Este nuevo método para analizar la transcripción inversa puede decirnos cosas nuevas sobre el campo de la virología retro. Por ejemplo, podemos aprender sobre los detalles de cómo funcionan los factores de restricciones celulares o cómo los medicamentos antirretrovirales inhiben la síntesis de ADN VIH1. La principal ventaja de esta técnica es que no sólo proporciona información sobre la secuencia de scrips Nascent Reverse Tran, sino que permite mapear su preciso termini de ADN de 3 primos a una única resolución nuclear estrecha.
El enriquecimiento de los ADN1 complementarios del ADN al por mayor de las células infectadas por el VIH1, se realiza mediante captura híbrida y debe llevarse a cabo en una estación de trabajo de PCR. Preparar una mezcla maestra de perlas magnéticas de estreptavidina mediante la encabezación de un tubo de cien microlitros de perlas por muestra en un solo tubo de micro centrífuga colocar el tubo en un imán adecuado para tubos de micro centrífuga. Después de que las perlas se hayan asentado hacia el lado del imán del tubo, retire el búfer de almacenamiento, retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas en quinientos microlitros de lavado aglutinante o tampón BW.
Coloque el tubo de nuevo en el imán, espere a que las perlas migren al imán y retire el sobrenadante. Retire el tubo del imán, agregue quinientos microlitros de solución de caseína, vuelva a suspender las perlas e incubar a temperatura ambiente durante diez minutos. Después de diez minutos, lave las perlas con el tampón BW.
Coloque el tubo de nuevo sobre el imán, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en quinientos microlitros de tampón BW. Añadir cincuenta picomoles de cada oligonucleótido biotinilotados capturados por muestra. Incubar a temperatura ambiente mientras se balancea en una mezcladora de extremo sobre extremo durante treinta minutos.
A continuación, devuelva el tubo al imán, retire el sobrenadante, retire el tubo del imán, agregue quinientos microlitros de 1x diez tampón, y vuelva a suspender las perlas. Después del segundo lavado re suspende las perlas con los oligonucleótidos inmovilizados en diez microlitros de 1x diez tampón por muestra. Para cada muestra, etiquete un tubo de microcetrofugo y agregue diez microlitros de suspensión de cuentas, ciento setenta microlitros de ADN y noventa microlitros de 3x diez tampón.
Incubar en un bloque de calor seco a noventa y dos grados centígrados durante dos minutos para desalentar el ADN. Mueva los tubos a un bloque de calor seco diferente, que se establece en cincuenta y dos grados centígrados, e incubar durante una hora. Cada diez minutos durante esta incubación, invierta los tubos para mezclar.
Cuando se haga la incubación de una hora, lave las cuentas una vez con quinientos microlitros de 1x tampón de diez, y vuelva a suspender en treinta y cinco microlitros de agua libre de nucleasas. Asegúrese de que las perlas se asienten bien dejando los tubos en el imán durante unos tres minutos antes de retirar cualquier líquido. Para eluir, incubar los tubos a noventa y dos grados centígrados en un bloque de calor seco durante dos minutos.
A continuación, mueva rápidamente los tubos sobre el imán, un tubo a la vez. Una vez que las perlas estén unidas a un lado del tubo, transfiera el sobrenadante que contiene el ADN VIH1 a un tubo nuevo. Para comenzar este procedimiento, vuelva a suspender el adaptador liofilizado a cien micromolares en agua libre de nucleasas y vórtice el tubo.
Por muestra, más una muestra de control, combinan cero punto cuatro cinco microlitros de 10x T4 T4 DNA ligasa buffer, cuatro microlitros de adaptador, y punto cero cinco microlitros de agua libre de nucleasa. Caliente a noventa y dos grados Celsius durante dos minutos, y luego deje que se enfríe lentamente a dieciséis grados Celsius en una máquina pcr. Esto permitirá que el adaptador forme una estructura de pasador de pelo.
El paso clave en este procedimiento es la ligadura eficiente e imparcial de moléculas adaptadas para abrir termini de ADN de 3 primos. Las moléculas de ADNn. naciente purificadas de longitud variable se ligan a un adaptador de ADN trenzado único con una sola horquilla utilizando la ligasa de ADN T4. El adaptador lleva una secuencia aleatoria de seis códigos de barras de nucleótidos, que permite el paring para facilitar la ligadura, y al mismo tiempo sirve como identificador de lecturas únicas.
El adaptador termini de 3 primos lleva un espaciador para evitar la auto ligadura. Para establecer sesenta reacciones de ligadura de volumen final de microlitros, añada lo siguiente a cada tubo PCR: seis microlitros de tampón de 10x T4 de ligasa de ADN, veinticuatro microlitros de cuarenta por ciento PEG, seis microlitros de cinco molares Betaine, cuatro microlitros de punto cinco de adaptador, un punto dos microlitros de ligasa de ADN T4 y dieciocho microlitros puntuales de ADN. Después de mezclar bien las reacciones, incubar en una máquina de PCR a dieciséis grados centígrados durante la noche.
El día después de la ligadura del adaptador, a treinta microlitros de formamida que contienen tampón de carga de gel de ADN a cada reacción de ligadura y se mezclan bien por rumbo de la tubería. Caliente en una máquina pcr a noventa y cuatro grados centígrados durante dos minutos y luego póngase inmediatamente sobre hielo. El siguiente paso es prepararse para desnaturalismo de la electroforesis de gel.
Coloque un gel de poliacrilamida desnatural desnatural de seis por ciento de TBE pre fundido en un tanque de gel adecuado y agregue 1x TBE tampón de funcionamiento. Precote el gel durante veinte minutos. A continuación, utilice una jeringa y una aguja de calibre veintiún para lavar los bolsillos del gel con tampón de funcionamiento.
A continuación, cargue treinta microlitros por pozo de la misma muestra en tres pozos. Es aconsejable ejecutar sólo una muestra por gel para evitar la contaminación cruzada. Corre durante veinte minutos.
Mientras el gel está en marcha, prepare tres tubos de microcentrífuga de cinco mililitros de punto cero por muestra utilizando una aguja de jeringa de veintiún calibres para hacer agujeros en la parte inferior. Inserte cada uno de los tubos preparados en un tubo de micro centrífuga de dos mililitros y etiquete con el nombre de la muestra más bajo, medio o alto. Cuando el frente de tinte azul oscuro esté a medio camino del gel, detenga la electroforesis y retire el cassette de gel.
Abra el cassette y corte el gel verticalmente con una cuchilla de afeitar. Para extirpar generosamente la tira con tres pozos de muestras cargadas. Añadir la tira de gel a un recipiente con 1x TBE y cinco microlitros de la mancha de ácido nucleico de cianina e incubar durante tres a cinco minutos.
Asegúrese de que la tinción sea suficiente para identificar fácilmente la parte superior del adaptador libre que se va a quitar más adelante. A continuación, limpie a fondo la superficie de un transilluminador de luz azul con agua desionizada destilada. A continuación, saque la pieza de gel del recipiente de tinción y colóquela en la caja de luz.
Encienda la caja de luz e inspeccione los ácidos nucleicos manchados a través del filtro naranja. Aquí se muestra una muestra representativa de ADN ligado en un gel manchado. El adaptador normalmente aparece sobrecargado y se ejecuta como una gran mancha con ADN VIH1 ligado que se extiende por encima como una raya.
Las líneas rojas indican los sitios en los que se debe cortar el gel para quitar el adaptador libre, y dividir la muestra en tres piezas pares. Con una nueva navaja, corta los lados del gel si hay áreas sin muestra cargada todavía presente. A continuación, corte justo encima del adaptador para quitar el adaptador y las partes inferiores del gel.
Finalmente, cortar la parte superior del gel incluyendo alrededor de un milímetro de los bolsillos del gel que a menudo tienen una señal intensa aguda de ADN de mayor peso molecular. Divida la pieza de gel restante que contiene la muestra horizontalmente en tres piezas uniformes. Zonas de bajo, medio y alto peso molecular.
Luego, corta cada uno de los tres fragmentos de gel en dos por dos piezas milimétricas y transfiéralos a los tubos de microcentrífuga de punto cero cinco mililitros preparados. Gire a máxima velocidad con tapas abiertas durante un minuto. Para exprimir las piezas de gel a través del agujero en el tubo de dos mililitros para crear una puré de gel.
Si quedan partículas de gel en la parte inferior del tubo de cinco mililitros de punto cero, transfiérelos al tubo de dos mililitros manualmente con una aguja. Comience el procedimiento de extracción de ADN añadiendo un mililitro de tampón de extracción de gel de urea al puré de gel en cada tubo de microcentrífuga. Gire los tubos con un mezclador extremo sobre extremo a temperatura ambiente durante un mínimo de tres horas.
Prepare las columnas de filtro. Utilice un conjunto limpio de pinzas para agregar un pequeño filtro redondo de fibra de vidrio a cada columna centrífuga con filtros de membrana de acetato de celulosa, lo que evita la obstrucción de la membrana. Coloque el filtro en su lugar con una punta de cabeza de tubería invertida.
Gire brevemente los dos tubos de mililitro con puré de gel y tampón de extracción en una microcentrífuga, y transfiera setecientos microlitros del sobrenadante a las columnas de filtro preparadas. Centrifugar las columnas del filtro en una microcentrífuga a máxima velocidad durante un minuto. A continuación, transfiera el flujo a través de un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Vuelva a cargar las columnas con el sobrenadante restante. Trate de obtener tanto líquido como sea posible de la toalla de extracción y no se preocupe si las piezas de gel están incluidas. Gira otra vez.
Combine el flujo a través de las mismas muestras de extracción y proceda como se describe en el protocolo de texto. Este protocolo se empleó en muestras de células CEMS-ST infectadas con VIH-1 deficiente de Vif en ausencia o presencia de la proteína humana antirretroviral A3G. Una gráfica del número total de lecturas únicas obtenidas de cada muestra indica que el aumento de los niveles de A3G reduce el número total de lectura.
Reflejar el efecto inhibitorio de A3G en la síntesis de cdna mediada por la transcriptasa inversa. En estas tres gráficas siguientes, la fracción de moléculas en cada longitud posible dentro de los primeros ciento ochenta ochenta y dos nucleótidos, se muestra en histogramas azules. La adición de A3G costó un fuerte aumento de moléculas de cdna truncadas más cortas en unas pocas posiciones reproducibles muy específicas.
Las líneas rojas discontinuas, muestran los porcentajes de lecturas que llevan mutaciones de C a T en la posición respectiva. Un control positivo se puede producir mediante el procesamiento de un conjunto de oligonucleótidos sintéticos de secuencia de conocimiento, longitud y concentración. Todas las moléculas deben aparecer en abundancia cercana a igual con sólo pequeñas variaciones.
Si una ejecución de biblioteca produce un sesgo de longitud menor, en la secuenciación, es aconsejable aplicar un factor de normalización que se deriva de la pendiente que representa el sesgo de tamaño. Este procedimiento se puede adaptar fácilmente a otros sistemas en los que la determinación de los tres extremos principales de las moléculas de ADN añadiría información clave sobre las ares del metabolismo del ácido nucleico. Por favor, no olvide que trabajar con el VIH puede ser extremadamente peligroso y algunas infecciones solo deben llevarse a cabo en laboratorios de seguridad designados.
