تقييم الجينات غير الطبيعية المرتبطة بالنمو للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم من خلال الجمع بين تقنية CRISPR / Cas9 مع عد الخلايا

هنا ، نقدم بروتوكولا يدمج تقنية CRISPR / Cas9 مع اختبار Cell Counting Kit-8 (CCK-8) لتحديد الجينات المرشحة التي تعتبر ضرورية للقدرة التكاثرية غير الطبيعية للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية.

تمتلك الخلايا الجذعية المكونة للدم القدرة على التجديد الذاتي على المدى الطويل والقدرة على التمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا الدم الناضجة. ومع ذلك ، فإن تراكم الطفرات السرطانية في الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) يمكن أن يمنع التمايز الطبيعي ، ويؤدي إلى انتشار شاذ ، ويؤدي في النهاية إلى تكوين الكريات البيض. لتحديد و / أو تقييم الطفرات السرطانية ، قمنا بدمج تقنية CRISPR / Cas9 مع اختبار Cell Counting Kit-8 (CCK-8) للتحقيق في نموذج الجين Trp53 ، وهو أمر ضروري لقدرة التكاثر غير الطبيعية ل HSPCs. على وجه التحديد ، تم حصاد خلايا نخاع العظم المخصبة ل HSPCs من فئران Cas9 ثم تعرضت لتعداء فيروسي باستخدام RNAs أحادي التوجيه (sgRNAs) التي تستهدف واحدا أو أكثر من الجينات المرشحة لإدخال تغييرات جينية في HSPCs. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار CCK-8 للتحقيق في القدرة التكاثرية ل HSPCs المنقولة. تم تأكيد كفاءة استهداف sgRNA من خلال مقايسة تتبع Indels عن طريق التحلل. قد تلعب هذه الجينات المحددة أدوارا حاسمة في تكوين الكريات البيضاء ويمكن أن تكون بمثابة أهداف علاجية محتملة.

يتم الحفاظ على تكون الدم ، الذي ينتج جميع سلالات خلايا الدم طوال الحياة ، من قبل مجموعة صغيرة تسمى الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). تحافظ HSCs على نفسها عن طريق التجديد الذاتي وتنتج العديد من الأسلاف الملتزمة التي تؤدي إلى خلايا دم وظيفية متمايزة^{تماما 1،2،3}. هذه العملية منظمة بإحكام. ومع ذلك ، فإن تراكم الطفرات السرطانية في الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) يعيق التمايز الطبيعي ، ويمنح قدرة تكاثرية غير طبيعية ، ويحول في النهاية HSPCs إلى خلايا بدء سرطان الدم (LICs) ^4،5،6،7. لا يزال تحديد وتأكيد طفرات السرطان يمثل تحديا كبيرا لأبحاث السرطان.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نظام التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام (CRISPR) / البروتين 9 (Cas9) المرتبط ب CRISPR وأصبح طريقة فعالة ودقيقة لتحرير الجينات ، تتكون من نوكلياز Cas9 والحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA)⁸. يوجه sgRNA مركب Cas9-sgRNA إلى موقع جيني محدد من خلال تكامل الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، حيث تحفز نوكلياز Cas9 فواصل مزدوجة الخيط. يخضع الحمض النووي المكسور لآليات تحرير الجينات الذاتية إما من خلال الإصلاح الدقيق الموجه بالتماثل في وجود قوالب التماثل أو الانضمام النهائي غير المتماثل وغير المتماثل ، مما يؤدي إلى عمليات إدخال أو حذف صغيرة⁹. حاليا ، أصبح نظام CRISPR / Cas9 أداة قوية لتحرير الجينات المستهدفة وتنظيم النسخ¹⁰.

هنا ، استخدمنا تقنية CRISPR / Cas9 لإدخال التغيرات الجينية في HSPCs ثم أجرينا اختبار Cell Counting Kit-8 (CCK-8) للتحقق مما إذا كانت الطفرات التي تم إدخالها حاسمة للتكاثر غير الطبيعي ل HSPCs. على وجه التحديد ، تم حصاد خلايا نخاع العظم المخصبة ل HSPCs من فئران Cas9 متبوعا بتعداء فيروسي باستخدام sgRNAs التي تستهدف الجينات المرشحة. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار CCK-8 لتحديد ما إذا كانت الطفرات تمنح قدرة تكاثرية متزايدة ل HSPCs المنقولة. أخيرا ، تم تأكيد الطفرات التي أدخلتها CRISPR / Cas9 عن طريق تتبع Indels عن طريق التحلل (TIDE) ¹¹ أو التسلسل العميق المستهدف¹². يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لتقييم الطفرات السرطانية والأهداف العلاجية المحتملة لسرطان الدم.

تمت الموافقة على جميع التجارب على التي أجريت بموجب هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية ورفاهية التابعة لجامعة بكين للطب الصيني.

1. بناء بلازميدات sgRNA التي تستهدف الجينات المرشحة (4-5 أيام)

1. صمم sgRNA المستهدف باستخدام أدوات تصميم sgRNA عبر الإنترنت. أدخل تسلسل الحمض النووي الجيني المستهدف في أداة تصميم sgRNA عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). حدد أهداف sgRNA المناسبة واطلب قليل النوكليوتيدات اللازمة.
2. تحضير إدخالات sgRNA oligo. أعد تعليق الخيوط العلوية والسفلية من oligos المصممة لكل sgRNA (الخطوة 1.1) إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر. تحضير الخلائط وفقا للجدول 1 لفسفرة وتصلب sgRNA oligos. استخدم معلمات التدوير الحراري التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ المنحدر إلى 25 درجة مئوية عند 5 درجات مئوية ^{دقيقة −1}.
3. أضف 1 ميكرولتر من oligos الفسفورة والملدنة إلى 199 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة ddH₂O لتحقيق نسبة تخفيف تبلغ 1: 200.
4. خطي البلازميد المتجه.
   1. باستخدام متجه العمود الفقري المشار إليه (انظر جدول المواد) ، قم بهضم البلازميد المتجه باستخدام إنزيم التقييد Esp3I (BsmBI). قم بإعداد التفاعلات وفقا للجدول 1 واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   2. أضف 0.5 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي للروبيان (rSAP) إلى نفس الأنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتقليل احتمالية الاقتران الذاتي للبلازميد الخطي.
   3. تحقق من الخطية الناجحة. قم بتحميل البلازميدات الخطية والبلازميدات غير المقطوعة للرحلان الكهربائي على 0.8-1٪ (وزن / حجم) جل الاغاروز.
   4. قم بتنقية البلازميد الخطي باستخدام مجموعة تنقية PCR ، وقم بشطفه في 20 ميكرولتر من ddH₂O ، وحدد تركيز الحمض النووي.
5. استنساخ sgRNA oligos في البلازميد المتجه عن طريق إعداد تفاعلات الربط لكل sgRNA وفقا للجدول 1. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
6. للتحويل ، أضف 10 ميكرولتر من المنتج من الخطوة 1.5 إلى 50 ميكرولتر من خلايا Stbl3 المختصة بالجليد ، واحتضن الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وصدمه بالحرارة عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، ثم أعده على الفور إلى الجليد لمدة دقيقتين. أضف 200 ميكرولتر من وسط LB الخالي من المضادات الحيوية إلى نفس الأنبوب ، ورجه عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم ضعه على صفيحة LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
7. في اليوم التالي ، افحص الألواح بحثا عن نمو المستعمرة. من كل لوحة ، حدد 6-8 مستعمرات وتحقق من الإدخال الصحيح ل sgRNA باستخدام مستعمرة PCR. حدد المستعمرات الموجبة وقم بتلقيح المستعمرات الفردية في 5 مل من وسط LB الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين باستخدام طرف ماصة معقمة. احتضن ورج المزرعة عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
8. اعزل الحمض النووي البلازميد عن الثقافات باستخدام مجموعة صغيرة لتنقية الحمض النووي البلازميد. تسلسل من مروج U6 للتأكد من إدراج تسلسل التوجيه 20-nt بشكل صحيح.

2. عبوات العدسات (2-3 أيام)

1. مزرعة خلايا HEK 293T في وسط DMEM مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (v/v) ومحلول بنسلين ستربتومايسين 1٪ عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. قم بتمرير الخلايا HEK293T عن طريق شفط الوسط القديم من طبق بتري وغسل الطبق برفق 2x مع 3 مل من PBS. أضف 1 مل من التربسين إلى طبق 10 سم واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. أضف 3 مل من وسط DMEM الدافئ إلى الطبق لتعطيل التربسين ، واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل ، ثم يدور عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من الوسط ، وقم بوضع الخلايا في أطباق جديدة حسب الحاجة.
   ملاحظة: استخدم خلايا HEK 293T مع أقل من 10 ممرات لإنتاج الفيروسات العدسية.
3. قبل ستة عشر إلى 24 ساعة من التعدي ، قم بزرع الخلايا HEK293T في أطباق 10 سم بكثافة 2-4 × 10⁶ خلايا لكل طبق. تأكد من أن DMEM المستخدم خال من المضادات الحيوية.
4. تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 70-80٪ في يوم التعداد. قم بتحويل 10-15 ميكروغرام من البلازميد لكل طبق 10 سم وحافظ على النسبة المولية للبلازميد إلى PEI 1: 3. تحضير المزيج 1 والخلط 2 للتعداء وفقا للجدول 2.
5. اترك Mix 2 لمدة 5 دقائق. أضف Mix 2 إلى Mix 1 (احرص على عدم عكس ترتيب الإضافة) ، واخلطه جيدا ، ثم اتركه لمدة 15-20 دقيقة.
6. أضف المركب (الخطوة 2.5) إلى الخلايا ، ورج الطبق برفق حتى يمتزج ، واحتضنه في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ . بعد ست إلى 8 ساعات ، استبدل الوسط بوسط DMEM (يحتوي على 10٪ FBS).
7. بعد يومين من بدء تعداء الفيروسات العدسية ، قم بتجميع المواد الطافية للفيروس من الأطباق. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتصفية من خلال غشاء ترشيح دقيق 0.45 ميكرومتر. استغني عن فيروس العدسات وخزنيه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن تركيز الفيروس العدسي الذي تم جمعه حسب الحاجة. تجنب تقليل العيارات الفيروسية بسبب التجميد والذوبان المتكررين.

3. استخراج خلايا نخاع العظم وزراعتها (12-13 يوما)

ملاحظة: تم الحفاظ على جميع خطوط الماوس في خلفية وراثية نقية C57BL / 6. تم تهجين الفئران LSL-Cas9 (T002249) مع الفئران Mx1-Cre¹³ لتوليد LSL-Cas9 / + ؛ Mx1-Cre / + الفئران. هنا ، قمنا بجمع خلايا نخاع العظم من Mx1-Cre / + ؛ الفئران LSL-Cas9 / + وزملائها في القمامة.

1. للحث على التعبير عن Cre recombinase, حقن الفئران (8-12 أسابيع) داخل الصفاق مع 150 ميكرولتر من البولي إينوسينيك-بولي سيتيديليك (1.5 ملغ/مل) في اليوم 1 واليوم 3. في اليوم 6 ، قم بحقن الفئران داخل الصفاق مع 5-فلورويوراسيل (5-FU ، 150 مجم / كغ).
   ملاحظة: تم تصميم الفئران المعدلة وراثيا Mx1-Cre للتعبير عن Cre recombinase تحت سيطرة مروج Mx1 المحفز¹³. يمكن أن يؤدي الحقن داخل الصفاق من Polyinosinic-polycytidylic إلى تنشيط محفز Mx1 بشكل فعال وتحفيز تعبير Cre recombinase¹⁴. يتم استخدام حقن 5-FU لاستنفاد الخلايا المتكاثرة في نخاع العظام ، مما يحفز HSCs على الدخول في دورة الخلية وينتج عنه وفرة نسبية من HSPCs¹⁵. يمكن حصاد ما يقرب من 2-4 × 10⁶ خلايا نخاع عظمي لكل فأر بعد علاج 5-FU.
2. في اليوم 11 ، ضحي بالفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ . خذ عظم الفخذ والساق للفئران ، واغسل تجويف نخاع العظم باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS باستخدام حقنة معقمة سعة 1 مل ، واجمع خلايا نخاع العظام كما وصفها Gavrilescu et ^al.16.
   ملاحظة: انقل العظام إلى غطاء التدفق الصفحي بمجرد إزالة الظنبوب والشظية من الفئران للحفاظ على العقم أثناء جمع خلايا نخاع العظام.
3. قم بتحريك خلايا نخاع العظم لأعلى ولأسفل (30-50 ضعفا) لتفريقها في خلايا مفردة ، ثم نقل خليط الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل ، ودوامة لخلطها جيدا.
4. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى 40 ميكرولتر من محلول تحلل كريات الدم الحمراء وضعه على الجليد لمدة 5 دقائق للسماح لكريات الدم الحمراء بالتحلل. أضف 50 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق ، واخلطه جيدا ، وعد الخلايا القابلة للحياة.
5. الطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. شفط المادة الطافية.
6. أعد تعليق الخلايا عند 1-2 × 10⁶ خلايا / مل في وسط التحفيز المسبق لنخاع العظم كما هو موضح في الجدول 3. بذر الخلايا في أطباق 10 سم ، 10 مل / طبق ، واحتضانها لمدة 24 ساعة.

4. تعداء الخلايا النسبية لخلايا نخاع العظام (2-3 أيام)

1. في اليوم التالي ، اجمع الخلايا من الصفائح المحفزة. اشطف الطبق بقوة باستخدام 5 -10 مل من PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS. عد الخلايا القابلة للحياة عن طريق إضافة تريبان أزرق كما هو موضح في الخطوة 3.4.
2. الطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحضير محلول التلوث الفيروسي كما هو موضح في الجدول 4.
3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في محلول التلوث المحضر حديثا (∼10⁶ خلايا / مل). قم بزرع الخلايا العالقة في طبق مكون من 6 آبار ، 4 مل لكل بئر. أغلق اللوحة المكونة من 6 آبار بالبارافيلم وقم بالطرد المركزي للوحة عند 1,500 × جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية.
4. بعد الطرد المركزي ، قم بتعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة (لكن لا تغير الوسط) ، ثم احتضن اللوحة لمدة 4-6 ساعات في حاضنة.
5. بالنسبة للتعداء الأول ، استنشق أكبر قدر ممكن من الوسط الطافي من كل بئر (~ 3 مل) بعناية وأضف حجما متساويا من وسط التحفيز المسبق لنخاع العظم. إذا تم شفط بعض الخلايا عن طريق الخطأ أثناء الإجراء ، فقم بجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا بكمية صغيرة من وسط التحفيز المسبق ، ثم أضفها مرة أخرى إلى البئر.
6. بالنسبة للتعداء الثانوي ، في اليوم التالي ، قم بإزالة 2-3 مل من الوسط من كل بئر وأضف حجما متساويا من محلول مخزون الفيروسات القهقرية المذاب حديثا جنبا إلى جنب مع كميات مناسبة من HEPES والبوليبرين كما هو موضح في الجدول 4. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 1,500 × جم لمدة 90 دقيقة ، 37 درجة مئوية.
7. بعد الطرد المركزي ، قم بتعليق الخلايا برفق واستمر في احتضان اللوحة في الحاضنة لمدة 4-6 ساعات.
8. يستعاض عن الوسيط كما في الخطوة 4.5. احتضان لمدة 24 ساعة.

5. إجراء اختبار CCK-8 في المختبر (3-4 أيام)

1. شطف الآبار بقوة لجمع خلايا نخاع العظام. اغسل اللوحة باستخدام PBS التي تحتوي على 2٪ FBS للحصول على أكبر عدد ممكن من الخلايا. قم بتصفية الخلايا من خلال غربال 70 ميكرومتر واحسب الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق كما هو موضح في الخطوة 3.4.
2. الطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS و mIL-3 و mIL-6 (10 نانوغرام / مل) و mSCF (100 نانوغرام / مل) إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل. خذ ~ 0.5-1 × 10⁶ خلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وقم بتخزين حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الجيني.
4. أضف الخلايا إلى ألواح 96 بئرا بكثافة 1 × 10⁴ خلايا لكل بئر. اصنع ستة آبار مكررة لكل مجموعة. أضف 100 ميكرولتر من PBS المعقم إلى دائرة من الآبار حول الآبار حيث يتم زرع الخلايا. احتضان لمدة 0 و 24 و 48 و 72 ساعة.
5. قم بشفط الوسط بعناية من اللوحة المكونة من 96 بئرا في النقطة الزمنية المقابلة. أضف 110 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على 1/10 حجم من CCK-8 إلى الآبار. قم بإعداد مجموعة فارغة (متوسطة فقط و CCK-8 ، بدون خلايا). احتضان في الحاضنة لمدة 1 ساعة.
6. اقرأ قيمة الامتصاص 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق.
7. استخدم البرامج الإحصائية لتحليل البيانات التجريبية ، والتعبير عن البيانات التجريبية كمتوسط ± انحراف معياري (متوسط ± SD). تحليل الفروق بين المجموعتين باستخدام اختبار t للعينات المستقلة ، حيث يشير P < 0.05 إلى وجود فرق ذي دلالة إحصائية.

6. التحقق من تحرير الجينات (5-7 أيام)

1. استخرج الحمض النووي الجيني (الخطوة 5.3) باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجيني وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
2. تصميم الاشعال التي تضخيم منطقة 200 إلى 500 نقطة أساس تتمحور حول موقع قطع sgRNA (الجدول 5).
3. لتسلسل Sanger ، قم بإعداد الخليط كما في الجدول 6 ل PCR. قم بتضخيم شظايا الجينات المستهدفة باستخدام جهاز تدوير حراري على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 40 دورة (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 9 ثوان) ، 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 4 درجات مئوية ∞.
   ملاحظة: يمكن أيضا التحقق من تحرير الجينات باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) ، ويحتاج منتج PCR إلى التنقية باستخدام مجموعة تنقية ل NGS.
4. تحليل نتائج تسلسل Sanger على موقع TIDE (http://tide.nki.nl). احسب كفاءة تحرير sgRNA عن طريق إدخال تسلسل sgRNA ونتائج التسلسل من كل من المجموعات التجريبية والضابطة في هذه الأداة عبر الإنترنت.
   ملاحظة: قم بتحليل نتائج NGS باستخدام CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷. أدخل القراءات المزدوجة (ملفان) أو قراءات أحادية الطرف (ملف واحد) بتنسيق fastq أو fastq.gz من تجربة تسلسل عميقة ، جنبا إلى جنب مع تسلسل مرجعي وتسلسل sgRNA. سيقوم البرنامج بتقييم وتحديد الطفرات المستهدفة.

تأثير خروج المغلوب Trp53 على القدرة التكاثرية للفأر HSPCs
هنا ، استخدمنا Trp53 بالضربة القاضية كمثال لإثبات هذا البروتوكول. للتحقيق في تأثير خروج المغلوب Trp53 على القدرة التكاثرية ل HSPCs للفأر ، استخدمنا تعداء الفيروسات لإدخال Trp53...

تم استخدام تقنية CRISPR / Cas9 على نطاق واسع في الأبحاث الطبية الحيوية نظرا لطبيعتها سهلة الاستخدام وكفاءتها العالية ، مما يسهل التطبيق مثل فحص وظائف الجينات¹⁸ ، ونمذجة الأمراض¹⁹ ، والعلاج المناعي²⁰ ، ووضع العلامات على الخلايا الحية والتص...

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

نود أن نشكر جامعة بكين للطب الصيني على استخدام خدماتها المشتركة لإكمال هذا البحث. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق العلماء الشباب التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31701280 إلى J. Zhang).