Este protocolo cuantifica la metástasis pulmonar, que es una causa agresiva y común de muerte relacionada con el cáncer de mama, con mayor precisión y eficiencia en un modelo preclínico de cáncer de mama. En comparación con la técnica original, este protocolo proporciona a los investigadores resultados más rápidos y consistentes. Alivia el error de conteo humano a través de la tecnología informática fácil de usar.
Esta técnica puede extenderse absolutamente a la investigación preclínica que estudia los efectos de las terapias contra el cáncer de mama en la metástasis pulmonar al permitir a los investigadores demostrar una menor carga metastásica después de un tratamiento exitoso. Comience por etiquetar un tubo cónico de 15 mililitros para la muestra de tejido. A continuación, añadir 2,5 mililitros de mezcla de colagenasa tipo cuatro y 30 unidades de elastasa al tubo.
Mueva el pulmón a un pozo LIMPIO de 1X HBSS y arremolinarlo con fórceps para extraer cualquier sangre restante, luego transfirtelo a una placa de cultivo de tejido vacía de 3,5 centímetros. Picar el pulmón con tijeras, luego enjuagar la placa con 2,5 mililitros de HBSS y transferir el HBSS con las piezas pulmonares en un tubo cónico preparado de 15 mililitros con el cóctel de colagenasa y elastasa. Incubar el tubo durante 75 minutos a cuatro grados centígrados en una rueda basculante o giratoria.
Mientras tanto, etiqueta un tubo centrífugo de 50 mililitros y una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros para cada ratón. Si realiza una dilución, etiquete suficientes placas de cultivo de tejido para las diluciones. Lleve el volumen del tubo hasta 10 mililitros con 1X HBSS, luego vierta el contenido sobre un colador celular de 70 micrómetros en el tubo cónico de 50 mililitros.
Utilice el émbolo de una jeringa de un mililitro para moler suavemente la muestra a través del colador. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 350 veces G y desechar el sobrenadante, luego lave el pellet dos veces con 10 mililitros de 1X HBSS. Resuspender el pellet en 10 mililitros de 60 micromolares 6-tioguanina completo medio de cultivo, y placar las muestras en las placas de cultivo celular de 10 centímetros utilizando un esquema de dilución si se desea.
Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco días. Vierta los medios de cultivo fuera de las placas en el contenedor de residuos apropiado. Para fijar las células, agregue cinco mililitros de metanol sin diluir a cada plato e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, asegurándose de girar el metanol para que cubra todo el plato.
Vierta el metanol de las placas en el recipiente de residuos apropiado y, a continuación, enjuague cada plato con cinco mililitros de agua destilada. Añadir cinco mililitros de 0,03% azul de metileno por placa e incubarlo durante cinco minutos a temperatura ambiente, asegurándose de girar la solución azul de metileno para que cubra todo el plato. Vierta el azul de metileno en el recipiente de residuos apropiado y enjuague cada plato de nuevo con cinco mililitros de agua destilada.
Gire la placa al revés y sobra la toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa sobre su tapa y déjela secar al aire durante la noche. Las colonias metastásicas serán azules.
Una vez que las placas se han secado, se pueden almacenar a temperatura ambiente indefinidamente. Retire las tapas etiquetadas de las placas, teniendo cuidado de asegurar una identificación clara de las muestras. Alinee todas las placas pulmonares manchadas sobre una superficie limpia y ligera.
Tome una foto de la colección de placas en un área bien iluminada, asegurándose de minimizar los reflejos. Las reflexiones en las placas influirán en el análisis de imágenes y deben evitarse. Preste mucha atención a las fotografías tomadas y tome varias fotografías desde varios ángulos.
Después de fotografiar las placas, recorte la imagen para excluir las tapas o cualquier cosa en el fondo. Abra la imagen en Fiji ImageJ y cámbielo a blanco y negro haciendo clic en imagen, ajuste y umbral de color. A continuación, seleccione el valor predeterminado para el método de umbral, el blanco y negro para el color de umbral y el laboratorio para el espacio de color.
Asegúrese de que el cuadro de fondo oscuro no está seleccionado. La imagen ahora debe ser en blanco y negro. El negro representa el fondo claro, y el blanco representa las colonias metastásicas azules.
Utilice la herramienta de círculo para seleccionar el área que se va a analizar. Dibuje un círculo para utilizar para todas las placas para asegurarse de que cada placa se analiza para el mismo área de tamaño. Elija un tamaño que maximice el área analizada en las placas mientras minimiza el ruido de fondo que aparece en el borde de las placas.
El tamaño aparece en la barra de herramientas a medida que se dibuja. Analice el círculo seleccionado para determinar el porcentaje de área blanca. Haga clic en analizar y analizar partículas, luego seleccione de cero a infinito para el tamaño, de cero a uno para la circularidad, y nada para mostrar.
Marque la casilla resumida y pulse OK. Mueva el círculo a la siguiente placa de la imagen agarrándola en el centro y repita el análisis. Copie y pegue el resultado en una hoja de cálculo.
El área de porcentaje, que es el porcentaje del área seleccionada que es blanca, representa la carga metastásica. Una vez analizadas todas las placas e imágenes, promedia los resultados del área porcentual entre las diferentes imágenes de cada placa para mitigar cualquier incoherencia entre las imágenes. El análisis de Fiji ImageJ se comparó con el conteo manual y el análisis histopatológico.
Cuando tres investigadores separados contaron manualmente colonias metastásicas, los resultados fueron inconsistentes entre los contadores. Los resultados de Fiji ImageJ fueron coherentes entre los contadores de cada una de las tres imágenes. Los resultados de las tres imágenes y los tres contadores se combinaron para cada placa pulmonar.
Los resultados se promediaron para cada placa para tener en cuenta las variaciones entre las imágenes, lo que proporcionó resultados consistentes entre los contadores. Al clasificar las placas de mayor a menor metastásica, el conteo manual estuvo de acuerdo en la placa más confluente, pero todos los rangos siguientes eran inconsistentes. Las filas de los resultados medios de Fiji ImageJ fueron mucho más consistentes entre los contadores.
Para demostrar la importancia de evitar reflexiones en las imágenes, se muestra una imagen con el reflejo de una mano y su posterior análisis De Fiji ImageJ junto con una imagen de la misma placa sin reflejo. Las imperfecciones oscuras de una superficie de fondo sucia o un residuo de muestra de sangre en las placas también pueden afectar negativamente al análisis de Fiji ImageJ. Esta placa de sangre sólo tiene dos colonias metastásicas, pero el residuo oscuro hizo que Fiji ImageJ lo considerara como 31.6%metastásico.
Al intentar este protocolo, recuerde examinar cuidadosamente las imágenes para la reflexión, utilice el mismo círculo de tamaño para cada placa de la imagen y promedió los resultados de cada placa entre al menos tres imágenes separadas.
