Purificación del retículo sarcoendoplásmico Ca²⁺-ATPasa a partir de músculo de conejo

Este protocolo describe un método de purificación SERCA mejorado, que incluye el disacárido trehalosa en el paso final de centrifugación. Este carbohidrato estabiliza las proteínas en condiciones adversas. El SERCA purificado era catalíticamente activo y mostraba una alta pureza, lo que lo hacía adecuado para estudios estructurales y funcionales.

Algunas ATPasas de tipo P, como la Ca²⁺-ATPasa del retículo sarco/endoplásmico (SERCA), son proteínas de membrana inherentemente lábiles que requieren condiciones fisicoquímicas específicas durante la purificación para obtenerlas con alta pureza y calidad estructural y en una forma catalíticamente activa. El disacárido trehalosa es un soluto compatible que se sintetiza y acumula en altas concentraciones en el citoplasma de la levadura para estabilizar las membranas y las proteínas. El uso de trehalosa como aditivo en el protocolo para la purificación de la membrana plasmática H⁺-ATPasa da como resultado una preparación de alta calidad, cuya estructura hexámera se muestra mediante métodos analíticos bioquímicos. Por lo tanto, la trehalosa puede utilizarse como aditivo estabilizador para la purificación de proteínas de membrana (P-ATPasas). Este protocolo describe la modificación del protocolo clásico para la purificación de SERCA mediante el sometimiento de SERCA a centrifugación en un gradiente de concentración de trehalosa. La inclusión de este carbohidrato condujo a la purificación de SERCA en una forma catalíticamente activa con alta pureza y, lo que es más importante, en una forma estable. La caracterización bioquímica parcial del SERCA purificado (SDS-PAGE, cinética de la enzima, marcaje FITC, espectroscopia de dicroísmo circular) mostró que la enzima es adecuada para estudios funcionales y estructurales. Se sugiere el uso de trehalosa en el protocolo de purificación de ATPasas de tipo P y otras proteínas de membrana lábil (y citosólicas).

Las proteínas/enzimas de membrana son componentes biológicos esenciales de las células, ya que desempeñan un papel fundamental en diversos procesos ^1,2,3. Algunas de las funciones pueden incluir el transporte de iones y moléculas dentro y fuera de la célula/compartimentos internos (ya sea activo/pasivo), reconocimiento célula-célula, unión intercelular, anclaje/unión y detección del entorno externo a través de la integración con la maquinaria de transducción de señales en condiciones físicas y químicas normales y duras (alta sal, poca agua, alta temperatura, resistencia a los medicamentos, etc.)³ Por lo tanto, la determinación de la estructura tridimensional (3D) de las proteínas y/o enzimas de membrana se ha vuelto de gran importancia tanto para la investigación básica como para la aplicada ^4,7,6. Es importante destacar que las proteínas/enzimas de membrana se han utilizado ampliamente como objetivos para el descubrimiento de fármacos (ya sea natural o por diseño)^7,8,9. Es decir, las proteínas de membrana tienen una importancia inherente en la salud ^9,10,11.

El carácter hidrofóbico de las proteínas/enzimas de membrana es la propiedad fisicoquímica técnicamente más desafiante para el laboratorio experimental 12,13,14, más aún cuando se trabaja con proteínas de membrana integrales oligoméricas y/o altamente lábiles ^15,16. Es muy deseable el aislamiento de cantidades apropiadas de la proteína/enzima de membrana con la mayor calidad posible para ensayos experimentales funcionales y estudios estructurales¹⁷. Las proteínas de membrana, al ser inherentemente hidrofóbicas, son muy difíciles de purificar, y la elección del detergente suele ser una de las cuestiones más importantes a tener en cuenta 17,18,19,20. En este sentido, los métodos de laboratorio utilizados para aislar las proteínas de membrana suelen causar algún grado de daño en la disposición estructural 3D de la proteína²¹. Algunos de estos métodos incluyen el uso de (a) sonicación (ondas ultrasónicas de alta frecuencia/energía), (b) detergentes solubilizadores de proteínas (ya sean fuertes, medios o suaves)²², (c) presiones relativamente altas en cromatografía en columna y ultracentrifugación de alta velocidad²³, (d) moléculas precipitantes, (e) enzimas digestivas y otros²¹. Todos estos procesos pueden contribuir o ser la causa principal de la desestabilización de proteínas durante la purificación²¹. En este sentido, algunos protocolos parecen funcionar relativamente bien para una proteína de membrana determinada. Sin embargo, la optimización siempre es bienvenida cuando se utilizan nuevos ensayos modernos o métodos que requieren una mayor calidad de preparación de proteínas de membrana para obtener resultados satisfactorios²⁴. Los pasos de optimización pueden incluir, entre otros, mejorar el diseño del constructo, encontrar las condiciones óptimas para la expresión de proteínas de membrana, establecer mejores condiciones de manejo (es decir, pH, temperatura, etc.), encontrar el detergente más compatible, ajustar los pasos de purificación como el tiempo de sonicación, la velocidad de centrifugación, reformular las soluciones tampón mediante la adición de agentes estabilizadores, etc.25,26,27. Por lo tanto, es importante cualquier cambio en la metodología de purificación que conduzca a un aumento en la calidad (pureza) y la actividad de la proteína/enzima de membrana purificada.

En la familia de las ATPasas de tipo P, la membrana plasmática de levadura H⁺-ATPasa parece ser uno de los miembros más lábiles^28,29. La H⁺-ATPasa pierde su actividad hidrolizante de ATP tras la deshidratación (liofilización), choque térmico, ^etc.28,29. El uso de trehalosa como estabilizador de proteínas se probó en el aislamiento de la membrana plasmática H⁺-ATPasa de la levadura K. lactis^30,31; la preparación de H⁺-ATPasa obtenida fue de alta pureza y catalíticamente activa. Es importante destacar que esto permitió resolver el estado oligomérico de la enzima por métodos bioquímicos, revelando que se trataba de un hexámero y posteriormente confirmado por criomicroscopía electrónica 31,32,33,34,35. Por lo tanto, parece probable que la delicada disposición tridimensional (3D) de las proteínas de membrana pueda perderse en condiciones relativamente duras durante la purificación³⁶. Se observa una cinética de inactivación bifásica para la H⁺-ATPasa durante la inactivación mediada por calor²⁹. En las células de levadura, como en muchos otros organismos, el disacárido trehalosa se acumula en altas concentraciones en condiciones de estrés ambiental 37,38,39. La trehalosa mantiene la integridad de la membrana y la función de transporte mediante la estabilización de las proteínas (tanto incluidas en la membrana como citosólicas) y las membranas celulares^40,41. El mecanismo estabilizador de la trehalosa ha sido ampliamente estudiado por varios grupos y por nuestro laboratorio ^42,43,44,45. Los experimentos con la H⁺-ATPasa y otras enzimas han demostrado que la trehalosa es el estabilizador proteico más eficaz entre los monosacáridos y disacáridos^28,29. Esto llevó a su inclusión en el protocolo de purificación de H⁺-ATPasa³⁰. Recientemente, la trehalosa también se ha utilizado en la purificación del retículo sarcoplásmico Ca²⁺-ATPasa (SERCA) del músculo de contracción rápida de conejo con buenos resultados en pureza proteica y actividad⁴⁶. Por lo tanto, la trehalosa parece ser un aditivo bueno y apropiado para la purificación de ATPasas de tipo P y probablemente otras proteínas de membrana y citosólicas.

En el caso de las P-ATPasas, la existencia de dominios citoplasmáticos estructurales es una ventaja experimental, especialmente para los estudios de interacción sustrato/ligando⁴⁷; La unión de ATP se ha estudiado en dominios N recombinantes de alta pureza ^47,48,49, eliminando así las consideraciones técnicas para la purificación de enzimas de membrana completa 47,48,50, entre otras⁵¹. Desafortunadamente, algunos estudios funcionales (catalíticos/conversión de energía) y estructurales (disposición de subunidades e interacción con otras proteínas) aún requieren la P-ATPasa^52,53 completa. En este sentido, la purificación de SERCA ha sido lograda por varios grupos de investigación 54,55,56,57,58. Sin embargo, aún se pueden implementar mejoras⁴⁶, por ejemplo, aumentar la integridad de la ATPasa⁵⁹ purificada, evitar la desnaturalización/disrupción de los complejos proteicos²⁵, aumentar la solubilización sin desnaturalización de la proteína de membrana (es decir, evitar la formación de agregados macromoleculares)⁶⁰, conducir a una mejor compatibilidad con ensayos y otros métodos analíticos posteriores⁶¹ Además, a medida que aparecen en la literatura científica nuevas estrategias experimentales, aditivos, inhibidores enzimáticos, etc. 61,62,63,64,65,66, en ocasiones es necesario probarlas con la P-ATPasa completa. En este trabajo se describe el protocolo para la purificación de SERCA y el uso de trehalosa como aditivo para estabilizar la estructura proteica y la actividad de la ATPasa; Es decir, además de aumentar la calidad (estructural) de la enzima, la trehalosa ayuda a prevenir la pérdida de estructura y actividad enzimática durante el aislamiento y almacenamiento de la enzima, lo que ayuda a ahorrar material biológico y, por lo tanto, a reducir el número de purificaciones enzimáticas.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos internacionales y locales (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) para el manejo de animales en laboratorios experimentales 51,67,68. El tejido muscular se obtuvo de Oryctolagus cuniculus de tipo silvestre de una unidad local de manejo de animales (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)⁴⁶. Un veterinario con experiencia en el manejo de animales de laboratorio realizó la disección y el procesamiento muscular inicial. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento del retículo sarcoplásmico del músculo de conejo de contracción rápida (Temporización, 7 - 9 h)

NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Champeil et ^al.69.

1. Obtenga tejido muscular de contracción rápida (~70 g de ambas patas traseras por animal) del Oryctolagus cuniculus de tipo salvaje.
   NOTA: Se requiere la identificación visual previa de los músculos a diseccionar^70,71.
2. Macerar el músculo de contracción rápida en una licuadora suspendiéndolo en tres volúmenes de 100 mM de KCl, con 1 min encendido y 1 min en reposo helado, repetir tres veces⁷².
3. Eliminar los restos de tejido por centrifugación (1500 × g) a 4 °C durante 5 min; Si es necesario, se realiza una segunda centrifugación (4200 × g).
4. Recoger el sobrenadante y homogeneizarlo con una trituradora de tejidos (10 golpes a baja velocidad, es decir, 500-1.500 rpm)^72,73. Centrifugar el homogeneizado (10.000 × g) a 4 °C durante 15 min.
   NOTA: Se debe tener cuidado al homogeneizar, ya que el uso de una velocidad relativamente alta puede provocar daños en el sistema y en el operador.
5. Centrifugar el sobrenadante (que contiene el retículo sarcoplásmico) (33.000 × g) a 4 °C durante 120 min.
6. Suspender los pellets en 40 mL de 0,5 M de sacarosa y centrifugar (12.000 × g) a 4 °C durante 15 min. Diluir el sobrenadante (0,6 M de KCl y 0,15 M de sacarosa) y centrifugar la suspensión (34.000 × g) a 4 °C durante 165 min.
7. Suspenda el pellet que contiene las hojas de las vesículas del retículo sarcoplásmico (SRV) en 0,3 M de sacarosa, 0,1 M de KCl y 5 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Determine la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Lowry⁷⁴ y la albúmina sérica humana como patrón de proteína.
8. Alícuota los SRV (30-32 mg/mL) en volumen de 1 mL. Almacene las muestras de SRV a -72 °C para su posterior procesamiento.
   NOTA: El rendimiento de proteína es de 100-110 mg SRV por animal.

2. Purificación SERCA (Temporización, 18 - 20 h)

NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Rivera-Morán et ^al.46.

1. Diluya la suspensión de SRV a 2 mg de proteína/mL usando 75 mM de Tris-HCl helado, pH 7.2, 0.6 M de KCl, 6 mM de EDTA, 1 mM de EGTA y 0.1% (p/v) de desoxicolato (DOC). Incubar la suspensión de SRV en hielo durante 10 minutos y agitar suavemente. Centrifugar la suspensión del SRV (100.000 × g) a 4 °C durante 60 min.
   NOTA: El DOC debe agregarse gota a gota.
2. Suspenda los gránulos en <3 mL de 25 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M de KCl, 45% de glicerol (v/v) y 2 mM de EDTA. Homogeneizar la suspensión y ajustar a un volumen final de 10 mL. Determine la concentración de proteínas y luego ajústela a 6.5 mg/mL. Añadir azolectina a 5 mg/mL y Zwittergent 3-14 (p/p) 0,85 (p/p).
   NOTA: Azolectin y Zwittergent 3-14 deben agregarse gota a gota.
3. Homogeneizar la suspensión y la centrífuga (100.000 × g) a 4 °C durante 60 min. Recoger el sobrenadante y diluir 1:2 con 2 mM de EGTA (pH 7,2).
4. Vierta la suspensión suavemente sobre un gradiente de concentración de trehalosa discontinuo (45, 40, 35 y 30% p/v) en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 0,1% de desoxicolato y 1 mg/mL de azolectina. Centrífuga (100.000 × g) a 4 °C durante 14 h. Recoja la bolita transparente y ligeramente amarillenta que se forma en la parte inferior de los tubos.
   NOTA: Tanto la formación del gradiente de trehalosa como la adición de la suspensión de la muestra deben realizarse utilizando técnicas adecuadas. Se recomienda la centrifugación durante la noche.
5. Suspenda suavemente el pellet en un pequeño volumen (<1,5 mL) de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 de M KCl, 45% de glicerol y 2 mM de EDTA. Determinar la concentración de proteínas. Ajustar la concentración de proteínas por dilución a 2 mg/mL. Tome alícuotas (~50 μL) de la suspensión y almacene el SERCA purificado a -72 °C hasta su uso.
6. Realizar SDS-PAGE del SERCA⁷² purificado, y de muestras de proteínas tomadas en diferentes etapas de purificación. Tiñe el gel con Coomassie Blue⁷².
   NOTA: El uso de trehalosa 0,6 M en lugar de glicerol en el tampón de suspensión aumenta la estabilidad de la enzima durante los ciclos de almacenamiento y congelación-descongelación^28,29.

3. Ensayo de la actividad de la ATPasa (Temporización, 1 - 2 h)

1. Ensayo acoplado a enzimas: ATPasa-piruvato quinasa-lactato deshidrogenasa
   1. Prepare la mezcla de reacción (1 mL): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 5 mM fosfoenolpiruvato, 250 μM NADH. Incluyen concentraciones variables de ATP (0,001 a 0,25 mM).
   2. Homogeneizar cuidadosamente el ensayo de reacción por vórtice. Incubar el ensayo de reacción a 37 ◦C durante 10 min. Añadir 0,9 U de L-lactato deshidrogenasa (LDH) y 1,5 U de piruvato quinasa (PK).
   3. Iniciar la reacción de ATPasa mediante la adición de 10 μg de SERCA.
   4. Determinar la formación de NADH. Siga el cambio en la intensidad de la absorbancia cada segundo durante 600 s a una longitud de onda (λ) de 340 nm a lo largo del tiempo utilizando un espectrofotómetro con un soporte de celda termostático.
      NOTA: El intervalo de tiempo para la medición de la absorbancia puede variar, pero intente registrar tantos puntos de datos como sea posible para dibujar la línea recta inicial de la reacción de ATPasa.
2. Determinar la tasa de hidrólisis de ATP
   NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Rivera-Morán et ^al.46.
   1. Calcule el valor de la pendiente (Δabs/min) de la porción lineal en cada curva formada. Utilice el coeficiente de extinción molar (ε) de NADH (λ = 6,220 M⁻¹·cm⁻¹) para determinar la actividad de la ATPasa (μmoles de ATP hidrolizado/min.mg prot.)
3. Determinar los parámetros cinéticos K,_m y V_max
   1. Trace los datos de velocidad frente a la concentración de ATP utilizando software de análisis de datos y gráficos.
   2. Ajuste los datos por regresión no lineal a la ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 1)⁴⁶:
      
      donde v es la velocidad, V_max es la velocidad máxima, [S] es la concentración de ATP y K_m es la constante de Michaelis-Menten.
   3. Determine K_{, m} y V_max por iteración.
      NOTA: La inclusión de DOC puede aumentar la respuesta de la tasa de ATPasa; Se recomienda probar diferentes concentraciones de DOC para encontrar el óptimo.

4. Ensayo de marcaje de SERCA con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Tiempo, 30 - 45 min, solo para el etiquetado FITC)

NOTA: Para obtener detalles sobre el procedimiento, consulte 54,75,76.

1. Suspender SERCA (20 μg) en 50 μL (volumen final) de tampón de etiquetado (100 mM de KCl, 5 mM de MgCl₂ y 30 mM de Tris-HCl, pH 8,9) que contenga 1 mM de FITC. Mezclar por vórtice.
2. Incubar las muestras en diferentes momentos (15 min, 10 min, 7 min, 5 min y 2 min) en la oscuridad y a temperatura ambiente.
3. Detenga la reacción de etiquetado añadiendo 1 volumen de tampón de parada helado (480 mM de sacarosa y 48 mM de MOPS, pH 7,0), que contenga ATP (5 mM). Incubar en hielo durante 5 minutos en la oscuridad.
4. Sumeta el SERCA etiquetado por FITC a SDS-PÁGINA⁷². Exponga los geles transparentes a la luz ultravioleta (λ = 302 nm). Fotodocumenta el resultado.
5. Tiñe el gel con azul Coomassie. Fotodocumenta el resultado.
   NOTA: Realizar el marcaje FITC en una habitación oscura puede mejorar la calidad de la señal de fluorescencia.

5. Espectros de dicroísmo circular (CD) (Temporización, 30 min)

NOTA: Para obtener más información sobre el procedimiento, consulte^11,77.

1. Suspender SERCA (3 μM) en 400 μL de tampón fosfato de 10 mM (pH 7,0) a 25 °C.
2. Cargue la muestra en una celda de 0,1 cm de longitud de trayectoria. Establezca el rango de espectros UV lejanos λ entre 190-260 nm. Establezca la resolución interna y el ancho de banda en 1 nm.
3. Grabe la señal de CD a 50 nm/min a 25 °C.

SDS-PAGE de SERCA en diferentes etapas de purificación (Figura 1). El gel teñido de azul de Coomassie muestra el enriquecimiento de la banda de proteína SERCA (peso molecular aparente >100 kDa) a medida que avanza el protocolo de purificación. La banda de proteínas correspondiente a SERCA muestra una pureza del >90% después de la centrifugación en un gradiente de concentración de trehalosa. Gráfico de la tasa de hidrólisis de ATP frente a ...

La mayoría de las moléculas e iones no pueden atravesar libremente las membranas celulares, por ejemplo, el protón (H⁺) requiere un transportador de membrana en la membrana plasmática de una variedad de organismos y orgánulos como las mitocondrias^83,84. Las membranas celulares son selectivas y las moléculas e iones que atraviesan las membranas celulares son diversos, por lo que se pueden encontrar varios tipos de...

El autor declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.

El autor agradece la ayuda de Edmundo Mata-Morales en la edición del video, VM, Valentín de la Cruz-Torres en la purificación de los SRV, Miguel A. Rivera-Moran en la purificación y análisis de SERCA, y Juan C. González-Castro, Franco E. Juárez, Alejandra Nevarez, Nicolás Rocha-Vizuet y Jocelin I. Ramírez-Alonso en la producción del video. No se recibieron fondos, subvenciones u otro tipo de apoyo para llevar a cabo este estudio.