturelle (Anordnung der Untereinheiten und Wechselwirkung mit anderen Proteinen) Studien immer noch die gesamte P-ATPase^52,53. In dieser Hinsicht wurde die Reinigung von SERCA von mehreren Forschungsgruppen erreicht 54,55,56,57,58. Es können jedoch immer noch Verbesserungen umgesetzt werden⁴⁶, z. B. die Erhöhung der Unversehrtheit der gereinigten ATPase⁵⁹, die Vermeidung der Denaturierung/Zerstörung von Proteinkomplexen²⁵, die Erhöhung der Solubilisierung ohne Denaturierung des Membranproteins (d. h. die Vermeidung der Bildung makromolekularer Aggregate)⁶⁰, die zu einer besseren Kompatibilität mit Assays und anderen nachgelagerten Analysemethoden^{führen 61} Darüber hinaus müssen neue experimentelle Strategien, Additive, Enzyminhibitoren usw. in der wissenschaftlichen Literatur 61,62,63,64,65,66 manchmal mit der gesamten P-ATPase getestet werden. Diese Arbeit beschreibt das Protokoll für die Aufreinigung von SERCA und die Verwendung von Trehalose als Additiv zur Stabilisierung der Proteinstruktur und der ATPase-Aktivität; D.h. neben der Erhöhung der (strukturellen) Qualität des Enzyms trägt Trehalose dazu bei, den Verlust der Enzymstruktur und -aktivität während der Enzymisolierung und -lagerung zu verhindern, was dazu beiträgt, biologisches Material zu sparen und somit die Anzahl der Enzymreinigungen zu reduzieren.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen und lokalen (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) Richtlinien für den Umgang mit Tieren in Versuchslaboratorien 51,67,68 durchgeführt. Das Muskelgewebe wurde von Wildtyp-Oryctolagus cuniculus aus einer lokalen Tierhandhabungseinheit gewonnen (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)⁴⁶. Ein Tierarzt mit Erfahrung in der Haltung von Versuchstieren führte die erste Muskeldissektion und -aufbereitung durch. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung des sarkoplasmatischen Retikulums aus dem schnell zuckenden Kaninchenmuskel (Timing, 7 - 9 h)

HINWEIS: Einzelheiten zum Verfahren finden Sie in Champeil et ^al.69.

1. Gewinnen Sie schnell zuckendes Muskelgewebe (~70 g von beiden Hinterbeinen pro Tier) von Wildtyp Oryctolagus cuniculus.
   HINWEIS: Eine vorherige visuelle Identifizierung der zu präparierenden Muskeln ist erforderlich^70,71.
2. Mazerieren Sie den schnell zuckenden Muskel in einem Mixer, indem Sie ihn in drei Volumina von 100 mM KCl suspendieren, mit 1 Minute an und 1 Minute in eiskalter Ruhe, wiederholen Sie dreimal⁷².
3. Entfernen Sie die Gewebereste durch Zentrifugation (1500 × g) bei 4 °C für 5 Minuten; Bei Bedarf wird eine zweite Zentrifugation (4200 × g) durchgeführt.
4. Der Überstand wird aufgefangen und mit einer Gewebemühle homogenisiert (10 Hübe bei niedriger Geschwindigkeit, d. h. 500-1.500 U/min)^72,73. Das Homogenat (10.000 × g) bei 4 °C 15 min zentrifugieren.
   HINWEIS: Beim Homogenisieren ist Vorsicht geboten, da die Verwendung einer relativ hohen Drehzahl zu Schäden an der Anlage und dem Bediener führen kann.
5. Der Überstand (mit dem sarkoplasmatischen Retikulum) (33.000 × g) wird 120 min lang bei 4 °C zentrifugiert.
6. Die Pellets in 40 mL mit 0,5 M Saccharose suspendieren und 15 min (12.000 × g) bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand (0,6 M KCl und 0,15 M Saccharose) wird verdünnt und die Suspension (34.000 × g) bei 4 ΰC 165 min lang zentrifugiert.
7. Suspendieren Sie das Pellet mit den Vesikeln des sarkoplasmatischen Retikulums (SRVs) in 0,3 M Saccharose, 0,1 M KCl und 5 mM Tris-HCl, pH 7,0. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung des Lowry-Assays⁷⁴ und humanem Serumalbumin als Proteinstandard.
8. Aliquotieren Sie die SRVs (30-32 mg/ml) in 1 ml Volumen. Lagern Sie die SRV-Proben zur weiteren Verarbeitung bei -72 °C.
   HINWEIS: Die Proteinausbeute beträgt 100-110 mg SRVs pro Tier.

2. SERCA-Reinigung (Zeitmessung, 18 - 20 h)

HINWEIS: Für Einzelheiten zum Verfahren siehe Rivera-Morán et ^al.46.

1. Verdünnen Sie die SRV-Suspension auf 2 mg Protein/ml mit eiskalten 75 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M KCl, 6 mM EDTA, 1 mM EGTA und 0,1 % (w/v) Desoxycholat (DOC). Inkubieren Sie die SRV-Suspension 10 Minuten lang auf Eis und unter leichtem Rühren. Die SRV-Suspension (100.000 × g) wird 60 min lang bei 4 °C zentrifugiert.
   HINWEIS: DOC sollte tropfenweise hinzugefügt werden.
2. Suspendieren Sie die Pellets in <3 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M KCl, 45 % Glycerin (v/v) und 2 mM EDTA. Homogenisieren Sie die Suspension und stellen Sie sie auf ein Endvolumen von 10 mL ein. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und stellen Sie sie dann auf 6,5 mg/ml ein. Fügen Sie Azolectin in einer Menge von 5 mg/ml und 0,85 (w/w) Zwittergent 3-14 hinzu.
   HINWEIS: Azolectin und Zwittergent 3-14 sollten tropfenweise hinzugefügt werden.
3. Suspension und Zentrifuge (100.000 × g) bei 4 °C für 60 min homogenisieren. Den Überstand auffangen und 1:2 mit 2 mM EGTA (pH 7,2) verdünnen.
4. Gießen Sie die Suspension vorsichtig auf einen diskontinuierlichen Trehalose-Konzentrationsgradienten (45, 40, 35 und 30 % w/v) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,1 % Desoxycholat und 1 mg/ml Azolektin. Zentrifugieren (100.000 × g) bei 4 °C für 14 h. Sammeln Sie das durchsichtige, leicht gelbliche Kügelchen, das sich am Boden der Röhrchen gebildet hat.
   HINWEIS: Sowohl die Bildung des Trehalose-Gradienten als auch die Zugabe der Probensuspension müssen mit geeigneten Techniken durchgeführt werden. Eine Zentrifugation über Nacht wird empfohlen.
5. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem kleinen Volumen (<1,5 ml) von 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M KCl, 45 % Glycerin und 2 mM EDTA. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Passen Sie die Proteinkonzentration durch Verdünnung auf 2 mg/ml an. Nehmen Sie Aliquote (~50 μL) der Suspension und lagern Sie das gereinigte SERCA bei -72 °C bis zu seiner Verwendung.
6. Durchführung einer SDS-PAGE des gereinigten SERCA⁷² und von Proteinproben, die in verschiedenen Reinigungsschritten entnommen wurden. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue⁷².
   HINWEIS: Die Verwendung von 0,6 M Trehalose anstelle von Glycerin im Suspensionspuffer erhöht die Stabilität des Enzyms während der Lagerung und der Gefrier-Tau-Zyklen^28,29.

3. Assay für ATPase-Aktivität (Timing, 1 - 2 h)

1. Enzymgekoppelter Assay: ATPase-Piruvat-Kinase-Lactat-Dehydrogenase
   1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch (1 mL) vor: 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 5 mM Phosphoenolpyruvat, 250 μM NADH. Variable ATP-Konzentrationen (0,001 bis 0,25 mM) einschließen.
   2. Der Reaktionsassay wird vorsichtig durch Vortexen homogenisiert. Inkubieren Sie den Reaktionsassay 10 Minuten lang bei 37 μC. Fügen Sie 0,9 U L-Lactat-Dehydrogenase (LDH) und 1,5 U Pyruvatkinase (PK) hinzu.
   3. Initiieren Sie die ATPase-Reaktion durch Zugabe von 10 μg SERCA.
   4. Bestimme die Bildung von NADH. Die Änderung der Absorptionsintensität wird jede Sekunde für 600 s bei einer Wellenlänge (λ) von 340 nm über die Zeit mit einem Spektralphotometer mit einem thermostatisierten Küvettenhalter verfolgt.
      HINWEIS: Das Zeitintervall für die Absorptionsmessung kann variieren, aber versuchen Sie, so viele Datenpunkte wie möglich aufzuzeichnen, um die anfängliche Gerade der ATPase-Reaktion zu zeichnen.
2. Bestimmen Sie die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse
   HINWEIS: Für Einzelheiten zum Verfahren siehe Rivera-Morán et ^al.46.
   1. Berechnen Sie den Steigungswert (Δabs/min) des linearen Anteils in jeder gebildeten Kurve. Verwenden Sie den molaren Extinktionskoeffizienten (ε) von NADH (λ = 6.220 ^M-1·cm-1), um die ATPase-Aktivität zu bestimmen (μmol ATP hydrolysiert/min.mg prot.)
3. Bestimmung der Kinetikparameter K_{, m} und V_max
   1. Plotten Sie die Geschwindigkeitsdaten im Vergleich zur ATP-Konzentration mithilfe von Datenanalyse- und Grafiksoftware.
   2. Passen Sie die Daten durch nichtlineare Regression an die Michaelis-Menten-Gleichung (Gl. 1)⁴⁶ an:
      
      wobei v die Geschwindigkeit, V_max die maximale Geschwindigkeit, [S] die ATP-Konzentration und K_m die Michaelis-Menten-Konstante ist.
   3. Bestimmen Sie K_{m und} V_max durch Iteration.
      HINWEIS: Die Aufnahme von DOC kann die ATPase-Ratenreaktion erhöhen; Es wird empfohlen, verschiedene DOC-Konzentrationen zu testen, um das Optimum zu finden.

4. Markierungsassay von SERCA mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (Timing, 30 - 45 min, nur für FITC-Markierung)

HINWEIS: Einzelheiten zum Verfahren finden Sie unter 54,75,76.

1. SERCA (20 μg) wird in 50 μl (Endvolumen) Markierungspuffer (100 mM KCl, 5 mM MgCl₂ und 30 mM Tris-HCl, pH 8,9) mit 1 mM FITC suspendiert. Durch Vortexen mischen.
2. Inkubieren Sie die Proben zu verschiedenen Zeiten (15 min, 10 min, 7 min, 5 min und 2 min) im Dunkeln und bei Raumtemperatur.
3. Stoppen Sie die Markierungsreaktion durch Zugabe von 1 Volumen eiskaltem Stopppuffer (480 mM Saccharose und 48 mM MOPS, pH 7,0), der ATP (5 mM) enthält. 5 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
4. Unterwerfen Sie die mit dem FITC-Etikett versehene SERCA SDS-PAGE⁷². Setzen Sie die klaren Gele UV-Licht (λ = 302 nm) aus. Fotodokumentieren Sie das Ergebnis.
5. Färben Sie das Gel mit Coomassie blue. Fotodokumentieren Sie das Ergebnis.
   HINWEIS: Die Durchführung der FITC-Markierung in einem dunklen Raum kann die Qualität des Fluoreszenzsignals verbessern.

5. Spektren des Zirkulardichroismus (CD) (Timing, 30 min)

HINWEIS: Einzelheiten zum Verfahren finden Sie unter^11,77.

1. SERCA (3 μM) in 400 μl 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 25 °C suspendieren.
2. Laden Sie die Probe in eine Zelle mit einer Schichtdicke von 0,1 cm. Stellen Sie den Bereich der Fern-UV-Spektren λ zwischen 190 und 260 nm ein. Stellen Sie die interne Auflösung und die Bandbreite auf 1 nm ein.
3. Nehmen Sie das CD-Signal mit 50 nm/min bei 25 °C auf.

SDS-PAGE von SERCA in verschiedenen Stadien der Reinigung (Abbildung 1). Das blau gefärbte Coomassie-Gel zeigt die Anreicherung der SERCA-Proteinbande (scheinbares Molekulargewicht >100 kDa) im Verlauf des Aufreinigungsprotokolls. Die Proteinbande, die SERCA entspricht, zeigt nach Zentrifugation auf einem Trehalose-Konzentrationsgradienten eine Reinheit von >90%. Diagramm der ATP-Hydrolyserate im Vergleich zur ATP-Konzentration (

Die meisten Moleküle und Ionen können die Zellmembranen nicht frei passieren, z. B. benötigt das Proton (H⁺) einen Membrantransporter in der Plasmamembran einer Vielzahl von Organismen und Organellen wie Mitochondrien^83,84. Zellmembranen sind selektiv, und die Moleküle und Ionen, die die Zellmembranen durchqueren, sind vielfältig, so dass verschiedene Arten von Membranproteinen in der Zelle gefunden werden können...

Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Der Autor dankt Edmundo Mata-Morales bei der Bearbeitung des Videos, VM, Valentín de la Cruz-Torres bei der Reinigung der SRVs, Miguel A. Rivera-Moran bei der SERCA-Reinigung und -Analyse und Juan C. Gonzalez-Castro, Franco E. Juarez, Alejandra Nevarez, Nicolas Rocha-Vizuet und Jocelin I. Ramírez-Alonso bei der Videoproduktion. Für die Durchführung dieser Studie wurden keine Gelder, Zuschüsse oder andere Unterstützung erhalten.