Évaluation de gènes anormaux liés à la croissance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques en combinant la technologie CRISPR/Cas9 avec le comptage cellulaire

Ici, nous présentons un protocole qui intègre la technologie CRISPR/Cas9 avec le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour identifier les gènes candidats qui sont cruciaux pour la capacité de prolifération anormale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices.

Les cellules souches hématopoïétiques possèdent la capacité de s’auto-renouveler à long terme et le potentiel de se différencier en divers types de cellules sanguines matures. Cependant, l’accumulation de mutations cancéreuses dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) peut bloquer la différenciation normale, induire une prolifération aberrante et, finalement, conduire à la leucémogenèse. Pour identifier et/ou évaluer les mutations cancéreuses, nous avons intégré la technologie CRISPR/Cas9 au test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) afin d’étudier un gène modèle Trp53, essentiel à la capacité de prolifération anormale des HSPC. Plus précisément, des cellules de moelle osseuse enrichies pour les HSPC de souris Cas9 ont été récoltées puis soumises à une transfection virale avec des ARN à guide unique (ARNg) ciblant un ou plusieurs gènes candidats pour introduire des altérations génétiques dans les HSPC. Ensuite, un test CCK-8 a été effectué pour étudier la capacité proliférative des HSPC transfectés. L’efficacité du ciblage de l’ARNsg a été confirmée par un test de suivi des indels par décomposition. Ces gènes identifiés pourraient jouer un rôle crucial dans la leucémogenèse et pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles.

L’hématopoïèse, qui produit toutes les lignées de cellules sanguines tout au long de la vie, est maintenue par une petite population appelée cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH se maintiennent par auto-renouvellement et produisent divers progéniteurs engagés qui donnent naissance à des cellules sanguines fonctionnelles entièrement différenciées ^1,2,3. Ce processus est étroitement réglementé. Cependant, l’accumulation de mutations cancéreuses dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) entrave la différenciation normale, confère une capacité de prolifération anormale et, en fin de compte, transforme les HSPC en cellules initiatrices de leucémie (LIC)4,5,6,7. L’identification et la confirmation des mutations leucémiques restent encore un grand défi pour la recherche sur le cancer.

Récemment, le système CRISPR/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR-associated protein 9) a été développé et est devenu une méthode d’édition de gènes efficace et précise, composée de la nucléase Cas9 et de l’ARN guide unique (ARNsg)⁸. L’ARNsg guide le complexe Cas9-ARNsg vers un emplacement génomique spécifique grâce à la complémentarité ARN-ADN, où la nucléase Cas9 induit des cassures double brin. L’ADN brisé est soumis à des mécanismes endogènes d’édition de gènes, soit par une réparation précise dirigée par l’homologie en présence de matrices d’homologie, soit par une jonction d’extrémités non homologues sujette aux mésappariements, ce qui conduit à de petites insertions ou délétions⁹. Actuellement, le système CRISPR/Cas9 est devenu un outil puissant pour l’édition de gènes ciblée et la régulation transcriptionnelle¹⁰.

Ici, nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour introduire des altérations génétiques dans les HSPC, puis nous avons effectué le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour déterminer si les mutations introduites étaient critiques pour la prolifération anormale des HSPC. Plus précisément, les cellules de moelle osseuse enrichies pour les HSPC ont été prélevées sur des souris Cas9, suivies d’une transfection virale avec des ARNsg ciblant les gènes candidats. Ensuite, le test CCK-8 a été effectué pour déterminer si les mutations conféraient une capacité de prolifération accrue aux HSPC transfectées. Enfin, les mutations introduites par CRISPR/Cas9 ont été confirmées par le Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹¹ ou la séquence profonde ciblée¹². Ce protocole constitue un outil puissant pour évaluer les mutations cancéreuses et les cibles thérapeutiques potentielles de la leucémie.

Toutes les expériences sur les animaux menées dans le cadre de ce protocole ont été approuvées par le Comité de protection et de bien-être des animaux de l’Université de médecine chinoise de Pékin.

1. Construction de plasmides d’ARNsg ciblant les gènes candidats (4 - 5 jours)

1. Concevez le ciblage de l’ARNsg à l’aide d’outils de conception d’ARNsg en ligne. Entrez la séquence d’ADN génomique cible dans un outil de conception d’ARNsg en ligne (par exemple, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Sélectionnez les cibles d’ARNsg appropriées et commandez les oligonucléotides nécessaires.
2. Préparez les inserts d’oligo-ARNg. Remettre en suspension les brins supérieur et inférieur des oligonucléotides conçus pour chaque ARNsg (étape 1.1) jusqu’à une concentration finale de 100 μM. Préparer les mélanges conformément au tableau 1 pour phosphoryler et recuire les oligonucléotides d’ARNsg. Utilisez les paramètres de thermocyclage suivants : 37 °C pendant 30 min ; 95 °C pendant 5 min ; descendre à 25 °C à 5 °C min⁻¹.
3. Ajouter 1 μL d’oligos phosphorylés et recuits à 199 μL de ddH₂O à température ambiante pour obtenir un rapport de dilution de 1:200.
4. Linéariser le plasmide vecteur.
   1. À l’aide du vecteur squelette référencé (voir le tableau des matériaux), digérer le plasmide du vecteur à l’aide de l’enzyme de restriction Esp3I (BsmBI). Préparer les réactions selon le tableau 1 et incuber à 55 °C pendant 1 h.
   2. Ajouter 0,5 μL de phosphatase alcaline de crevette (rSAP) dans le même tube et incuber à 37 °C pendant 30 minutes pour réduire la probabilité d’auto-conjugaison du plasmide linéaire.
   3. Vérifiez si la linéarisation est réussie. Chargez les plasmides linéarisés et les plasmides non coupés pour l’électrophorèse sur un gel d’agarose à 0,8-1 % (p/v).
   4. Purifier le plasmide linéarisé à l’aide d’un kit de purification PCR, éluer en 20 μL de ddH₂O, et quantifier la concentration en ADN.
5. Clonez les oligonucléotides de l’ARNsg dans le plasmide du vecteur en configurant les réactions de ligature pour chaque ARNsg conformément au tableau 1. Incuber à 16 °C pendant 4 h.
6. Pour la transformation, ajoutez 10 μL du produit de l’étape 1.5 dans 50 μL de cellules Stbl3 compétentes pour le glaçage, incubez le mélange sur de la glace pendant 30 min, soumettez-le à un choc thermique à 42 °C pendant 90 s, puis remettez-le rapidement dans la glace pendant 2 min. Ajoutez 200 μL de milieu LB sans antibiotique dans le même tube, agitez à 220 tr/min pendant 30 min à 37 °C, puis déposez-le sur une plaque LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber les plaques toute la nuit à 37 °C.
7. Le lendemain, examinez les plaques pour la croissance des colonies. Dans chaque plaque, sélectionnez 6 à 8 colonies et vérifiez l’insertion correcte de l’ARNsg à l’aide de la PCR de colonie. Sélectionner les colonies positives et inoculer les colonies individuelles dans 5 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline à l’aide d’une pointe de pipette stérile. Incuber et agiter la culture à 37 °C pendant la nuit.
8. Isolez l’ADN plasmidique des cultures à l’aide d’un mini kit de purification d’ADN plasmidique. Séquence à partir du promoteur U6 pour s’assurer que la séquence guide de 20 dents est correctement insérée.

2. Emballage lentiviral (2 - 3 jours)

1. Culture de cellules HEK 293T dans un milieu DMEM complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % (v/v) de solution de pénicilline-streptomycine à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Passez les cellules HEK293T en aspirant l’ancien milieu de la boîte de Pétri et lavez doucement la boîte 2x avec 3 mL de PBS. Ajouter 1 mL de trypsine dans une parabole de 10 cm et l’incuber à 37 °C pendant 1 min. Ajoutez 3 ml de milieu DMEM chaud dans la boîte pour inactiver la trypsine, rassemblez les cellules dans un tube de 15 ml et tournez à 800 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu et mettre les cellules dans de nouvelles boîtes au besoin.
   REMARQUE : Utilisez des cellules HEK 293T avec moins de 10 passages pour la production de lentivirus.
3. Seize à 24 h avant la transfection, ensemencer les cellules HEK293T dans des boîtes de 10 cm à une densité de 2 à 4 × 10^{à 6} cellules par boîte. Assurez-vous que le DMEM utilisé est exempt d’antibiotiques.
4. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à 70-80 % le jour de la transfection. Transformer 10 à 15 μg de plasmide par boîte de 10 cm et maintenir le rapport molaire du plasmide à l’IPE de 1:3. Préparez le mélange 1 et le mélange 2 pour la transfection conformément au tableau 2.
5. Laissez reposer le mélange 2 pendant 5 min. Ajoutez le mélange 2 au mélange 1 (attention à ne pas inverser l’ordre d’ajout), mélangez bien, puis laissez reposer pendant 15-20 min.
6. Ajoutez le complexe (étape 2.5) dans les cellules, secouez doucement le plat pour mélanger et incubez dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ . Six à 8 h plus tard, remplacer le milieu par un milieu DMEM (contenant 10 % de FBS).
7. Deux jours après le début de la transfection lentivirale, regrouper les surnageants de lentivirus des plats. Centrifuger à 4 000 × g pendant 10 min à 4 °C et filtrer à travers une membrane de microfiltration de 0,45 μm. Distribuez le lentivirus et conservez-le à -80 °C.
   REMARQUE : Le lentivirus recueilli peut être concentré au besoin. Évitez de réduire les titres viraux en raison de la congélation et de la décongélation répétées.

3. Extraction et culture de cellules de moelle osseuse (12 à 13 jours)

REMARQUE : Toutes les lignées de souris ont été maintenues dans un patrimoine génétique C57BL/6 pur. Des souris LSL-Cas9 (T002249) ont été croisées avec des souris Mx1-Cre¹³ pour générer LSL-Cas9/+ ; souris Mx1-Cre/+. Ici, nous avons collecté des cellules de moelle osseuse de Mx1-Cre/+ ; souris LSL-Cas9/+ et leurs compagnons de portée.

1. Pour induire l’expression de la Cre recombinase, injectez aux souris (âgées de 8 à 12 semaines) par voie intrapéritonéale 150 μL de polyinosinique-polycytidylique (1,5 mg/mL) le jour 1 et le jour 3. Le 6e jour, injecter aux souris par voie intrapéritonéale du 5-fluorouracile (5-FU, 150 mg/kg).
   REMARQUE : Les souris transgéniques Mx1-Cre sont conçues pour exprimer la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur inductible Mx1¹³. L’injection intrapéritonéale de polyinosinique-polycytidylique peut activer efficacement le promoteur Mx1 et induire l’expression de la Cre recombinase¹⁴. L’injection de 5-FU est utilisée pour épuiser les cellules proliférantes dans la moelle osseuse, induisant ainsi l’entrée des CSH dans le cycle cellulaire et entraînant une abondance relative de CSHS¹⁵. Environ 2 à 4 × 10⁶ cellules de moelle osseuse peuvent être récoltées par souris après un traitement au 5-FU.
2. Le 11e jour, sacrifiez les souris par asphyxie au CO₂ . Prélever le fémur et le tibia des souris, rincer la cavité de la moelle osseuse avec du PBS contenant 2 % de FBS à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL, et prélever des cellules de moelle osseuse comme décrit par Gavrilescu et ^coll.16.
   REMARQUE : Transférez les os dans une hotte à flux laminaire dès que le tibia et le péroné sont retirés des souris pour maintenir la stérilité pendant le prélèvement de cellules de la moelle osseuse.
3. Pipetez les cellules de la moelle osseuse de haut en bas (30-50x) pour les disperser en cellules individuelles, puis transférez le mélange de cellules dans un tube de 50 ml, et utilisez un vortex pour bien mélanger.
4. Ajoutez 10 μL de suspension cellulaire à 40 μL de tampon de lyse des érythrocytes et placez-le sur de la glace pendant 5 minutes pour permettre aux érythrocytes de lyser. Ajouter 50 μL de solution de bleu de trypan, bien mélanger et compter les cellules viables.
5. Centrifuger les cellules à 800 × g pendant 15 min à 4 °C. Aspirez le surnageant.
6. Remettre les cellules en suspension à 1-2 × 10⁶ cellules/mL dans le milieu de préstimulation de la moelle osseuse comme décrit dans le tableau 3. Ensemencez les cellules dans des boîtes de 10 cm, 10 ml/plaque, et incubez pendant 24 h.

4. Transfection lentivirale des cellules de la moelle osseuse (2 à 3 jours)

1. Le lendemain, prélevez des cellules des plaques préstimulées. Rincez vigoureusement la plaque avec 5 à 10 ml de PBS contenant 2 % de FBS. Comptez les cellules viables en ajoutant du bleu de trypan comme décrit à l’étape 3.4.
2. Centrifuger les cellules à 800 × g pendant 10 min à température ambiante. Préparez la solution de spinfection virale comme décrit dans le Tableau 4.
3. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans une solution de spinfection fraîchement préparée (∼10⁶ cellules/mL). Ensemencer les cellules en suspension dans une plaque à 6 puits, à raison de 4 mL par puits. Scellez la plaque à 6 puits avec du parafilm et centrifugez-la à 1 500 × g pendant 90 min à 32 °C.
4. Après la centrifugation, remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette (mais ne changez pas de milieu), puis incubez la plaque pendant 4 à 6 h dans un incubateur.
5. Pour la première transfection, aspirez soigneusement autant de milieu surnageant que possible de chaque puits (~3 ml) et ajoutez un volume égal de milieu de préstimulation de la moelle osseuse. Si certaines cellules sont accidentellement aspirées pendant la procédure, centrifuger à 800 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension avec une petite quantité de milieu de préstimulation, puis rajoutez-les dans le puits.
6. Pour la transfection secondaire, le lendemain, prélever 2 à 3 ml de milieu de chaque puits et ajouter un volume égal de solution mère rétrovirale fraîchement décongelée ainsi que des quantités appropriées de HEPES et de polybrène, comme décrit dans le tableau 4. Centrifuger la plaque à 1 500 × g pendant 90 min, 37 °C.
7. Après la centrifugation, remettez doucement les cellules en suspension et continuez à incuber la plaque dans l’incubateur pendant 4 à 6 h.
8. Remplacez le fluide comme à l’étape 4.5. Incuber pendant 24 h.

5. Effectuer un test CCK-8 in vitro (3 à 4 jours)

1. Rincez vigoureusement les puits pour recueillir les cellules de la moelle osseuse. Laver la plaque avec du PBS contenant 2 % de FBS pour obtenir le maximum de cellules. Filtrez les cellules à travers un tamis de 70 μm et comptez les cellules viables avec du bleu trypan comme décrit à l’étape 3.4.
2. Centrifuger les cellules à 800 × g pendant 10 min à température ambiante.
3. Remettre les cellules en suspension avec du DMEM contenant 10 % de FBS et de mIL-3, mIL-6 (10 ng/mL), mSCF (100 ng/mL) à 1 × 10⁵ cellules/mL. Prendre ~0,5-1 × 10⁶ cellules et centrifuger à 800 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant et conservez la pastille cellulaire à -80 °C pour l’extraction de l’ADN génomique.
4. Ajoutez les cellules en plaques de 96 puits à la densité de 1 × 10⁴ cellules par puits. Faites six puits répétés pour chaque groupe. Ajoutez 100 μL de PBS stérile dans un cercle de puits autour des puits où les cellules sont ensemencées. Incuber pendant 0, 24, 48 et 72 h.
5. Aspirez soigneusement le fluide de la plaque à 96 puits au point temporel correspondant. Ajouter 110 μL de milieu contenant 1/10 de volume de CCK-8 dans les puits. Configurez un groupe vide (uniquement moyen et CCK-8, pas de cellules). Incuber dans l’incubateur pendant 1 h.
6. Lisez la valeur d’absorbance de 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre sur microplaques.
7. Utilisez un logiciel statistique pour analyser les données expérimentales et exprimez les données expérimentales sous forme de moyenne ± d’écart-type (moyenne ± écart-type). Analysez les différences entre les deux groupes à l’aide du test t d’échantillons indépendants, avec P < 0,05 indiquant une différence statistiquement significative.

6. Vérification de l’édition génomique (5 à 7 jours)

1. Extrayez l’ADN génomique (étape 5.3) à l’aide d’un kit de purification d’ADN génomique selon les recommandations du fabricant.
2. Concevez des amorces qui amplifient la région de 200 à 500 pb centrée autour du site de coupure de l’ARNsg (tableau 5).
3. Pour le séquençage de Sanger, préparez le mélange comme dans le tableau 6 pour la PCR. Amplifiez les fragments de gènes cibles à l’aide d’un thermocycleur comme suit : 95 °C pendant 5 min, 40 cycles (95 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 9 s), 72 °C pendant 10 min, 4 °C ∞.
   REMARQUE : L’édition génomique peut également être vérifiée à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS), et le produit PCR doit être purifié à l’aide d’un kit de purification pour NGS.
4. Analysez les résultats du séquençage de Sanger sur le site web TIDE (http://tide.nki.nl). Calculez l’efficacité d’édition de l’ARNsg en saisissant la séquence de l’ARNsg et les résultats de séquençage des groupes expérimentaux et témoins dans cet outil en ligne.
   REMARQUE : Analysez les résultats NGS à l’aide de CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷. Entrez des lectures appariées (deux fichiers) ou des lectures à une extrémité (fichier unique) au format fastq ou fastq.gz à partir d’une expérience de séquençage profond, ainsi qu’une séquence de référence et une séquence d’ARNsg. Le logiciel évaluera et quantifiera la mutagénèse ciblée.

Effet de l’inactivation de Trp53 sur la capacité proliférative des HSPC de souris
Ici, nous avons utilisé l’inactivation Trp53 comme exemple pour démontrer ce protocole. Pour étudier l’effet de l’inactivation de Trp53 sur la capacité proliférative des HSPC de souris, nous avons utilisé la transfection lentivirale pour introduire l’ARNsg Trp53 dans des cellules de moelle osseuse exp...

La technologie CRISPR/Cas9 a été largement utilisée dans la recherche biomédicale en raison de sa nature conviviale et de sa grande efficacité, facilitant des applications telles que le dépistage de la fonction génique¹⁸, la modélisation de maladies¹⁹, l’immunothérapie²⁰ et le marquage et l’imagerie de cellules vivantes²¹. Des études récentes ont mené un dépistage CRISPR à gr...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Nous tenons à remercier l’Université de médecine chinoise de Pékin d’avoir utilisé ses services partagés pour mener à bien cette recherche. Ce travail a été soutenu par le Fonds des jeunes scientifiques de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 31701280 à J. Zhang).