葉ラボは、米国癌協会の制度研究助成（IRG-97-219-14）国防総省の助成金から研究資金により、MUSCでHollingsがんセンターに授与（W81XWH-11-2-から研究資金によってサポートされています0229） MUSCで、と懸念（ESY）は財団から賞を受賞することによって。

プロトコルは、サウスカロライナ医科大学（MUSC）とその施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインや動物のケアの標準に準拠しています。 1.肺解剖<ol><li>乳腺腫瘍解剖（オプションの研究の目標にし、原発腫瘍の解析または尾静脈注射が行われたかどうかによって異なります）。 <ol><li> IACUCと大学の規則に従ってイソフルラン麻酔の致死量を使用して、マウスを安楽死させます。外科的脱臼により安楽死を確認してください。 </li><li>発泡ボード、手足の広がりとその背中にマウスを置くことによって解剖ピンとピンの。 </li><li> 70％エタノールでマウスをスプレーします。 </li><li>ピンセットを使用して、中央の動物の下部をつかみ。 </li><li>はさみを使用して、マウスの腹腔に穴を開けないように注意しながら、皮膚を介して首に向かって上方にカット。 </li><li>腫瘍組織を明らかにするために手足の皮膚をカットバック。 </li><li>腫瘍組織とPRを解剖そのような（このプロトコルでさらに議論されていない）、さらなる分析のために凍結または固定、などの好適な方法によってESERVE。 </li></ol></li><li>肺組織切開。 <ol><li>前述のように腫瘍組織を採取した場合は、余分な皮膚を突き止めます。 </li><li>鉗子を使用して、動物の下端に腹膜をつかみ、首の付け根に向かって上向きに切断開始。 </li><li>慎重に胸腔内に出血する可能性のある血管を切断ないように注意しながら胸郭の左右両側に沿って切断。左と右胸郭の振動板と上部を切断することにより、肋骨の骨を削除します。 </li><li>鉗子を使用すると、マウスの気管をつかみ、前方に引き出します。 </li><li>解剖ハサミで気管を切断し、マウスから肺を削除します。 注意：心臓は肺に付着したままであってもよいです。この問題が発生した場合、慎重にすべての5つの葉を収集するように注意して肺から離れて心を解剖（ 図1を参照してください </stroNG&gt;）。 </li><li>過剰血液を除去するためにPBSで穏やかに洗浄します。 </li></ol></li><li>肺組織の肉眼評価。 <ol><li>オプション1：in vivoイメージング 。 <ol><li>ルシフェラーゼイメージング、撮像前に〜10分のために、動物に腹腔内（ip）注射によるルシフェリン150mgの/ kgの用量を与えます。麻酔した動物や解剖後の除去（ 図2）5時の生体内での画像の肺。 </li></ol></li><li>オプション2：総評価。 <ol><li>腫瘍結節を視覚化するために実体顕微鏡下肺を調べます。注意：細胞は、GFP標識されている場合は、GFPを検出する（510分の470 nm付近など ）、適切な励起/発光極大を有する光キューブを含むことが可能な蛍光実体は、処理の前に蛍光を立体的に肺を調べるために使用することができます。 </li></ol></li><li>肺は直ちに分析する場合は、「RNAの単離」セクションに進んでください。それ以外の場合は、liquを使用して凍結組織をスナップID窒素やドライアイス。 -80℃で保存してください。 </li></ol></li></ol> 2. RNAの単離注意：代表的な分析のために、RNAは、RNA単離キット（材料リストを参照）を用いて単離しました。現在の分析は、ある特定のメーカーの製品を使用していますが、単離キットの様々ないくつかの評判のベンダーから入手できます。さらに、非キットベースの遠心分離法も選択肢です。 cDNAを、標準曲線分析のために、そのような細胞株またはプラスミドとして、陽性対照RNAサンプルから調製されるべきです。あるいは、プライマープローブセットに特異的な陽性対照は、（材料のリストを参照）を購入することができます。 <ol><li>以前に凍結組織を使用する場合は、ドライアイス上で凍結組織を収集します。 </li><li>など、次の方法のいずれかを使用して組織をホモジナイズ：液体窒素中で組織を凍結した後、ドライアイスの上に手で行わ研削乳鉢と乳棒を。組織ホモジナイザーまたは機械的解離デバイスメーカーの提案につき、超音波処理、または他の好適な方法。 注意：代表的な分析のために、均質化の好ましい方法は、超音波処理です。 <ol><li> 図3に示す分析のために、溶解緩衝液の各1 mlのために20μlの2-メルカプトエタノールの割合で溶解（RNA単離キットで提供される）バッファ及び2-メルカプトエタノールを調製します。 30％の振幅に設定ソニケーターで10秒のための組織と超音波処理の各30グラムのために2-メルカプトエタノールを補充した300μlの溶解緩衝液中で再懸濁組織。 </li><li>乳鉢と乳棒を使用した場合、粉砕後、300μlの溶解緩衝液中で粉砕組織を再懸濁します。 </li></ol></li><li> 590μlのTEバッファー（; 1mMのEDTA、10mMのトリス-HCl、pH8.0）に10μlのProteinase Kを追加します。組織の（ すなわちすべての30mgのための）すべての300μlに600μlのProteinase K溶液を追加します。 RTで10分間インキュベートします。 注意：消化時間が異なる場合があります。 </li><li> ≥1で遠心サンプル破片を除去するために10分間3000グラム。 </li><li>新しいチューブに上清を移します。 </li><li> RNAを沈殿させ、上清の各900μlの450μlのエタノール（96％-100％）を追加します。 </li><li>カラムにライセート/エタノール混合物の700μlのを転送します。 </li><li> 1分間≥13,000gで遠心分離サンプルがカラムにRNAに結合します。 </li><li>液体廃棄物を捨て、カラムに残りの上清を追加し、再びスピン。 </li><li>すべての溶解液がカラムを回転させた後、30秒間≥13,000グラムでカラムと遠心サンプルの上部に洗浄緩衝液1の350μlを添加します。 </li><li>カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。 </li><li> 10倍DNアーゼの5μlのサンプルあたりのDNase / RNaseを含まない水（50μL/サンプルの総容積）の40μlのDNアーゼI酵素の5単位を混合することにより、DNアーゼを準備します。 </li><li>各列にDNアーゼミックス50μLを加え、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>カラムと遠心SAMに洗浄緩衝液1の350μLを追加30秒間≥13,000gでples。 </li><li>カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。 </li><li>カラムに洗浄バッファー2の600μlを添加し≥13,000gで30秒スピン。 </li><li>カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。 </li><li> ≥13,000gで2分間の洗浄バッファー2と遠心250μlのを追加します。 </li><li>新しいコレクションチューブにカラムの一部を入れて、古いコレクションチューブを捨てます。 </li><li>カラムにRNアーゼ/​​ DNアーゼフリーの水の50〜100μl添加し、1分間インキュベートします。 </li><li> ≥13,000gで1分間スピン。 </li><li>再実行したRNAの収量を増加させるためにカラムに通して回収した溶出液を。 </li><li>すぐに使用するために、氷上でサンプルを維持し、定量化に進みます。後で使用するために、ドライアイスや液体窒素の凍結スナップ。 -80℃の冷凍庫で保存が必要になるまで。 </li></ol> 3.ファーストストランドの合成注意：代表的な分析のために、逆転写酵素（RT）反応を行ったFQRT-PCRのために設計されIRSTストランドcDNA合成キット（材料リストを参照してください）​​。 <ol><li>サンプルは、以前に収集された場合には、氷の上にチューブを解凍。 </li><li>分光光度計を用いてRNAの量を測定します。 </li><li>トータルRNAの0.5~2μgのを使用して、cDNAのストックを生成するために逆転写酵素を用いて第一鎖合成を行います。 <ol><li>無菌の、RNアーゼ/ DNアーゼフリーPCRチューブ/プレートに、反応混合物（ 表1）を調製します 。穏やかに混合し、遠心します。標準的なPCR機（ 表2）をプログラム 。 </li></ol></li><li>無菌のヌクレアーゼフリー水を使用して所望の体積（一般的に50〜100μL）に完成した反応を希釈します。 </li></ol> 4.リアルタイムPCR 注意：代表的な分析のために、SYBRグリーンを使用しました。しかし、任意の好適な方法は、ユーザーの裁量で置換することができます。 <ol><li>陽性コントロールのcDNAを用いて、各プライマーセットのための標準曲線を設定します。 <ol><li>私が示した分析についてN図3は 、陽性コントロールのcDNAを推奨メーカーを使用して、 ヒト HER2のための標準曲線を作成（材料リストを参照してください）。マウスGAPDHについて、標準曲線を生成するために、陰性対照肺のcDNAを使用しています。 5基準を生成するために、4：各プローブについては、連続的cDNAの1に希釈。 </li></ol></li><li>標準曲線と実験試料を含めるべきで、総サンプル数を計算します。 注：ここで説明する分析のために、サンプルあたり2~3実験の反復を分析しました。標準曲線解析は、最終的な正規化された量を計算するために、HER2とサンプルあたりGAPDHの相対量を決定するために適用することができる単純な線形回帰モデルを生成するために実施しました。この分析はまた、プライマー効率が手元に分析するために十分であることを保証します。 </li><li>滅菌、RNアーゼ/ DNアーゼフリーのチューブでは、マスターミックス（ 表3）を調製 。 <ol><li>マスターミックスをamoun計算サンプルあたりトン。複数のサンプルのためにスケールアップ。関心の各実験の遺伝子だけでなく、GAPDHなど内部統制のためのマスターミックスを使用してください。 200nmの最終濃度でGAPDHのためのプライマーを使用してください。 注意：ヒトおよびマウス細胞由来を区別しようとしたときに内部統制は特に便利です。 注意：HER2のためのプライマー濃度が最適化され、製造業者によって決定されました。 </li></ol></li><li>各標準または実験サンプルに対応した1μlのcDNAを含有する試験プレートを準備します。各プライマープローブについても、少なくとも1 cDNAサンプル/を割り当てます。各プライマープローブにウェルあたりマスターミックス19μLを追加します。 注： 図3の代表的なデータのために、cDNAサンプルは、各プライマープローブの二重に分析し、2つのサンプルの平均値としてグラフ化。 </li><li>推奨または以前のPCRプロトコルを使用してテストQRT-PCR機で反応を実行します。 表4を参照してください </s図3と図4の代表的なデータのために使用されるPCRプロトコルのtrong&gt;。 </li></ol>

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	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESYおよびMAAはFirstStringリサーチ社で採用されていないと利害関係を持たないようにしてください。 FirstStringリサーチ社は、この原稿に提示されたルシフェラーゼ撮像データを提供します。 GSGはFirstStringリサーチの社長兼最高経営責任者（CEO）です。 CLGはFirstString研究の従業員です。 GSGとCLGはFirstStringリサーチが発行したストック・オプションを持っています。

このプロトコルは、異種移植マウスモデルを使用して肺に乳腺腫瘍細胞の転移を評価するために、QRT-PCRの使用を記載しています。それは、生物発光イメージングを含む他の技術は、利用可能であり、また、自分の価値観と限界を持つにもかかわらず、転移を検出するために有効であることが認められています。提示されたデータは、QRT-PCRは、総転移の定量のための肺組織内の腫瘍由来のmRNA?...

QRT-PCR分析は、腫瘍の転移を評価する方法として提案されています。この方法は、転移の評価に興味を持っているが、このようなin vivoイメージング機器や蛍光できるステレオスコープのような特定の機器へのアクセス権を持っていない可能性があり、ユーザーのための代替として提案されています。一般的に使用される方法の議論は、QRT-PCR分析は、分離してまたは転移を評価するためのコンパニオン方法としても使用することができる方法を実証するために続いて提示されます。この手順は、転移性負荷の定量的な分析を提供する可能性を有します。 実体顕微鏡下での肺の可視化だけでなく、肺組織のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行った連続切片を含む総分析の標準的な方法は、定量化可能であるが、2-5をカウントするためのユーザー定義のパラメータに大きく依存しています。実体顕微鏡を用いて全肺を評価する際に、唯一の大きな表面転移がVISIですBLEと分析は、転移性病変を構成するものを決定するために、肺の解剖学的構造の合理的な知識を持っている研究者を必要とします。例えば、GFP（例えば、GFPのための510分の470 nm付近）適切な励起/発光極大を持つ光キューブが含まれている実体顕微鏡の使用などのマーカーによる腫瘍細胞の蛍光標識、このプロセスを支援するが、表面だけの腫瘍結節が検出可能です。さらに、GFPと同じパラメータの下に表示されている血液汚染からの蛍光は、可能な転移病変の偽の身分証明書につながる可能性があります。 肺転移を可視化するために、H＆E染色に続いて肺の切片は、微小転移および免疫細胞の浸潤を含む他の微細なプロセスを評価するための有用な方法であるが、多くの場合、肺全体のパラフィン包埋のための組織、切片、および染色手順を使用する必要があります。そのため、下流の手順は、このメト次理想的ではありませんD。定量化が、この手順では、分析は、肺の全体の三次元構造を考慮していることを確認するために、動物あたり染色した肺切片の多数を評価するために研究者が必要となります。その結果、検査のこのタイプは時間がかかり、エラーをカウントにつながることができ、解析は研究者の裁量に大きく依存しています。 イメージング技術（例えば、MRI、PET、SPECT）は、現在、実験的なげっ歯類モデル8の生物学的プロセスを実行またはテストするために使用され、インビボでのいくつかの。 インビボでの生物発光イメージングは、転移9の全体のビューを取得するために使用される一般的な方法です。この技術は、一般に、腫瘍細胞移植後の乳腺および自然転移の際に肺のような特定の器官に存在するルシフェラーゼ応答エレメントを含むように操作された腫瘍細胞の蓄積を、ルシフェラーゼレポーター活性の存在を評価するために適用されます10。ルシフェラーゼレポーター活性の可視化は、ルシフェリン基質（D-ルシフェリン）の存在によって誘導されます。ルシフェラーゼは、生物発光を生成するオキシルシフェリンするD-ルシフェリンの酸化的脱炭酸を触媒します。有益ながら、この方法は、基板の安定性（ すなわち、短い半減期）、それが実験動物に送達されるかに依存して、基板の適切な分布、および検出9の低い感度を含むいくつかの要因によって制限されます。この手法の主な利点は、それが非侵襲性であるということである生きた動物に対して行うことができ、通常は解剖9,10で収穫されていない可能性があり、複数の臓器における腫瘍細胞の転移の検出をもたらすことができます。 インビボイメージング技術の一つの正の側面は、肺組織をQRT-PCR分析を、パラフィン包埋のような二次的処置のために、またはここに提示させること乱されることです。しかし、QRT-PCRはtheoreticaあるためLLY検出のより感度の高い測定、総評価は、肺に存在する腫瘍細胞の低い数字を明らかにしないことがあります。有用であるが、上述の画像化技術は、現在記載QRT-PCR法を用いて、置換または補充することができます。 QRT-PCRは、肺内の腫瘍由来のmRNAの高感度測定を提供する可能性を有します。

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

転移性疾患は、遠隔臓器への癌原発部位から悪性腫瘍細胞の広がりであり、癌関連死1の主な原因です。転移拡散の一般的な部位は、肺、リンパ節、脳、および骨2が含まれます 。転移を駆動機構は癌研究の激しい領域です。その結果、転移の離れた部位に転移性の負担を測定するための効果的なアッセイは、癌研究のために尽力しています。乳房腫瘍モデルにおける肺転移の評価は、一般的に解剖後の肺組織の肉眼定性的観察することによって行われます。転移を評価する定量的方法は、現在、 エキソビボおよびユーザ定義のパラメータを必要とするインビボイメージングに基づく技術に限定されています。これらの技術の多くは、生物全体のレベルではなく、細胞レベル3-6です。多光子顕微鏡法を利用し、新しい画像形成方法は、メタ情報を評価することが可能であるが細胞レベル7でtasis、これらの非常にエレガントな手順は、普及のメカニズムではなく、転移性負荷の定量的評価を評価するのにより適しています。ここでは、定量的に転移を評価するための簡単なインビトロ方法が提供されます。腫瘍細胞特異的mRNAは、マウスの肺組織内で検出することができ、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用。

それは、インビボの腫瘍の分析で一、実験動物へと行った場合に、腫瘍細胞の最初の接種を行うために要する時間を超えて、組織採取、RNA単離、およびQRT-PCR分析（図1）1-2日間の手順であります。 総分析の例は、肺組織内の腫瘍細胞を評価するための生物発光イメージングです。ここでは、乳腺?...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

このプロトコルは、マウスの肺組織内の転移を示す腫瘍細胞特異的mRNAを検出するための定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用する方法について説明します。

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K ビュー.  Medical University of South Carolina. このプロトコルは、マウスの肺組織内の転移を示す腫瘍細胞特異的mRNAを検出するための定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用する方法について説明します。 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

がん研究

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

医学

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>同所性注射された乳房腫瘍細胞の自発的な肺転移を測定するためのin vivoイメージング

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

要約

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この動画の章

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

要約

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前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング