Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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O laboratório Yeh é suportado por financiamento da investigação de uma Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional (IRG-97-219-14) concedido à Hollings Cancer Center em MUSC, pelo financiamento da pesquisa de uma concessão do Departamento de Defesa (W81XWH-11-2- 0229) em MUSC, e por um prêmio da Fundação Concern (a ESY).

O protocolo segue as diretrizes e padrões de cuidados de animais da Medical University of South Carolina (MUSC) e seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Dissecção do tumor mamário (opcional, dependendo objetivos do estudo e se a análise do tumor primário ou veia da cauda injeção foi realizada). <ol><li> Euthanize rato usando uma dose letal de anestesia isoflurano acordo com IACUC e regulação universidade. Confirme a eutanásia por deslocamento cirúrgico. </li><li> Na placa de espuma, o pino com pinos de dissecação, colocando o mouse sobre as suas costas com membros spread. </li><li> Spray de rato com etanol 70%. </li><li> Usando fórceps, agarrar a parte inferior do animal no centro. </li><li> Usando tesoura, corte para cima do pescoço através da pele, tendo o cuidado de não perfurar a cavidade peritoneal do rato. </li><li> Cortar pele nos membros para revelar o tecido do tumor. </li><li> Dissecar tecido tumoral e preserva por método preferido, como o congelamento ou fixação, para análise posterior (não discutido neste protocolo). </li></ol></li><li> Dissecção do tecido pulmonar. <ol><li> Se o tecido tumoral foi colhido como descrito acima, o pino para baixo qualquer excesso de pele. </li><li> Usando fórceps, compreender peritoneu na extremidade inferior do animal e iniciar o corte para cima para a base do pescoço. </li><li> Corte cuidadosamente ao longo dos lados esquerdo e direito da caixa torácica tomando cuidado para evitar cortar quaisquer vasos sanguíneos que podem sangrar para dentro da cavidade torácica. Retirar as costelas por corte para a esquerda e para a direita através do diafragma e porções superiores da caixa torácica. </li><li> Utilizando uma pinça agarrar a traqueia do rato e puxar para a frente. </li><li> Atingir a traquéia com tesouras de dissecação e remover pulmões de rato. Nota: O coração pode permanecer ligado ao pulmão. Se isso ocorrer, dissecar cuidadosamente coração longe de pulmões tendo o cuidado de recolher todos os cinco lóbulos (ver Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Lavar cuidadosamente com PBS para remover o excesso de sangue. </li></ol></li><li> Gross avaliação do tecido pulmonar. <ol><li> Opção 1: in vivo de imagens. <ol><li> Para imagiologia de luciferase, ~ 10 minutos antes da imagem, os animais dar um 150 mg / kg de dose de luciferina por injecção intraperitoneal (ip). Pulmões de imagem in vivo em animais anestesiados, ou após a sua remoção após a dissecação (Figura 2) 5. </li></ol></li><li> Opção 2: avaliação Gross. <ol><li> Examinar pulmões sob microscópio estéreo para visualizar nódulos tumorais. Nota: Se as células são GFP marcado, um estereomicroscópio capaz de fluorescência contendo um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo, perto de 470/510 nm) para detectar a GFP pode ser utilizado para examinar pulmões estereoscopicamente por fluorescência antes do processamento. </li></ol></li><li> Se os pulmões estão a ser analisadas imediatamente, vá para a seção &#39;RNA Isolation&#39;. Caso contrário, encaixe tecido congelamento usando liquID de azoto ou gelo seco. Armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento de ARN Nota: Para a análise representativa, RNA foi isolado utilizando um kit de isolamento de RNA (ver Lista de Materiais). Embora a análise atual usa o produto de um fabricante específico, uma variedade de kits de isolamento estão disponíveis a partir de vários fornecedores de confiança. Além disso, métodos de centrifugação não baseados kit também são uma opção. ADNc deve também ser preparado a partir de uma amostra de ARN de controlo positivo, tal como uma linha celular ou de plasmídeo, por análise da curva padrão. Alternativamente, um controlo positivo específico para o conjunto de sonda cartilha podem ser adquiridos (ver Lista de Materiais). <ol><li> Se estiver usando tecido previamente congelada, reunir tecido congelado em gelo seco. </li><li> Homogeneizar o tecido usando um dos seguintes métodos, tais como: almofariz e pilão moagem realizada por mão sobre gelo seco após tecido em nitrogênio líquido congelamento; homogeneizador de tecido ou dispositivo de dissociação mecânicapor sugestão do fabricante; sonicação, ou outro método preferido. Nota: Para a análise representativa, o método preferido de homogeneização é de sonicação. <ol><li> Para a análise apresentada na Figura 3, preparar tampão de lise (fornecido no kit de isolamento de ARN) e 2-mercaptoetanol a uma razão de 20 ul de 2-mercaptoetanol a cada 1 ml de tampão de lise. Tecido Ressuspender em 300 ul de tampão de lise, suplementado com 2-mercaptoetanol para cada 30 g de tecido e sonicado durante 10 seg com sonicador fixado em 30% de amplitude. </li><li> Se estiver usando almofariz e pilão, tecido chão ressuspender em tampão de lise de 300 mL após a moagem. </li></ol></li><li> Adicionar 10 ul de proteinase K para 590 ul de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM). Adicionar 600 ul de solução de proteinase K a cada 300 ul (ou seja, para cada 30 mg) de tecido. Incubar durante 10 min à TA. Nota: O tempo de digestão pode variar. </li><li> Centrifugar as amostras a ≥13.000 g durante 10 min para remover os detritos. </li><li> Transferir o sobrenadante para tubos novos. </li><li> Adicionar 450 uL de etanol (96% -100%) para cada 900 ul de sobrenadante para precipitar o ARN. </li><li> Transferir 700 ul da mistura de ligado / etanol para a coluna. </li><li> Centrifugar as amostras a ≥13,000 g durante 1 minuto para ligar RNA para a coluna. </li><li> Descarte os resíduos líquidos e adicionar sobrenadante restante para a coluna e girar novamente. </li><li> Uma vez que todo o lisado é fiado através da coluna, adicionar 350 ul de tampão de lavagem 1 para a parte superior das amostras de coluna e centrifugar a ≥13,000 g durante 30 seg. </li><li> Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior. </li><li> Prepare ADNase por mistura de 5 unidades de ADNase I enzima com 5 ul de ADNase 10x e 40 ul de ADNase / ARNase isenta de água por amostra (volume total de 50 ul / amostra). </li><li> Adicionar 50 ul de DNase misturar a cada coluna e incuba-se durante 15 min à TA. </li><li> Adicionar 350 mL de tampão de lavagem 1 a coluna e centrifugar sampios em ≥13,000 g por 30 s. </li><li> Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior. </li><li> Adicionar 600 ul de tampão de lavagem 2 para a coluna e girar 30 seg a ≥13,000 g. </li><li> Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior. </li><li> Adicionar 250 ul de Tampão de Lavagem 2 e centrifuga-se durante 2 min a ≥13,000 g. </li><li> Coloque parte da coluna em um novo tubo de coleta e descarte tubo de recolha de idade. </li><li> Adicionar 50-100 ul de ARNase / ADNase isenta de água para a coluna e incuba-se durante 1 min. </li><li> Girar durante 1 min a ≥13,000 g. </li><li> Volte a executar eluato coletados por meio de coluna para aumentar o rendimento RNA. </li><li> Para uso imediato, manter as amostras em gelo e proceder à quantificação. Para uso posterior, pressão congelamento de gelo seco ou nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C congelador até ser necessário. </li></ol> 3. First Strand Synthesis Nota: Para a análise representativa, a reacção de transcriptase inversa (RT) realizou-se um Fkit de síntese de irst Strand cDNA projetado para QRT-PCR (ver Lista de Materiais). <ol><li> Se as amostras foram coletadas anteriormente, descongelar tubos em gelo. </li><li> Medir a quantidade de ARN utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Usando 0,5-2 ug de ARN total, realizar a síntese da primeira cadeia utilizando transcriptase reversa para gerar ADNc de estoque. <ol><li> Em estéreis, tubos de RNase / PCR isento de ADNase / placas, preparar a mistura de reacção (Tabela 1). Misture delicadamente e centrifugar. Programar uma máquina de PCR padrão (Tabela 2). </li></ol></li><li> Diluir reação acabado de volume desejado (geralmente 50-100 ul) usando água livre de nuclease estéril. </li></ol> 4. PCR em tempo real Nota: Para a análise representativa, verde SYBR foi usado. No entanto, qualquer método preferido pode ser substituído, a critério do usuário. <ol><li> Usando um cDNA de controlo positivo, configurar uma curva padrão para cada conjunto de primers. <ol><li> Para a análise mostrada in Figura 3, preparar a curva padrão para HER2 humano usando o fabricante recomenda cDNA controle positivo (ver Lista de Materiais). Para GAPDH do rato, utilizar o ADNc de pulmão de controlo negativo para gerar uma curva padrão. Para cada teste, diluir em série do cDNA 1: 4 para gerar 5 padrões. </li></ol></li><li> Calcular o número de amostras no total, o que deveria incluir a curva padrão e amostras experimentais. Nota: Para a análise aqui descrita, foram analisados ​​2-3 experiências em replicado por amostra. A análise da curva padrão foi feita para gerar um modelo de regressão linear simples que pode ser aplicado para determinar a quantidade relativa de HER2 e GAPDH por amostra para calcular a quantidade normalizada final. Esta análise irá também assegurar que a eficiência de iniciadores é o adequado para a análise à mão. </li><li> Em um, RNase tubo estéril / isenta de ADNase, preparar mix master (Tabela 3). <ol><li> Calcule mestre mix amount por amostra. Escala-se de mais de uma amostra. Usar uma mistura principal para cada gene experimental de interesse, bem como um controlo interno, tal como GAPDH. Use iniciadores para GAPDH, a uma concentração final de 200 nM. Nota: O controle interno é particularmente útil quando se tenta distinguir entre a origem de células humanas e mouse. Nota: concentração Primer para HER2 foi otimizado e determinado pelo fabricante. </li></ol></li><li> Prepare a placa de teste contendo 1 ul ADNc correspondentes a cada amostra padrão ou experimental. Aloque pelo menos uma amostra de cDNA / bem para cada sonda primer. Adicionar 19 ul de mistura principal por poço para cada sonda primer. Nota: Para os dados representativos na Figura 3, as amostras de cDNA foram analisadas em duplicado para cada sonda de iniciador e representada graficamente como a média das duas amostras. </li><li> Reação executado em máquina QRT-PCR utilizando recomendada ou previamente testado protocolo de PCR. Ver Tabela 4 </sTrong&gt; para o protocolo de PCR utilizado para os dados representativos na Figura 3 e na Figura 4. </li></ol>

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	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY e MAA não são empregados por FirstString Research Inc. e não ter qualquer interesse financeiro na empresa. FirstString Research Inc. forneceu os dados de imagem luciferase que foi apresentado neste manuscrito. GSG é presidente e CEO da FirstString Research. CLG é um empregado de FirstString Research. GSG e CLG têm opções de ações emitidas por FirstString Research.

Este protocolo descreve o uso de qRT-PCR para avaliar a metástase de células de tumor mamário de pulmão utilizando um modelo de xenoenxerto de ratinho. Reconhece-se que outras técnicas, incluindo a imagem de bioluminescência, estão disponíveis e também são eficazes para detectar metástase apesar de ter os seus próprios valores e limitações. Os dados apresentados sugerem que qRT-PCR proporciona uma medida eficaz de detecção de ARNm derivado de tumor dentro de tecido pulmonar para a quantificação de met?...

Análise de qRT-PCR, como é proposto um método para avaliar a metástase tumoral. Este método é proposto como uma alternativa para os usuários que estão interessados ​​em avaliar a metástase, mas não podem ter acesso ao equipamento específico, como in vivo equipamentos de imagem ou uma fluorescência estereoscópio capaz. Uma discussão de métodos vulgarmente utilizados é apresentada seguido por uma demonstração de como a análise de QRT-PCR pode ser usado tanto como um separado ou como um método para avaliar companheiro metástase. Este procedimento tem o potencial de fornecer uma análise quantitativa de carga metastático. Métodos padrão de análise bruta, incluindo a visualização dos pulmões sob microscópio estereoscópico, bem como cortes seriados seguido por hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração do tecido pulmonar, são quantificáveis, mas dependem fortemente de parâmetros definidos pelo usuário para a contagem 2-5. Ao avaliar os pulmões inteiros usando um microscópio estereoscópico, metástases superfície apenas as grandes são visible e análise requer o investigador ter conhecimento razoável da estrutura anatômica pulmonar para determinar o que constitui uma lesão metastática. Marcação fluorescente de células de tumor com um marcador, tais como GFP e o uso de um microscópio estereoscópico que contém um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo perto de 470/510 nm para GFP) auxilia neste processo, mas apenas nódulos tumorais de superfície são detectáveis . Além disso, a fluorescência a partir de contaminação do sangue, o que é visível sob os mesmos parâmetros como GFP, pode levar a falsa identificação de possíveis lesões metastáticas. Seccionamento do pulmão seguido por H &amp; E coloração de visualizar metástase pulmonar é um método útil para avaliar micrometástases e outros processos microscópicos incluindo a infiltração de células imunes, mas muitas vezes requer o uso de todo o tecido pulmonar para inclusão em parafina, seccionamento, e procedimentos de coloração. Portanto, os procedimentos a jusante não são ideais seguindo este metod. Embora quantificável, este procedimento requer que o investigador para avaliar um grande número de secções de pulmão coradas por animal para assegurar que a análise é responsável por toda a estrutura 3D do pulmão. Consequentemente, este tipo de exame é demorado, pode levar a contagem de erro, e análise depende fortemente de investigador discrição. Vários em técnicas de imagem in vivo (por exemplo, ressonância magnética, PET, SPECT) são usados ​​atualmente para executar ou testar os processos biológicos em modelos de roedores experimentais 8. In vivo a imagem de bioluminescência é um método comum usado para adquirir uma visão bruta de metástase 9. Esta técnica é geralmente aplicado para avaliar a presença de actividade repórter da luciferase, devido à acumulação de células tumorais, que são modificados para conter um elemento de resposta de luciferase, que residem em órgãos específicos, como na glândula mamaria depois da implantação de células de tumor e o pulmão após a metástase espontânea 10. A visualização da actividade de luciferase repórter é induzida pela presença de substrato luciferina (D-luciferina). A luciferase catalisa a descarboxilação oxidativa de D-luciferina para oxiluciferina gerando bioluminescência. Enquanto informativo, este método é limitado por vários factores, incluindo a estabilidade do substrato (isto é, curta meia-vida), a distribuição adequada do substrato, o qual depende da forma como é entregue a animais experimentais, e baixa sensibilidade de detecção 9. Um mérito principal desta técnica é que é não-invasiva, pode ser realizada em animais vivos, e pode conduzir à detecção de metástases de células de tumor em vários órgãos que podem não ter sido normalmente colhido em dissecção 9,10. Um aspecto positivo de técnicas de imagiologia in vivo é que o tecido de pulmão não é perturbada permitindo procedimentos secundários como parafina ou como aqui apresentado, a análise de qRT-PCR. No entanto, porque qRT-PCR é theoretically uma medida mais sensível de detecção, a avaliação bruta pode não revelar baixos números de células tumorais presentes no pulmão. Embora útil, as técnicas de imagiologia descritos acima podem ser substituídos ou suplementados com o método de qRT-PCR actualmente descrito. QRT-PCR tem o potencial de proporcionar uma medida sensível de ARNm derivado de tumores dentro de um pulmão.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

A doença metastática é a propagação de células tumorais malignas do local do tumor primário para um órgão distante e é a principal causa de morte do cancro associado 1. Os lugares mais comuns de propagação metastática incluem pulmão, linfonodo, cérebro e ossos 2. Mecanismos que conduzem metástase são áreas de intensa pesquisa sobre o câncer. Consequentemente, os ensaios eficazes para medir a carga metastático em locais distantes de metástases são fundamentais para a investigação do cancro. Avaliação de metástases do pulmão em modelos de tumor mamário é geralmente realizada por observação qualitativa bruta de tecido de pulmão a seguir a dissecção. Métodos quantitativos de avaliação de metástase está actualmente limitado a ex vivo e em técnicas de imagem com base vivo que exigem parâmetros definidos pelo usuário. Muitas dessas técnicas são em todo o organismo, em vez de nível do nível celular 3-6. Embora os métodos de imagem mais recentes utilizando microscopia multi-fotão somos capazes de avaliar MetasTasis a nível celular 7, estes procedimentos altamente elegantes são mais adequados para avaliar os mecanismos de difusão em vez de uma avaliação quantitativa da carga metastática. Aqui, um método in vitro simples para avaliar quantitativamente a metástase é apresentado. Usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), o ARNm específico de células de tumor pode ser detectado no tecido do pulmão do rato.

Além do tempo que demora a efectuar a inoculação inicial de células de tumor no animal experimental e de se realizar, na análise primária do tumor in vivo, a colheita de tecido, o isolamento do ARN e a análise qRT-PCR é um procedimento de 1-2 dias (Figura 1) . Um exemplo de análise bruta é imagiologia bioluminescente para avaliar células tumorais dentro do tecido pulmonar. Aqui, um...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K visualizações.  Medical University of South Carolina.  Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato. 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de<em&gt; De Novo</em&gt; Metástase do câncer mamário

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Pesquisa do câncer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Medicina

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem in vivo para medir metástases pulmonares espontâneas de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Resumo

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Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares