Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um Kandidatengene zu identifizieren, die für die abnormale proliferative Kapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind.

Hämatopoetische Stammzellen besitzen die Fähigkeit zur langfristigen Selbsterneuerung und das Potenzial, sich in verschiedene Arten von reifen Blutzellen zu differenzieren. Die Anhäufung von krebsartigen Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) kann jedoch die normale Differenzierung blockieren, eine aberrante Proliferation induzieren und schließlich zur Leukämogenese führen. Um die krebsartigen Mutationen zu identifizieren und/oder zu bewerten, haben wir die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um ein Modellgen Trp53 zu untersuchen, das für die abnormale proliferative Fähigkeit von HSPCs essentiell ist. Insbesondere wurden für HSPCs angereicherte Knochenmarkzellen von Cas9-Mäusen entnommen und dann einer viralen Transfektion mit Single-Guide-RNAs (sgRNAs) unterzogen, die auf ein oder mehrere Kandidatengene abzielen, um genetische Veränderungen in HSPCs einzuführen. Anschließend wurde ein CCK-8-Assay durchgeführt, um die proliferative Kapazität von transfizierten HSPCs zu untersuchen. Die Effizienz des sgRNA-Targetings wurde durch einen Tracking of Indels by Decomposition Assay bestätigt. Diese identifizierten Gene könnten eine entscheidende Rolle bei der Leukämogenese spielen und als potenzielle therapeutische Ziele dienen.

Die Hämatopoese, bei der im Laufe des Lebens alle Abstammungslinien von Blutzellen produziert werden, wird von einer kleinen Population aufrechterhalten, die als hämatopoetische Stammzellen (HSCs) bezeichnet wird. HSCs erhalten sich durch Selbsterneuerung und produzieren verschiedene verbindliche Vorläuferzellen, aus denen vollständig differenzierte funktionsfähige Blutzellen hervorgehen ^1,2,3. Dieser Prozess ist streng reguliert. Die Akkumulation von krebsartigen Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) behindert jedoch die normale Differenzierung, verleiht eine abnormale proliferative Fähigkeit und verwandelt HSPCs schließlich in Leukämie-initiierende Zellen (LICs)4,5,6,7. Die Identifizierung und Bestätigung leukämogener Mutationen ist nach wie vor eine große Herausforderung für die Krebsforschung.

Vor kurzem wurde das System der clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) entwickelt und zu einer effizienten und präzisen Gen-Editing-Methode entwickelt, die aus der Cas9-Nuklease und der Single-Guide-RNA (sgRNA)⁸ besteht. Die sgRNA leitet den Cas9-sgRNA-Komplex durch RNA-DNA-Komplementarität an eine spezifische genomische Stelle, an der die Cas9-Nuklease Doppelstrangbrüche induziert. Die gebrochene DNA wird endogenen Gen-Editing-Mechanismen unterzogen, entweder durch präzise homologiegerichtete Reparatur in Gegenwart von Homologie-Templates oder durch mismatch-anfällige, nicht-homologe Endverbindungen, die zu kleinen Insertionen oder Deletionen führen⁹. Derzeit hat sich das CRISPR/Cas9-System zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die gezielte Geneditierung und transkriptionelle Regulation^{entwickelt 10}.

Hier nutzten wir die CRISPR/Cas9-Technologie, um genetische Veränderungen in HSPCs einzuführen, und führten dann den Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay durch, um zu untersuchen, ob die eingeführten Mutationen für die abnormale Proliferation von HSPCs entscheidend sind. Insbesondere wurden Knochenmarkzellen, die mit HSPCs angereichert waren, von Cas9-Mäusen entnommen, gefolgt von einer viralen Transfektion mit sgRNAs, die auf Kandidatengene abzielen. Anschließend wurde der CCK-8-Assay durchgeführt, um festzustellen, ob die Mutationen den transfizierten HSPCs eine erhöhte proliferative Fähigkeit verliehen. Schließlich wurden die durch CRISPR/Cas9 eingeführten Mutationen durch Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹¹ oder gezielte tiefe Sequenz¹² bestätigt. Dieses Protokoll bietet ein leistungsfähiges Instrument zur Beurteilung von Krebsmutationen und potenziellen therapeutischen Zielen für Leukämie.

Alle Tierversuche, die im Rahmen dieses Protokolls durchgeführt wurden, wurden vom Animal Care and Welfare Committee der Beijing University of Chinese Medicine genehmigt.

1. Konstruktion von sgRNA-Plasmiden, die auf Kandidatengene abzielen (4 - 5 Tage)

1. Entwerfen Sie die Ziel-sgRNA mit Online-sgRNA-Design-Tools. Geben Sie die genomische DNA-Sequenz des Ziels in ein Online-sgRNA-Design-Tool ein (z. B. https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Wählen Sie die geeigneten sgRNA-Ziele aus und bestellen Sie die erforderlichen Oligonukleotide.
2. Bereiten Sie die sgRNA-Oligoinsertionen vor. Resuspendieren Sie die oberen und unteren Stränge der entworfenen Oligos für jede sgRNA (Schritt 1.1) auf eine Endkonzentration von 100 μM. Bereiten Sie Mischungen gemäß Tabelle 1 vor, um die sgRNA-Oligos zu phosphorylieren und zu annealisieren. Verwenden Sie die folgenden Thermocycling-Parameter: 37 °C für 30 min; 95 °C für 5 min; Rampe auf 25 °C bei 5 °C min⁻¹.
3. 1 μl der phosphorylierten und geglühten Oligos werden auf 199 μl ddH₂O bei Raumtemperatur aufgebracht, um ein Verdünnungsverhältnis von 1:200 zu erreichen.
4. Linearisieren Sie das Vektorplasmid.
   1. Unter Verwendung des referenzierten Rückgratvektors (siehe Materialtabelle) wird das Vektorplasmid mit dem Restriktionsenzym Esp3I (BsmBI) verdaut. Die Reaktionen werden gemäß Tabelle 1 aufgebaut und bei 55 °C für 1 h inkubiert.
   2. Geben Sie 0,5 μl Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) in dasselbe Röhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C, um die Wahrscheinlichkeit einer Autokonjugation des linearen Plasmids zu verringern.
   3. Überprüfen Sie, ob die Linearisierung erfolgreich war. Laden Sie die linearisierten Plasmide und ungeschnittenen Plasmide für die Elektrophorese auf ein 0,8-1% (w/v) Agarosegel.
   4. Reinigen Sie das linearisierte Plasmid mit einem PCR-Aufreinigungskit, eluieren Sie in 20 μl ddH₂O und quantifizieren Sie die DNA-Konzentration.
5. Klonieren Sie die sgRNA-Oligos in das Vektorplasmid, indem Sie die Ligationsreaktionen für jede sgRNA gemäß Tabelle 1 einrichten. Inkubieren Sie bei 16 °C für 4 h.
6. Für die Umwandlung werden 10 μl des Produkts aus Schritt 1,5 in 50 μl eiskalte, kompetente Stbl3-Zellen gegeben, die Mischung 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, 90 s lang bei 42 °C geschockt und dann umgehend für 2 Minuten wieder auf Eis gestellt. Geben Sie 200 μl antibiotikafreies LB-Medium in dasselbe Röhrchen, schütteln Sie es 30 Minuten lang bei 220 U/min bei 37 °C und geben Sie es dann auf eine LB-Platte mit 100 μg/ml Ampicillin. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
7. Untersuchen Sie am nächsten Tag die Platten auf das Wachstum der Kolonie. Wählen Sie aus jeder Platte 6-8 Kolonien aus und überprüfen Sie die korrekte Insertion der sgRNA mittels Kolonie-PCR. Wählen Sie positive Kolonien aus und inokulieren Sie die einzelnen Kolonien mit einer sterilen Pipettenspitze in 5 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin. Inkubieren und schütteln Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C.
8. Isolieren Sie die Plasmid-DNA aus Kulturen mit einem Mini-Plasmid-DNA-Aufreinigungskit. Sequenz aus dem U6-Promotor, um sicherzustellen, dass die 20-nt-Guide-Sequenz korrekt eingefügt ist.

2. Lentivirale Verpackung (2 - 3 Tage)

1. Kultivieren Sie HEK 293T-Zellen in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin-Lösung bei 37 °C und 5 % CO₂.
2. Passieren Sie die HEK293T Zellen, indem Sie das alte Medium aus der Petrischale aspirieren und die Schale 2x vorsichtig mit 3 mL PBS waschen. 1 ml Trypsin in eine 10 cm große Schale geben und 1 min bei 37 °C inkubieren. Geben Sie 3 ml warmes DMEM-Medium in die Schale, um das Trypsin zu inaktivieren, sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie es 5 Minuten lang bei 800 × g . Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Medium und geben Sie die Zellen nach Bedarf in neue Schalen an.
   HINWEIS: Verwenden Sie HEK 293T-Zellen mit weniger als 10 Durchgängen für die Lentivirusproduktion.
3. Sechzehn bis 24 Stunden vor der Transfektion die HEK293T Zellen in 10-cm-Schalen mit einer Dichte von 2-4 × 10⁶ Zellen pro Schale aussäen. Stellen Sie sicher, dass das verwendete DMEM frei von Antibiotika ist.
4. Stellen Sie sicher, dass die Zellen am Tag der Transfektion zu 70-80 % konfluiert sind. Transformieren Sie 10-15 μg Plasmid pro 10 cm Schale und halten Sie das molare Verhältnis von Plasmid zu PEI 1:3. Mix 1 und Mix 2 für die Transfektion gemäß Tabelle 2 vorbereiten.
5. Mix 2 5 Min. ziehen lassen. Mix 2 zu Mix 1 hinzufügen (darauf achten, dass die Reihenfolge der Zugabe nicht vertauscht wird), gründlich mischen und dann 15-20 Min. ziehen lassen.
6. Geben Sie den Komplex (Schritt 2.5) in die Zellen, schütteln Sie die Schale vorsichtig zum Mischen und inkubieren Sie sie in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ . Sechs bis 8 Stunden später ersetzen Sie das Medium durch DMEM-Medium (mit 10 % FBS).
7. Zwei Tage nach Beginn der lentiviralen Transfektion werden die Lentivirus-Überstände aus den Schalen gepoolt. Bei 4.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und durch eine 0,45 μm Mikrofiltrationsmembran filtrieren. Das Lentivirus abgeben und bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Das gesammelte Lentivirus kann nach Bedarf konzentriert werden. Vermeiden Sie es, die Virustiter durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu reduzieren.

3. Entnahme und Kultur von Knochenmarkzellen (12 - 13 Tage)

HINWEIS: Alle Mauslinien wurden in einem reinen genetischen C57BL/6-Hintergrund aufbewahrt. LSL-Cas9-Mäuse (T002249) wurden mit Mx1-Cre-Mäusen¹³ gekreuzt, um LSL-Cas9/+ zu erzeugen; Mx1-Cre/+ Mäuse. Hier sammelten wir Knochenmarkzellen von Mx1-Cre/+; LSL-Cas9/+ Mäuse und ihre Wurfgeschwister.

1. Um die Expression von Cre-Rekombinase zu induzieren, injizieren Sie den Mäusen (8-12 Wochen alt) intraperitoneal 150 μl Polyinosin-Polyzytidyl (1,5 mg/ml) an Tag 1 und Tag 3. An Tag 6 injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 5-Fluorouracil (5-FU, 150 mg/kg).
   HINWEIS: Mx1-Cre-transgene Mäuse sind so konstruiert, dass sie Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des induzierbaren Mx1-Promotors¹³ exprimieren. Die intraperitoneale Injektion von Polyinosin-Polycytidyl kann den Mx1-Promotor effektiv aktivieren und die Cre-Rekombinase-Expression induzieren¹⁴. Die Injektion von 5-FU wird verwendet, um proliferierende Zellen im Knochenmark zu depletieren, wodurch HSCs in den Zellzyklus eintreten und eine relative Häufigkeit von HSPCs entsteht¹⁵. Pro Maus können nach einer 5-FU-Behandlung ca. 2-4 × 10^{bis 6} Knochenmarkzellen entnommen werden.
2. Am Tag 11 werden die Mäuse durch CO₂ -Erstickung getötet. Nehmen Sie den Femur und die Tibia der Mäuse, spülen Sie die Knochenmarkhöhle mit PBS, das 2% FBS enthält, mit einer sterilen 1-ml-Spritze und sammeln Sie Knochenmarkzellen, wie von Gavrilescu et ^al.16 beschrieben.
   HINWEIS: Übertragen Sie die Knochen in eine Laminar-Flow-Haube, sobald die Tibia und Fibula von den Mäusen entfernt wurden, um die Sterilität während der Entnahme von Knochenmarkzellen zu erhalten.
3. Pipettieren Sie die Knochenmarkzellen auf und ab (30-50x), um sie in einzelne Zellen zu dispergieren, übertragen Sie dann die Zellmischung in ein 50-ml-Röhrchen und vermischen Sie sie mit einem Vortex.
4. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension zu 40 μl Erythrozyten-Lysepuffer und legen Sie es 5 Minuten lang auf Eis, damit die Erythrozyten lysieren können. 50 μl Trypanblau-Lösung zugeben, gut mischen und lebensfähige Zellen zählen.
5. Die Zellen werden bei 800 × g 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand.
6. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1-2 × 10⁶ Zellen/ml in einem Knochenmarkprästimulationsmedium, wie in Tabelle 3 beschrieben. Die Zellen in 10-cm-Schalen mit 10 ml/Platte aussäen und 24 Stunden lang inkubieren.

4. Lentivirale Transfektion von Knochenmarkzellen (2 - 3 Tage)

1. Sammeln Sie am nächsten Tag Zellen von den prästimulierten Platten. Spülen Sie die Platte kräftig mit 5 --10 ml PBS mit 2 % FBS aus. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen durch Zugabe von Trypanblau, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
2. Die Zellen werden bei 800 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Bereiten Sie die Virus-Virusinfektionslösung wie in Tabelle 4 beschrieben vor.
3. Den Überstand verwerfen und die Zellen in frisch zubereiteter Spritzinfektionslösung (∼10⁶ Zellen/ml) resuspendieren. Aussäen Sie die suspendierten Zellen in eine 6-Well-Platte, 4 ml pro Well. Verschließen Sie die 6-Well-Platte mit Parafilm und zentrifugieren Sie die Platte bei 1.500 × g für 90 min bei 32 °C.
4. Nach der Zentrifugation die Zellen vorsichtig mit einer Pipette resuspendieren (aber das Medium nicht wechseln), dann die Platte für 4-6 h in einem Inkubator inkubieren.
5. Für die erste Transfektion aspirieren Sie vorsichtig so viel überstehendes Medium wie möglich aus jeder Vertiefung (~3 ml) und fügen Sie ein gleiches Volumen Knochenmarkprästimulationsmedium hinzu. Wenn einige Zellen während des Eingriffs versehentlich aspiriert werden, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800 × g . Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit einer kleinen Menge Vorstimulationsmedium und geben Sie sie dann wieder in die Vertiefung.
6. Für die sekundäre Transfektion entnehmen Sie am nächsten Tag 2-3 ml Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie ein gleiches Volumen frisch aufgetauter retroviraler Stammlösung zusammen mit angemessenen Mengen HEPES und Polybren hinzu, wie in Tabelle 4 beschrieben. Die Platte bei 1.500 × g 90 min bei 37 °C zentrifugieren.
7. Nach der Zentrifugation die Zellen vorsichtig resuspendieren und die Platte im Inkubator 4-6 h weiter inkubieren.
8. Tauschen Sie das Medium wie in Schritt 4.5 aus. 24 Stunden inkubieren.

5. Durchführung eines In-vitro-CCK-8-Assays (3 - 4 Tage)

1. Spülen Sie die Vertiefungen kräftig aus, um Knochenmarkzellen zu sammeln. Waschen Sie die Platte mit PBS mit 2 % FBS, um die maximale Anzahl von Zellen zu erhalten. Die Zellen werden durch ein 70 μm Sieb filtriert und die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau gezählt, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
2. Die Zellen werden bei 800 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
3. Resuspendieren Sie die Zellen mit DMEM, das 10 % FBS und mIL-3, mIL-6 (10 ng/ml), mSCF (100 ng/ml) auf 1 × 10⁵ Zellen/ml enthält. Nehmen Sie ~0,5-1 × 10⁶ Zellen und zentrifugieren Sie bei 800 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet bei -80 °C für die genomische DNA-Extraktion.
4. Geben Sie die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Well. Erstellen Sie sechs Replizierungsvertiefungen für jede Gruppe. Geben Sie 100 μl steriles PBS in einen Kreis von Vertiefungen um die Vertiefungen, in denen die Zellen ausgesät werden. Inkubieren Sie für 0, 24, 48 und 72 Stunden.
5. Saugen Sie das Medium zum entsprechenden Zeitpunkt vorsichtig aus der 96-Well-Platte an. 110 μl Medium mit 1/10 Volumen CCK-8 in die Vertiefungen geben. Richten Sie eine leere Gruppe ein (nur Medium und CCK-8, keine Zellen). Inkubieren Sie 1 h im Inkubator.
6. Lesen Sie den Absorptionswert von 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer ab.
7. Verwenden Sie eine Statistiksoftware, um die experimentellen Daten zu analysieren, und drücken Sie die experimentellen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) aus. Analysieren Sie die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen mit dem t-Test für unabhängige Stichproben, wobei P < 0,05 auf einen statistisch signifikanten Unterschied hinweist.

6. Überprüfung der Gen-Editierung (5 - 7 Tage)

1. Extrahieren Sie die genomische DNA (Schritt 5.3) mit einem genomischen DNA-Aufreinigungskit gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
2. Entwerfen Sie Primer, die die 200- bis 500-bp-Region amplifizieren, die um die sgRNA-Schnittstelle zentriert ist (Tabelle 5).
3. Für die Sanger-Sequenzierung bereiten Sie die Mischung wie in Tabelle 6 für die PCR vor. Amplifizieren Sie die Zielgenfragmente mit einem Thermocycler wie folgt: 95 °C für 5 min, 40 Zyklen (95 °C für 30 s, 58 °C für 30 s, 72 °C für 9 s), 72 °C für 10 min, 4 °C ∞.
   HINWEIS: Die Geneditierung kann auch mit Hilfe von Next-Generation-Sequencing (NGS) verifiziert werden, und das PCR-Produkt muss mit einem Aufreinigungskit für NGS aufgereinigt werden.
4. Analysieren Sie die Sanger-Sequenzierungsergebnisse auf der TIDE-Website (http://tide.nki.nl). Berechnen Sie die Editiereffizienz von sgRNA, indem Sie die sgRNA-Sequenz und die Sequenzierungsergebnisse sowohl von Versuchs- als auch von Kontrollgruppen in dieses Online-Tool eingeben.
   HINWEIS: Analysieren Sie die NGS-Ergebnisse mit CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷. Geben Sie Paired-End-Reads (zwei Dateien) oder Single-End-Reads (eine Datei) im fastq- oder fastq.gz-Format aus einem Tiefensequenzierungsexperiment ein, zusammen mit einer Referenzsequenz und einer sgRNA-Sequenz. Die Software wird die angestrebte Mutagenese auswerten und quantifizieren.

Wirkung des Trp53-Knockouts auf die proliferative Kapazität von Maus-HSPCs
Hier haben wir den Trp53-Knockout als Beispiel verwendet, um dieses Protokoll zu demonstrieren. Um den Effekt des Trp53-Knockouts auf die proliferative Kapazität von Maus-HSPCs zu untersuchen, verwendeten wir lentivirale Transfektion, um Trp53 sgRNA in Cas9-exprimierende Knochenmarkzellen einzuführen, die nach 5-FU-Behand...

Die CRISPR/Cas9-Technologie ist in der biomedizinischen Forschung aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und hohen Effizienz weit verbreitet und erleichtert Anwendungen wie das Screening von Genfunktionen¹⁸, die Modellierung von Krankheiten¹⁹, die Immuntherapie²⁰ sowie die Markierung und Bildgebung lebender Zellen²¹. Jüngste Studien haben groß angelegte CRISPR-Screenings durchgeführt, um neu...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir danken der Beijing University of Chinese Medicine für die Nutzung ihrer gemeinsamen Dienste zur Durchführung dieser Forschung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Young Scientists Fund der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31701280 an J. Zhang).