El laboratorio Yeh es apoyado por fondos de investigación de la Sociedad Americana del Cáncer Institucional de Becas de Investigación (GRI-97-219-14) otorgado al Centro de Cáncer Hollings en MUSC, mediante financiación de la investigación de una subvención del Departamento de Defensa (W81XWH-11-2- 0229) en MUSC, y por un premio de la Fundación La preocupación (a ESY).

El protocolo sigue las directrices y normas de cuidado de los animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC) y su Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Disección de pulmón <ol><li> La disección del tumor mamario (opcional, dependiendo de los objetivos del estudio y si se realizó un análisis del tumor primario o vena de la cola de la inyección). <ol><li> La eutanasia del ratón utilizando una dosis letal de anestesia con isoflurano según IACUC y la regulación de la universidad. Confirme la eutanasia por dislocación quirúrgica. </li><li> El tablero de la espuma, el pin con alfileres de disección mediante la colocación del ratón sobre la espalda con los miembros propagación. </li><li> Pulverizar ratón con etanol al 70%. </li><li> El uso de pinzas, sujete la parte inferior del animal en el centro. </li><li> El uso de tijeras, corte hacia arriba, hacia el cuello a través de la piel, teniendo cuidado de no perforar la cavidad peritoneal del ratón. </li><li> Reduzca la piel en las extremidades para revelar el tejido tumoral. </li><li> Diseccionar tejido tumoral y preserva por método preferido, como la congelación o la fijación, para su posterior análisis (no se analiza en este protocolo). </li></ol></li><li> Disección de tejido pulmonar. <ol><li> Si el tejido tumoral fue cosechada como se describe anteriormente, precisar cualquier exceso de piel. </li><li> El uso de pinzas, sujete el peritoneo en el extremo inferior del animal y empezar a cortar hacia arriba, hacia la base del cuello. </li><li> Cuidadosamente corte a lo largo de los lados izquierdo y derecho de la caja torácica teniendo cuidado de evitar la ruptura de cualquier vasos sanguíneos que pueden sangrar en la cavidad torácica. Quitar los huesos de las costillas por corte a la izquierda y derecha a través de las porciones de diafragma y superior de la caja torácica. </li><li> Con unas pinzas captar la tráquea del ratón y tire hacia adelante. </li><li> Sever la tráquea con tijeras de disección y quitar los pulmones del ratón. Nota: El corazón puede permanecer unido al pulmón. Si esto ocurre, diseccionar cuidadosamente corazón lejos de los pulmones teniendo cuidado de recoger todos los cinco lóbulos (véase la Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Lavar suavemente con PBS para eliminar el exceso de sangre. </li></ol></li><li> Evaluación bruto del tejido pulmonar. <ol><li> Opción 1: En imágenes in vivo. <ol><li> Para imágenes de la luciferasa, ~ 10 min antes de la imagen, dar a los animales a / kg dosis 150 mg de luciferina por inyección intraperitoneal (ip). Pulmones de la imagen en vivo en animales anestesiados o si se retira después de la disección (Figura 2) 5. </li></ol></li><li> Opción 2: Evaluación Bruto. <ol><li> Examinar los pulmones bajo microscopio estereoscópico para visualizar nódulos tumorales. Nota: Si las células son GFP marcado, un estereomicroscopio de fluorescencia capaz contiene un cubo de luz con los máximos de excitación / emisión apropiado (por ejemplo cerca de 470/510 nm) para detectar GFP puede ser utilizado para examinar los pulmones estereoscópica para la fluorescencia antes del procesamiento. </li></ol></li><li> Si los pulmones se van a analizar inmediatamente, proceda a la sección &quot;Aislamiento de ARN &#39;. De lo contrario, romper el tejido congelado usando jabón lIdentificación del nitrógeno o hielo seco. Almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento de ARN Nota: Para el análisis representativo, el RNA se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARN (ver Lista de Materiales). Mientras que el análisis actual utiliza productos de un fabricante específico, una variedad de kits de aislamiento están disponibles de varios proveedores de confianza. Además, los métodos de centrifugación no basados ​​en kit son también una opción. cDNA también debe prepararse a partir de una muestra positiva de ARN de control, tal como una línea celular o plásmido, por análisis de la curva estándar. Por otra parte, un control positivo específico para el conjunto de sonda cebador puede ser comprado (ver Lista de Materiales). <ol><li> Si el uso de tejido previamente congelado, recopilar tejido congelado en hielo seco. </li><li> Homogeneizar tejido usando uno de los siguientes métodos tales como: mortero y una maja de molienda realizado por mano sobre hielo seco después de la congelación del tejido en nitrógeno líquido; homogeneizador de tejidos o dispositivo disociación mecánicapor sugerencia del fabricante; sonicación, u otro método preferido. Nota: Para el análisis representativo, el método preferido de homogeneización es sonicación. <ol><li> Para el análisis que se presenta en la Figura 3, preparar tampón de lisis (proporcionado en el kit de aislamiento de ARN) y 2-mercaptoetanol en una proporción de 20 l 2-mercaptoetanol por cada 1 ml de tampón de lisis. Tejido Resuspender en 300 l de tampón de lisis suplementado con 2-mercaptoetanol por cada 30 g de tejido y someter a ultrasonidos durante 10 s con sonicador fijado en 30% de la amplitud. </li><li> Si el uso de mortero, tejido fundamental resuspende en tampón de lisis 300 l después de la molienda. </li></ol></li><li> Añadir 10 l de proteinasa K a 590 l de tampón TE (Tris-HCl 10, pH 8,0; EDTA 1 mM). Añadir solución de 600 l de proteinasa K a cada 300 l (es decir, por cada 30 mg) de tejido. Incubar durante 10 min a TA. Nota: El tiempo de digestión puede variar. </li><li> Centrifugar las muestras en ≥13000 g durante 10 min para eliminar los residuos. </li><li> Transferir el sobrenadante a nuevos tubos. </li><li> Añadir 450 l de etanol (96% -100%) por cada 900 l de sobrenadante para precipitar el ARN. </li><li> Transferir 700 l de la mezcla de lisado / etanol a la columna. </li><li> Centrifugar las muestras en ≥13,000 g durante 1 minuto para unir ARN a la columna. </li><li> Deseche los residuos líquidos y añadir restante sobrenadante a la columna y girar de nuevo. </li><li> Una vez que todo el lisado se centrifuga a través de la columna, añadir 350 l de tampón de lavado 1 a la porción superior de las muestras de la columna y centrifugar a ≥13,000 g durante 30 seg. </li><li> Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior. </li><li> Preparar DNasa mediante la mezcla de 5 unidades de DNasa I enzima con 5 l de 10x DNasa y 40 l de DNasa / RNasa libre de agua por muestra (volumen total de 50 l / muestra). </li><li> Añadir 50 l de DNasa mezclan a cada columna y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Añadir 350 l de tampón de lavado 1 a la columna y centrifugar samples en ≥13,000 g durante 30 segundos. </li><li> Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior. </li><li> Añadir 600 l de tampón de lavado 2 a la columna y girar 30 segundos a ≥13,000 g. </li><li> Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior. </li><li> Añadir 250 l de tampón de lavado 2 y centrifugar durante 2 minutos a ≥13,000 g. </li><li> Ponga parte de la columna en un nuevo tubo de recogida y desechar el tubo de recogida de edad. </li><li> Añadir 50-100 l de RNasa / DNasa agua libre a la columna y se incuba durante 1 min. </li><li> Haga girar durante 1 min a ≥13,000 g. </li><li> Vuelva a ejecutar eluato recogido a través de la columna para aumentar el rendimiento de ARN. </li><li> Para su uso inmediato, mantener las muestras en hielo y proceder a la cuantificación. Para su uso posterior, snap congelado en hielo seco o nitrógeno líquido. Conservar a -80 ° C congelador hasta que sea necesario. </li></ol> 3. Primer capítulo de síntesis Nota: Para el análisis representativo, la transcriptasa inversa (RT) se llevó a cabo una reacción Fkit de síntesis de ADNc rimer Strand diseñado para QRT-PCR (véase la Lista de Materiales). <ol><li> Si se recogieron muestras previamente, descongelar tubos en hielo. </li><li> Medir la cantidad de ARN usando un espectrofotómetro. </li><li> El uso de 0,5-2 g de ARN total, realice primera síntesis de la cadena utilizando transcriptasa inversa para generar ADNc de valores. <ol><li> En, tubos de RNasa / PCR libre de DNasa / placas estériles, preparar la mezcla de reacción (Tabla 1). Mezclar suavemente y centrifugar. Programar una máquina de PCR estándar (Tabla 2). </li></ol></li><li> Diluir la reacción final de volumen deseado (generalmente 50 a 100 l) con agua libre de nucleasa estéril. </li></ol> 4.-PCR en tiempo real Nota: Para el análisis representativo, se utilizó SYBR verde. Sin embargo, cualquier método preferido puede estar sustituido en la discreción del usuario. <ol><li> El uso de un ADNc control positivo, configure una curva estándar para cada conjunto de cebadores. <ol><li> Para el análisis muestra in la figura 3, preparar la curva patrón para HER2 humano utilizando el fabricante recomienda ADNc control positivo (ver Lista de Materiales). Para GAPDH de ratón, utilice el ADNc de pulmón control negativo para generar una curva estándar. Para cada sonda, en serie diluir el ADNc de 1: 4 para generar 5 estándares. </li></ol></li><li> Calcular el número de muestras en total, que debe incluir la curva estándar y las muestras experimentales. Nota: Para el análisis se describe aquí, se analizaron 2-3 repeticiones experimentales por muestra. Se realizó análisis de la curva estándar para generar un modelo de regresión lineal simple que se puede aplicar para determinar la cantidad relativa de HER2 y GAPDH por muestra para calcular la cantidad normalizada final. Este análisis también se asegurará de que la eficiencia de imprimación es adecuada para el análisis que nos ocupa. </li><li> En un / tubo estéril libre de DNasa, RNasa, preparar mezcla maestra (Tabla 3). <ol><li> Calcula master mix amount por muestra. Escala para más de una muestra. Utilice una mezcla maestra para cada gen de interés experimental, así como un control interno como GAPDH. Utilice cebadores para GAPDH a una concentración final de 200 nM. Nota: El control interno es particularmente útil cuando se trata de distinguir entre el origen de células humanas y de ratón. Nota: Concentración Primer para HER2 se optimizó y determinado por el fabricante. </li></ol></li><li> Preparar la placa de ensayo que contiene 1 mu l cDNAs correspondientes a cada muestra estándar o experimental. Asigne al menos 1 cDNA muestra / pocillo para cada sonda de imprimación. Añadir 19 l de mezcla maestra por pozo para cada sonda de imprimación. Nota: Para los datos representativos en la figura 3, se analizaron las muestras de cDNA por duplicado para cada sonda de imprimación y se representan como la media de las dos muestras. </li><li> Reacción Ejecutar en máquina de QRT-PCR utilizando recomienda o previamente probado protocolo de PCR. Ver Tabla 4 </strong&gt; para el protocolo de PCR utilizado para los datos representativos en la Figura 3 y la Figura 4. </li></ol>

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	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY y MAA no son empleados por FirstString Research Inc. y no tienen ningún interés financiero en la compañía. FirstString Research Inc. proporcionó los datos de imagen de la luciferasa que fue presentado en este manuscrito. GSG es presidente y CEO de FirstString Investigación. CLG es un empleado de FirstString Investigación. GSG y CLG tienen opciones de acciones emitidas por FirstString Investigación.

Este protocolo describe el uso de QRT-PCR para evaluar mamaria metástasis de células tumorales al pulmón utilizando un modelo de xenoinjerto de ratón. Se reconoce que otras técnicas, incluyendo bioluminiscente de imágenes, están disponibles y también son eficaces para la detección de metástasis a pesar de tener sus propios valores y limitaciones. Los datos presentados sugieren que QRT-PCR proporciona una medida eficaz de detectar mRNA derivadas de tumores en el tejido pulmonar para la cuantificación de la met...

Análisis de QRT-PCR se propone como un método para evaluar la metástasis del tumor. Este método se propone como una alternativa para los usuarios que están interesados ​​en la evaluación de la metástasis, pero no pueden tener acceso a equipos específicos, como in vivo equipos de imagen o un estereoscopio capaz de fluorescencia. Una discusión de los métodos comúnmente utilizados se muestra seguido por una demostración de cómo el análisis de QRT-PCR se puede utilizar ya sea como un separado o como un método compañero para evaluar la metástasis. Este procedimiento tiene el potencial de proporcionar un análisis cuantitativo de la carga metastásica. Los métodos estándar de análisis bruto, incluyendo la visualización de los pulmones bajo un microscopio estereoscópico, así como seccionamiento en serie seguida de hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción del tejido pulmonar, son cuantificables, pero dependen en gran medida de los parámetros definidos por el usuario para el recuento de 2-5. Al evaluar los pulmones enteros utilizando un microscopio estereoscópico, sólo las grandes metástasis superficiales son visible y análisis requiere que el investigador tenga conocimiento razonable de la estructura anatómica pulmonar para determinar lo que constituye una lesión metastásica. Etiquetado fluorescente de las células tumorales con un marcador tal como GFP y el uso de un microscopio estereoscópico que contiene un cubo de luz con los máximos apropiados de excitación / emisión (por ejemplo, cerca de 470/510 nm para GFP) ayuda en este proceso, pero sólo nódulos tumorales superficie son detectables . Además, la fluorescencia de la contaminación de la sangre, que es visible bajo los mismos parámetros que las buenas prácticas agrarias, puede conducir a la falsa identificación de posibles lesiones metastásicas. Seccionamiento del pulmón seguido por tinción con H &amp; E para visualizar metástasis de pulmón es un método útil para evaluar las micrometástasis y otros procesos microscópicos incluyendo infiltración de células inmunes, pero a menudo requiere el uso de todo el tejido pulmonar para inclusión en parafina, seccionando, y los procedimientos de tinción. Por lo tanto, los procedimientos posteriores no son ideales siguiendo ese methore. Aunque cuantificable, este procedimiento requiere que el investigador para evaluar un gran número de secciones de pulmón teñidas por animal para asegurar que el análisis representa toda la estructura 3D del pulmón. En consecuencia, este tipo de examen es mucho tiempo, puede conducir a error a contar, y el análisis se basa principalmente en la discreción del investigador. Varias de las técnicas de imagen in vivo (por ejemplo, MRI, PET, SPECT) se utilizan actualmente para llevar a cabo o probar los procesos biológicos en modelos de roedores experimentales 8. En bioluminiscente de imágenes in vivo es un método común utilizado para adquirir una visión bruto de metástasis 9. Esta técnica se aplica generalmente para evaluar la presencia de actividad de informador de luciferasa debido a la acumulación de las células tumorales, que están diseñados para contener un elemento de respuesta de la luciferasa, que residen en órganos específicos, como la glándula mamaria después de la implantación de células tumorales y el pulmón a metástasis espontánea 10. La visualización de la actividad de informador de luciferasa se ​​induce por la presencia de sustrato de luciferina (D-luciferina). Luciferasa cataliza la descarboxilación oxidativa de D-luciferina a oxiluciferina la generación de bioluminiscencia. Aunque informativa, este método está limitado por varios factores, incluyendo la estabilidad del sustrato (es decir, la vida media corta), la distribución adecuada de sustrato que depende de cómo se entrega a los animales de experimentación, y la baja sensibilidad de detección 9. Un mérito principal de esta técnica es que es no invasivo, se puede realizar en animales vivos, y puede conducir a la detección de metástasis de células tumorales en múltiples órganos que pueden no haber sido normalmente cosechadas en la disección 9,10. Un aspecto positivo de la in vivo las técnicas de imagen es que el tejido pulmonar no perturbado permitiendo procedimientos secundarios como la inclusión en parafina o como se presenta aquí, el análisis QRT-PCR. Sin embargo, debido QRT-PCR es theoreticaLLY una medida más sensible de detección, evaluación bruto no puede revelar un número bajo de células tumorales presentes en el pulmón. Si bien es útil, las técnicas de imagen descritos anteriormente pueden ser sustituidos o complementarse con el método de QRT-PCR descrito actualmente. QRT-PCR tiene el potencial de proporcionar una medida sensible de mRNA derivados del tumor dentro de un pulmón.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

La enfermedad metastásica es la propagación de las células tumorales malignas desde el sitio del cáncer primario a un órgano distante y es la causa principal de muerte de cáncer asociado 1. Los sitios comunes de diseminación metastásica incluyen pulmón, ganglios linfáticos, el cerebro y la médula 2. Mecanismos que impulsan la metástasis son áreas intensas de la investigación del cáncer. En consecuencia, los ensayos eficaces para medir la carga metastásica en sitios distantes de las metástasis son instrumentales para la investigación del cáncer. Evaluación de metástasis de pulmón en modelos tumorales mamarias se realiza generalmente mediante la observación cualitativa bruto de tejido pulmonar después de la disección. Los métodos cuantitativos de evaluación de metástasis se limitan actualmente a ex vivo y en técnicas de imagen basadas vivo que requieren parámetros definidos por el usuario. Muchas de estas técnicas se encuentran en todo el nivel de organismo en lugar del nivel celular 3-6. Aunque los métodos de imagen más recientes que utilizan microscopía de múltiples fotones son capaces de evaluar MetasTasis a nivel celular 7, estos procedimientos altamente elegantes son más adecuadas para la evaluación de los mecanismos de difusión en lugar de la evaluación cuantitativa de la carga metastásica. Aquí, se presenta un método simple in vitro para evaluar cuantitativamente la metástasis. Usando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR), el ARNm de células específicas de tumor se puede detectar en el tejido de pulmón de ratón.

Más allá del tiempo necesario para realizar la inoculación inicial de las células tumorales en el animal experimental y, si la realización, el análisis primario del tumor in vivo, la cosecha de tejidos, aislamiento de ARN, y el análisis de QRT-PCR es un procedimiento en 1-2 día (Figura 1) . Un ejemplo de análisis bruto es bioluminiscente de imágenes para evaluar las células tumoral...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K vistas.  Medical University of South Carolina.  Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón. 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico<em&gt; De Novo</em&gt; Metástasis del cáncer mamario

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Medicina

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes in vivo para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Resumen

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Capítulos en este video

Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis