Evaluación de genes anormales relacionados con el crecimiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante la combinación de la tecnología CRISPR/Cas9 con el recuento de células

Aquí, presentamos un protocolo que integra la tecnología CRISPR/Cas9 con el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que son cruciales para la capacidad proliferativa anormal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas.

Las células madre hematopoyéticas poseen la capacidad de autorrenovación a largo plazo y el potencial de diferenciarse en varios tipos de células sanguíneas maduras. Sin embargo, la acumulación de mutaciones cancerosas en las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) puede bloquear la diferenciación normal, inducir una proliferación aberrante y, en última instancia, conducir a la leucemogénesis. Para identificar y/o evaluar las mutaciones cancerosas, integramos la tecnología CRISPR/Cas9 con el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para investigar un gen modelo Trp53, que es esencial para la capacidad proliferativa anormal de las HSPCs. En concreto, se recolectaron células de médula ósea enriquecidas para HSPCs de ratones Cas9 y luego se sometieron a transfección viral con RNAs de guía única (sgRNAs) dirigidos a uno o varios genes candidatos para introducir alteraciones genéticas en las HSPCs. A continuación, se realizó un ensayo CCK-8 para investigar la capacidad proliferativa de las HSPCs transfectadas. La eficiencia de la focalización del sgRNA se confirmó mediante un ensayo de seguimiento de Indels por descomposición. Estos genes identificados pueden desempeñar un papel crucial en la leucemogénesis y podrían servir como posibles dianas terapéuticas.

La hematopoyesis, que produce todos los linajes de células sanguíneas a lo largo de la vida, es mantenida por una pequeña población llamada células madre hematopoyéticas (HSC). Las HSC se mantienen por autorrenovación y producen varios progenitores comprometidos que dan lugar a células sanguíneas funcionales completamente diferenciadas ^1,2,3. Este proceso está estrictamente regulado. Sin embargo, la acumulación de mutaciones cancerosas en las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) impide la diferenciación normal, confiere una capacidad proliferativa anormal y, en última instancia, transforma las HSPC en células iniciadoras de leucemia (LIC)4,5,6,7. La identificación y confirmación de las mutaciones leucemogénicas sigue siendo un gran desafío para la investigación del cáncer.

Recientemente, se ha desarrollado el sistema agrupado de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas (CRISPR)/proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) y se ha convertido en un método de edición de genes eficiente y preciso, que consiste en la nucleasa Cas9 y el ARN de guía única (sgRNA)⁸. El sgRNA guía el complejo Cas9-sgRNA a una ubicación genómica específica a través de la complementariedad ARN-ADN, donde la nucleasa Cas9 induce roturas de doble cadena. El ADN roto se somete a mecanismos endógenos de edición de genes, ya sea a través de una reparación precisa dirigida por homología en presencia de plantillas de homología o de una unión de extremos no homóloga propensa a desajustes, lo que conduce a pequeñas inserciones o deleciones⁹. En la actualidad, el sistema CRISPR/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para la edición de genes dirigida y la regulación transcripcional¹⁰.

Aquí, utilizamos la tecnología CRISPR/Cas9 para introducir alteraciones genéticas en HSPC y luego realizamos el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para investigar si las mutaciones introducidas eran críticas para la proliferación anormal de HSPC. Específicamente, las células de médula ósea enriquecidas para HSPC se recolectaron de ratones Cas9 seguidas de una transfección viral con sgRNAs dirigidos a genes candidatos. A continuación, se realizó el ensayo CCK-8 para determinar si las mutaciones conferían una mayor capacidad proliferativa a las HSPC transfectadas. Finalmente, las mutaciones introducidas por CRISPR/Cas9 se confirmaron mediante Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹¹ o secuencia profunda dirigida¹². Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para evaluar las mutaciones cancerosas y los posibles objetivos terapéuticos para la leucemia.

Todos los experimentos con animales realizados bajo este protocolo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Universidad de Medicina China de Beijing.

1. Construcción de plásmidos de sgRNA dirigidos a genes candidatos (4 - 5 días)

1. Diseñe el sgRNA dirigido utilizando herramientas de diseño de sgRNA en línea. Introduzca la secuencia de ADN genómico objetivo en una herramienta de diseño de sgRNA en línea (por ejemplo, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Seleccione las dianas de sgRNA adecuadas y pida los oligonucleótidos necesarios.
2. Prepare los insertos de oligonucleótidos de sgRNA. Vuelva a suspender las hebras superior e inferior de los oligonucleótidos diseñados para cada ARNsg (paso 1.1) hasta una concentración final de 100 μM. Prepare las mezclas de acuerdo con la Tabla 1 para fosforilar y recocer los oligós de ARNg. Utilice los siguientes parámetros de termociclado: 37 °C durante 30 min; 95 °C durante 5 min; rampa de bajada a 25 °C a 5 °C ^min-1.
3. Añada 1 μL de los oligonucleótidos fosforilados y recocidos a 199 μL de ddH₂O a temperatura ambiente para lograr una proporción de dilución de 1:200.
4. Linealizar el plásmido vectorial.
   1. Usando el vector de la columna vertebral referenciado (ver la Tabla de Materiales), digiera el plásmido vectorial usando la enzima de restricción Esp3I (BsmBI). Configure las reacciones de acuerdo con la Tabla 1 e incube a 55 °C durante 1 h.
   2. Añadir 0,5 μL de fosfatasa alcalina de camarón (rSAP) al mismo tubo e incubar a 37 °C durante 30 min para reducir la probabilidad de autoconjugación del plásmido lineal.
   3. Compruebe si la linealización se ha realizado correctamente. Cargue los plásmidos linealizados y los plásmidos sin cortar para la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8-1% (p/v).
   4. Purificar el plásmido linealizado con un kit de purificación por PCR, eluir en 20 μL de_ddH2O, y cuantificar la concentración de ADN.
5. Clone los oligonucleótidos de sgRNA en el plásmido vectorial configurando las reacciones de ligadura para cada sgRNA de acuerdo con la Tabla 1. Incubar a 16 °C durante 4 h.
6. Para la transformación, agregue 10 μL del producto del paso 1.5 a 50 μL de células Stbl3 competentes heladas, incube la mezcla en hielo durante 30 minutos, aplíquela a 42 °C durante 90 s y luego devuélvala rápidamente a hielo durante 2 minutos. Añadir 200 μL de medio LB sin antibióticos al mismo tubo, agitar a 220 rpm durante 30 min a 37 °C y, a continuación, colocar una placa LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
7. Al día siguiente, examine las placas para ver el crecimiento de la colonia. De cada placa, seleccione 6-8 colonias y verifique la inserción correcta del sgRNA mediante PCR de colonias. Seleccione las colonias positivas e inocule las colonias individuales en 5 mL de medio LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina utilizando una punta de pipeta estéril. Incubar y agitar el cultivo a 37 °C durante la noche.
8. Aísle el ADN plasmídico de los cultivos utilizando un mini kit de purificación de ADN plasmídico. Secuencia desde el promotor U6 para asegurarse de que la secuencia guía de 20 nt esté insertada correctamente.

2. Embalaje lentiviral (2 - 3 días)

1. Cultivo de células HEK 293T en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v) y solución de penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Pase las células HEK293T aspirando el medio viejo de la placa de Petri y lave la placa suavemente 2 veces con 3 mL de PBS. Añadir 1 mL de tripsina a una placa de 10 cm e incubar a 37 °C durante 1 min. Agregue 3 mL de medio DMEM tibio a la placa para inactivar la tripsina, recoja las células en un tubo de 15 mL y centrifugue a 800 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 5 mL de medio y coloque las células en placas nuevas según sea necesario.
   NOTA: Utilice células HEK 293T con menos de 10 conductos para la producción de lentivirus.
3. De dieciséis a 24 h antes de la transfección, siembre las HEK293T células en placas de 10 cm a una densidad de 2-4 × 10^{a 6} células por placa. Asegúrese de que el DMEM utilizado esté libre de antibióticos.
4. Asegúrese de que las células estén confluentes en un 70-80% el día de la transfección. Transforme 10-15 μg de plásmido por plato de 10 cm y mantenga la relación molar de plásmido a PEI 1:3. Prepare la Mezcla 1 y la Mezcla 2 para la transfección de acuerdo con la Tabla 2.
5. Deje reposar la Mezcla 2 durante 5 min. Agregue la Mezcla 2 a la Mezcla 1 (tenga cuidado de no invertir el orden de la adición), mezcle bien y luego déjela reposar durante 15-20 min.
6. Añadir el complejo (paso 2.5) a las células, agitar suavemente el plato para mezclar e incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de_CO2 . De seis a 8 horas más tarde, reemplace el medio con medio DMEM (que contiene 10% de FBS).
7. Dos días después del inicio de la transfección lentiviral, agrupe los sobrenadantes lentivirus de los platos. Centrifugar a 4.000 × g durante 10 min a 4 °C y filtrar a través de una membrana de microfiltración de 0,45 μm. Dispense el lentivirus y almacene a -80 °C.
   NOTA: El lentivirus recolectado se puede concentrar según sea necesario. Evite reducir los títulos virales debido a la congelación y descongelación repetidas.

3. Extracción y cultivo de células de médula ósea (12 - 13 días)

NOTA: Todas las líneas de ratones se mantuvieron en un fondo genético C57BL/6 puro. Los ratones LSL-Cas9 (T002249) se cruzaron con los ratones Mx1-Cre¹³ para generar LSL-Cas9/+; Ratones Mx1-Cre/+. Aquí, recolectamos células de médula ósea de Mx1-Cre/+; Ratones LSL-Cas9/+ y sus compañeros de camada.

1. Para inducir la expresión de Cre recombinasa, inyectar a los ratones (8-12 semanas de edad) por vía intraperitoneal 150 μL de poliinosínico-policitidílico (1,5 mg/mL) el día 1 y el día 3. El día 6, inyectar a los ratones por vía intraperitoneal 5-fluorouracilo (5-FU, 150 mg/kg).
   NOTA: Los ratones transgénicos Mx1-Cre están diseñados para expresar Cre recombinasa bajo el control del promotor Mx1^{inducible 13}. La inyección intraperitoneal de poliinosínico-policitidílico puede activar eficazmente el promotor Mx1 e inducir la expresión de Cre recombinasa¹⁴. La inyección de 5-FU se utiliza para agotar las células proliferantes en la médula ósea, induciendo así a las HSC a entrar en el ciclo celular y dando lugar a una abundancia relativa de HSPCs¹⁵. Se pueden recolectar aproximadamente 2-4 × 10⁶ células de médula ósea por ratón después del tratamiento con 5-FU.
2. El día 11, sacrifica los ratones por asfixia con CO₂ . Se tomó el fémur y la tibia de los ratones, se enjuagó la cavidad de la médula ósea con PBS que contenía un 2% de FBS utilizando una jeringa estéril de 1 mL y se recogieron las células de la médula ósea como se describe en Gavrilescu et ^al.16.
   NOTA: Transfiera los huesos a una campana de flujo laminar tan pronto como se extraigan la tibia y el peroné de los ratones para mantener la esterilidad durante la recolección de células de la médula ósea.
3. Pipetear las células de la médula ósea hacia arriba y hacia abajo (30-50x) para dispersarlas en células individuales, luego transfiera la mezcla de células a un tubo de 50 ml y un vórtice para mezclar bien.
4. Añadir 10 μL de la suspensión celular a 40 μL de tampón de lisis de eritrocitos y colocarlo en hielo durante 5 min para permitir la lisis de los eritrocitos. Agregue 50 μL de solución de azul de tripano, mezcle bien y cuente las células viables.
5. Centrifugar las células a 800 × g durante 15 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante.
6. Resuspender las células a 1-2 × 10⁶ células/mL en medio de preestimulación de médula ósea como se describe en la Tabla 3. Siembre las células en platos de 10 cm, 10 mL/plato, e incube durante 24 h.

4. Transfección lentiviral de células de médula ósea (2 - 3 días)

1. Al día siguiente, recoja las células de las placas preestimuladas. Enjuague el plato vigorosamente con 5 --10 mL de PBS que contenga 2% de FBS. Cuente las células viables agregando azul de tripano como se describe en el paso 3.4.
2. Centrifugar las celdas a 800 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Prepare la solución de spinfection del virus como se describe en la Tabla 4.
3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en una solución de spinfección recién preparada (∼10⁶ células/mL). Siembre las células suspendidas en una placa de 6 pocillos, 4 mL por pocillo. Selle la placa de 6 pocillos con parafilm y centrifugue la placa a 1.500 × g durante 90 min a 32 °C.
4. Después de la centrifugación, vuelva a suspender las células suavemente con una pipeta (pero no cambie el medio), luego incube la placa durante 4-6 h en una incubadora.
5. Para la primera transfección, aspire la mayor cantidad posible de medio sobrenadante de cada pocillo (~3 mL) con cuidado y agregue un volumen igual de medio de preestimulación de médula ósea. Si algunas células se aspiran accidentalmente durante el procedimiento, centrifugar a 800 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células con una pequeña cantidad de medio de preestimulación y luego agréguelas nuevamente al pozo.
6. Para la transfección secundaria, al día siguiente, extraiga 2-3 mL de medio de cada pocillo y agregue un volumen igual de solución madre retroviral recién descongelada junto con cantidades apropiadas de HEPES y polibreno, como se describe en la Tabla 4. Centrifugar la placa a 1.500 × g durante 90 min, 37 °C.
7. Después de la centrifugación, vuelva a suspender suavemente las células y continúe incubando la placa en la incubadora durante 4-6 h.
8. Reemplace el medio como en el paso 4.5. Incubar durante 24 h.

5. Realizar el ensayo CCK-8 in vitro (3 - 4 días)

1. Enjuague enérgicamente los pocillos para recolectar las células de la médula ósea. Lave la placa con PBS que contenga un 2% de FBS para obtener el máximo número de células. Filtre las células a través de un tamiz de 70 μm y cuente las células viables con azul de tripán como se describe en el paso 3.4.
2. Centrifugar las celdas a 800 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Vuelva a suspender las células con DMEM que contengan 10% de FBS y mIL-3, mIL-6 (10 ng/mL), mSCF (100 ng/mL) a 1 × 10⁵ células/mL. Tome ~ 0.5-1 × 10⁶ celdas y centrifugue a 800 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y almacene el pellet celular a -80 °C para la extracción del ADN genómico.
4. Agregue las celdas en placas de 96 pocillos con una densidad de 1 × 10⁴ celdas por pocillo. Haga seis pozos de réplica para cada grupo. Agregue 100 μL de PBS estéril a un círculo de pocillos alrededor de los pocillos donde se siembran las células. Incubar durante 0, 24, 48 y 72 h.
5. Aspire con cuidado el medio de la placa de 96 pocillos en el punto de tiempo correspondiente. Agregue 110 μL de medio que contenga 1/10 de volumen de CCK-8 a los pocillos. Configure un grupo en blanco (solo medio y CCK-8, sin celdas). Incubar en la incubadora durante 1 h.
6. Lea el valor de absorbancia de 450 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.
7. Utilice software estadístico para analizar los datos experimentales y expresar los datos experimentales como media ± desviación estándar (media ± DE). Analice las diferencias entre los dos grupos utilizando la prueba t de muestras independientes, donde P < 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa.

6. Verificación de edición genética (5 - 7 días)

1. Extraiga el ADN genómico (paso 5.3) utilizando un kit de purificación de ADN genómico de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
2. Diseñe cebadores que amplifiquen la región de 200 a 500 pb centrada alrededor del sitio de corte del sgRNA (Tabla 5).
3. Para la secuenciación de Sanger, prepare la mezcla como se muestra en la Tabla 6 para PCR. Amplifique los fragmentos de genes diana utilizando un termociclador de la siguiente manera: 95 °C durante 5 min, 40 ciclos (95 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s, 72 °C durante 9 s), 72 °C durante 10 min, 4 °C ∞.
   NOTA: La edición de genes también se puede verificar mediante secuenciación de próxima generación (NGS), y el producto de PCR debe purificarse con un kit de purificación para NGS.
4. Analice los resultados de la secuenciación de Sanger en el sitio web de TIDE (http://tide.nki.nl). Calcule la eficiencia de edición de sgRNA ingresando la secuencia de sgRNA y los resultados de secuenciación de los grupos experimental y de control en esta herramienta en línea.
   NOTA: Analice los resultados de NGS utilizando CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷. Entradas de lecturas de extremo emparejado (dos archivos) o lecturas de un solo extremo (un solo archivo) en formato fastq o fastq.gz de un experimento de secuenciación profunda, junto con una secuencia de referencia y una secuencia de sgRNA. El software evaluará y cuantificará la mutagénesis dirigida.

Efecto del knockout de Trp53 sobre la capacidad proliferativa de las HSPCs de ratón
Aquí, usamos Trp53 knockout como ejemplo para demostrar este protocolo. Para investigar el efecto de la eliminación de Trp53 en la capacidad proliferativa de las HSPC de ratón, empleamos la transfección lentiviral para introducir el sgRNA de Trp53 en las células de médula ósea que expresan Cas9 enriquecidas ...

La tecnología CRISPR/Cas9 se ha utilizado ampliamente en la investigación biomédica debido a su naturaleza fácil de usar y su alta eficiencia, lo que facilita la aplicación como el cribado de la función génica¹⁸, el modelado de enfermedades¹⁹, la inmunoterapia²⁰ y el marcaje e imagen de células vivas²¹. Estudios recientes han llevado a cabo el cribado CRISPR a gran escala para identifi...

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Nos gustaría agradecer a la Universidad de Medicina China de Beijing por el uso de sus servicios compartidos para completar esta investigación. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31701280 a J. Zhang).