예치 연구소는 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 (IRG-97-219-14) 국방부의 교부로부터 연구 자금으로, MUSC에서 홀 링스 암 센터 수여 (W81XWH-11-2-에서 연구 자금 지원됩니다 0229) MUSC에서, 그리고 우려 (ESY에) 재단의 수상으로.

이 프로토콜은 가이드 라인과 사우스 캐롤라이나 (MUSC)과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 동물 보호 기준을 따른다. 1. 폐 해부 <ol><li> 유방 종양 절제술 (선택 연구 목표 및 기본 종양 분석 또는 꼬리 정맥 주입이 수행 여부에 따라). <ol><li> IACUC 대학 규정에 따라 이소 플루 란 마취의 치사량을 사용하여 마우스를 안락사. 수술 전위에 의해 euthanization을 확인합니다. </li><li> 폼 보드, 사지 확산의 뒷면에 마우스를 배치하여 해부 핀과 핀. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여, 중심에서 동물의 하부를 파악. </li><li> 가위를 사용하여, 마우스의 복강을 관통하지 않도록주의, 피부를 통해 목으로 상승 했네요. </li><li> 종양 조직을 나타 내기 위해 사지에 피부를 다시 잘라. </li><li> 종양 조직과 홍보를 해부하다추가 분석을 위해 (안이 프로토콜에 자세히 설명) 등의 동결 또는 고정으로, 선호하는 방법으로 eserve. </li></ol></li><li> 폐 조직의 해부. <ol><li> 전술 한 바와 같이, 종양 조직을 수확하는 경우, 과잉의 피부 아래에 핀. </li><li> 집게를 사용하여, 동물의 하단부를 잡고 복막 목의 기부를 향해 위쪽으로 절단 시작한다. </li><li> 조심스럽게 흉강에 출혈 수있는 혈관을 절단되지 않도록주의하면서 흉곽의 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 왼쪽과 오른쪽 흉곽의 횡격막과 상부를 절단하여 리브 뼈를 제거합니다. </li><li> 집게를 사용하여 마우스의기도를 잡고 앞으로 잡아 당깁니다. </li><li> 해부 가위로 기관을 절단 및 마우스에서 폐를 제거합니다. 참고 : 핵심은 폐에 부착 남아있을 수 있습니다. 이 경우, 신중하게 다섯 로브를 수집주의하면서 폐에서 멀리 마음을 해부하다 (그림 1 참조 </stroNG&gt;). </li><li> 여분의 혈액을 제거하는 PBS로 부드럽게 씻는다. </li></ol></li><li> 폐 조직의 총 평가. <ol><li> 옵션 1 : 생체 내 이미징. <ol><li> 루시 페라 이미징 ~ 10 분 전에 이미지로, 동물에게 복강 내 (IP) 주사 루시페린의 150 ㎎ / ㎏ 용량을 제공합니다. 마취 된 동물 또는 절개 (그림 2) 5 후 제거시 생체 내에서 이미지 폐. </li></ol></li><li> 옵션 2 : 총 평가. <ol><li> 종양 결절을 시각화 스테레오 현미경으로 폐를 검사합니다. 주 : 세포 표지 GFP 경우 GFP를 검출 (510분의 470 nm의 근처 예) 적절한 여기 / 발광 최대치와 광 큐브를 함유 형광 가능한 실체 처리에 앞서 형광 대해 입체적 폐를 조사하는데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 폐 즉시 분석 할 경우, &#39;RNA 분리&#39;부분을 진행합니다. 그렇지 않으면, 액체 비누를 사용하여 동결 조직 스냅ID 질소 나 드라이 아이스. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. RNA 분리 참고 : 대표 분석을 위해, RNA는 RNA 분리 키트 (자료 목록을 참조)를 사용하여 분리 하였다. 현재의 분석은 하나의 특정 제조 업체의 제품을 사용하는 동안, 분리 키트의 다양한 여러 유명 업체에서 사용할 수 있습니다. 또한, 비 기반 키트 원심 분리 방법이 또한 옵션이다. cDNA를 또한 표준 곡선 분석을위한 세포주 또는 플라스미드로, 양성 대조군 샘플로부터 RNA를 제조한다. 또한, 프라이머 프로브 세트에 대한 특정 양의 제어가 구입하실 수 있습니다 (자료 목록 참조). <ol><li> 이전에 냉동 조직을 사용하는 경우, 드라이 아이스에 냉동 조직을 수집합니다. </li><li> 같은 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화 : 박격포와 유 봉 액체 질소에 조직을 동결 한 후 드라이 아이스를 통해 손에 의해 수행 연삭; 조직 균질 또는 기계적 분리 장치제조업체의 제안에 따라; 초음파, 또는 다른 선호하는 방법. 참고 : 대표 분석을 위해, 균질화 선호하는 방법은 초음파이다. <ol><li> 도 3에 제시된 분석의 비율로 용해 (RNA 분리 키트로 제공) 버퍼 및 2- 메르 캅토 에탄올을 제조 20 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 용해 버퍼마다 1 ml의 용. 재현 탁 조직 300 ㎕의 용해 완충액 30 % 진폭으로 설정 초음파기 10 초 동안 초음파 처리하고 조직의 각 30g을 위해 2- 머 캅토 에탄올이 보충. </li><li> 분쇄 한 후 300 μL 용해 버퍼에 재현 탁 지상 조직, 박격포와 유 봉을 사용하는 경우. </li></ol></li><li> 590 μL TE 버퍼 (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 10 μL의 단백질 분해 효소 K를 추가합니다. 조직의 (즉, 매 30 mg을 위해) 각 300 μL에 600 μL의 단백질 분해 효소 K 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 참고 : 소화 시간이 다를 수 있습니다. </li><li> ≥1 원심 분리기 샘플10 분 3,000 g의 이물질을 제거합니다. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> RNA를 침전 상층 액의 모든 900 μL, 450 μL 에탄올 (96 % -100 %)를 추가합니다. </li><li> 컬럼에 해물 / 에탄올 혼합 700 μl를 전송합니다. </li><li> 1 분 ≥13,000 G에서 원심 분리기 샘플은 열에 RNA를 결합합니다. </li><li> 액체 폐기물을 버리고 컬럼에 남아있는 상층 액을 추가하고 다시 스핀. </li><li> 모든 해물이 칼럼을 통해 방사되면 30 초 동안 ≥13,000 g에서 원심 분리 컬럼 샘플의 상부에 세척 완충제 (1)의 350 μL를 추가한다. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> 내가 10 배의 DNase의 5 μL 및 샘플 당 DNase를 /의 RNase없는 물 40 μL (50 μL / 샘플의 총 부피)와 효소의 DNase의 5 단위를 혼합하여 DNase의를 준비합니다. </li><li> DNase의 50 μL 각 열을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어 추가합니다. </li><li> 열 및 원심 분리기 샘 워시 버퍼 1의 350 μl를 추가PLES 30 초 동안 ≥13,000 G에서. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> 컬럼에 워시 버퍼 2의 600 μl를 추가하고 ≥13,000 g에서 30 초 스핀. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> ≥13,000 g에서 2 분 동안 250 워시 버퍼 2 μL와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 새 컬렉션 튜브에 열의 일부를 넣고 오래 수집 튜브를 폐기합니다. </li><li> 컬럼의 RNase / DNase를 무료로 물을 50 ~ 100 μl를 추가하고 1 분 동안 품어. </li><li> ≥13,000 g에서 1 분간 스핀. </li><li> 다시 실행 RNA 수율을 높이기 위해 칼럼을 통해 수집 된 용출액을. </li><li> 즉시 사용, 얼음에 샘플을 유지하고 정량를 진행합니다. 나중에 사용하기 위해, 드라이 아이스, 액체 질소에 동결 스냅. -80 ° C의 냉동고에서 보관이 필요할 때까지. </li></ol> 3. 첫 번째 가닥 합성 주 : 대표적인 분석을 위해, 역전사 효소 (RT) 반응을 수행 하였다 F(자료 목록 참조) QRT-PCR을 위해 설계 IRST 가닥 cDNA 합성 키트. <ol><li> 샘플은 이전에 수집 된 경우, 얼음에 튜브를 해동. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 측정한다. </li><li> 전체 RNA의 0.5 μg의 사용, cDNA의 주식을 생성하는 역전사 효소를 사용하여 첫 번째 가닥 합성을 수행합니다. <ol><li> 멸균 된 RNase / DNase의 프리 PCR 튜브 / 플레이트에서, 반응 혼합물 (표 1)을 제조 하였다. 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 표준 PCR 기계 (표 2) 프로그램. </li></ol></li><li> 멸균 뉴 클레아없는 물을 사용하여 원하는 볼륨 (일반적으로 50 ~ 100 μL)에 완성 된 반응을 희석. </li></ol> 4. 실시간 PCR 주 : 대표적인 분석을 위해, SYBR 그린을 이용 하였다. 그러나, 임의의 바람직한 방법은 사용자의 결정에 치환 될 수있다. <ol><li> 양성 대조군의 cDNA를 사용하여 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정합니다. <ol><li> 분석 내가 보여 위해N 그림 3은, 양성 대조군의 cDNA를 추천 제조업체를 사용하여 인간의 HER2에 대한 표준 곡선을 준비 (자료 목록 참조). 마우스 GAPDH에 대해, 표준 곡선을 생성하는 음성 대조군 폐의 cDNA를 사용한다. 5 기준을 생성하는 4 : 각 프로브에 대해, 직렬의 cDNA 1 희석. </li></ol></li><li> 표준 곡선 및 실험 샘플을 포함해야 총 샘플들의 수를 계산한다. 참고 : 분석은 여기에 설명 된 내용은 샘플 당 2-3 실험 복제를 분석 하였다. 표준 곡선 분석은 최종 정규화 양을 계산하는 샘플 당 상대적 HER2의 양 및 GAPDH를 결정하도록 적용될 수있는 단순 회귀 분석 모델을 생성하기 위해 수행 하였다. 이 분석은 또한 프라이머 효율이 손의 분석에 적합한 지 확인합니다. </li><li> 멸균 된 RNase / DNase의 무료 관에서, 마스터 믹스 (표 3)를 준비합니다. <ol><li> 마스터 믹스 amoun을 계산샘플 당 T. 하나 이상의 샘플까지 확장 할 수 있습니다. 관심있는 각각의 실험 유전자뿐만 아니라, GAPDH 등의 내부 제어를 위해 마스터 믹스를 사용한다. 200 nm의 최종 농도 GAPDH에 대한 프라이머를 사용합니다. 참고 : 인간 및 마우스 세포의 기원을 구별 할 때 내부 통제에 특히 유용하다. 주 : HER2 프라이머 농도는 최적화 제조업체에 의해 결정 하였다. </li></ol></li><li> 각 표준 또는 실험 샘플에 해당하는 1 μL의 cDNA를을 포함하는 테스트 판을 준비합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 적어도 1의 cDNA 샘플 /을 할당합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 당 마스터 믹스 19 μl를 추가합니다. 참고 :도 3의 대표 데이터를 들어, cDNA를 시료는 각 프라이머 프로브 이중으로 분석하고, 두 개의 샘플의 평균으로 그래프. </li><li> QRT-PCR 시스템에서 실행 반응은 권장 또는 이전 PCR 프로토콜을 테스트하여. 표 4 참조 </s도 3 및도 4에 대표 데이터에 사용되는 PCR 프로토콜 trong&gt;. </li></ol>

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	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY 및 MAA는 FirstString 리서치에 고용되지 않고 회사의 금융이자를 보유하지 않습니다. FirstString 리서치는이 논문에서 제시 한 루시 페라 영상 데이터를 제공했다. GSG는 FirstString 연구의 사장 겸 CEO이다. CLG는 FirstString 연구의 직원입니다. GSG와 CLG는 FirstString 연구가 발행 한 스톡 옵션이 있습니다.

이 프로토콜은 이종 이식 된 마우스 모델을 이용하여 폐에 유방 종양 세포 전이를 평가 QRT-PCR의 용도를 설명한다. 그것은 생물 발광 영상을 포함한 다른 기술, 사용할 수 있으며, 또한 자신의 가치와 한계에도 불구하고 전이를 검출하는 효과가 있음을 인정한다. 제시된 데이터는 QRT-PCR 총 전이 정량 폐 조직 내 종양 유래의 mRNA를 검출하는 효과적인 조치를 제공하는 것이 제안한다. 그것은 QRT-PCR 분...

QRT-PCR 분석은 종양 전이를 평가하는 방법으로서 제안되어있다. 이 방법은 전이를 평가 관련되지만, 생체 내 이미징 장치 또는 형광 할 입체경 특정 장비에 액세스 할 수없는 사용자를위한 대안으로 제시된다. 일반적으로 사용되는 방법의 논의는 QRT-PCR 분석은 별개로 또는 전이를 평가하는 방법에 동반하여 사용할 수있는 방법에 대한 데모 뒤에 제공된다. 이 절차는 전이성 부담의 정량 분석​​을 제공하는 잠재력을 가지고있다. 실체 현미경하에 폐의 시각화뿐만 아니라 헤 마톡 실린 및 에오신 다음 직렬 절편을 포함하여 총 분석의 표준 방법은 폐 조직의 (H &amp; E) 염색, 정량화하지만 2-5 계산을위한 사용자 정의 된 매개 변수에 크게 의존하고있다. 실체 현미경을 사용하여 전체 폐를 평가할 때, 단지 큰 표면 전이는 VISI은BLE 및 분석은 전이성 병변을 구성하는 것을 결정하기 위해 폐 해부학 적 구조의 합리적인 지식을 가지고 조사를 필요로한다. 이러한 GFP 적절한 여기 / 방출 최대 (GFP 예 : 근처 510분의 470 ㎚)와 빛 큐브를 포함하는 입체 현미경의 사용과 같은 마커로 종양 세포의 형광 라벨은이 과정에서 지원,하지만 표면의 종양 결절은 탐지 가능 . 또한, GFP와 같은 매개 변수 아래에 표시되는 혈액의 오염에서 형광이 가능 전이성 병변의 거짓 식별 될 수 있습니다. 폐 전이를 시각화하기 위해 H &amp; E 염색 한 다음 폐의 단면은 미세 전이와 면역 세포의 침윤을 포함한 다른 마이크로 프로세스를 평가하는 유용한 방법이지만 종종 파라핀 삽입, 절편 및 염색 절차는 전체 폐 조직의 사용을 필요로한다. 따라서, 다운 스트림 절차는이 운전 방식 다음과 같은 이상 없습니다디. 정량화하지만,이 과정은 분석이 폐의 전체 3 차원 구조를 차지하도록 동물 당 염색 폐 구간의 다수를 평가하는 조사원을 필요로한다. 결과적으로, 시험이 유형의 에러를 카운트로 이어질 수 있고, 시간 소모적이며, 분석은 연구자의 판단에 크게 의존한다. (MRI는 PET, SPECT는 예) 현재 수행하거나 실험 쥐 모델 8 생물학적 과정을 테스트하는 데 사용되는 생체 내 이미징 기술의 몇 가지. 생체 내 생물 발광 영상은 전이 (9)의 총보기를 취득하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 일반적으로 인해 종양 세포 주입 후 유선 및 자발적 전이시 폐 같은 특정의 장기에 상주하는 루시퍼 라제 반응 요소를 포함하도록 설계되는 종양 세포의 축적에 루시페라아제 리포터 활성의 존재를 평가하기 위해인가 1루시페라아제 리포터 활성의 0. 시각화는 루시페린 기판 (D-루시페린)의 존재에 의해 유도된다. 루시 페라 제는 생물 발광을 생성 oxyluciferin하는 D-루시페린의 산화 적 탈을 촉매. 정보 있지만,이 방법은 기판의 안정성 (즉, 짧은 반감기)이 실험 동물에 전달되는 방법에 따라 달라집니다 기판의 적절한 분배, 및 탐지 (9)의 낮은 감도 등 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다. 이 기술에 주요 장점은, 비 침습적 인 살아있는 동물에서 수행 될 수 있고, 일반적으로 절개 9,10- 수확되지 않았을 수있는 다수의 기관에서 종양 세포의 전이의 검출을 초래할 수 있다는 것이다. 생체 영상 기술의 일 측면은 양성 폐 조직 파라핀 등에 매립 이차 절차 허용 흐트러 그대로 또는 여기 제시 QRT-PCR 분석한다는 것이다. 그러나, QRT-PCR은 theoretica이기 때문이다에서야 검출 더 민감한 법안은 총 평가는 폐에 존재하는 종양 세포의 낮은 숫자를 공개하지 않을 수 있습니다. 유용한 반면, 상기 이미징 기술은 치환 될 수 있거나, 현재 설명 QRT-PCR 방법으로 보충. QRT-PCR은 폐에서 종양 유래의 mRNA의 민감한 측정을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

전이성 질환 먼 기관에 차 암 사이트에서 악성 종양 세포의 확산된다 암 관련 사망의 1 차 원인이다. 전이성 확산의 일반적인 사이트는 폐, 림프절, 뇌, 뼈 (2)를 포함한다. 전이를 구동 메커니즘은 암 연구의 강렬한 영역입니다. 전이 먼 사이트는 암 연구를위한 수단이다에 따라서, 효과적인 분석은 전이성 부담을 측정합니다. 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가는 일반적으로 다음 해부 폐 조직의 육안 관찰에 의해 정성 행한다. 전이를 평가하는 정량적 방법은 현재 생체 외 및 사용자 정의 된 매개 변수를 필요로 생체 내 이미징 기반 기술에 제한됩니다. 이들 기술의 대부분은 오히려 세포 수준 3-6보다 전체 유기체 수준이다. 다 광자 현미경을 이용하여 새로운 이미징 방법 METAS을 평가할 수 있지만세포 수준에서 7 TASIS이 매우 우아한 절차는 보급의 메커니즘보다는 전이성 부담의 정량적 평가를 평가에 더 적합하다. 여기에 정량적으로 전이를 평가하는 간단한 체외 방법이 제공된다. 정량 실시간 PCR을 사용하는 것은 (QRT-PCR), 특정 종양 세포의 mRNA는, 마우스 폐 조직 내에서 검출 될 수있다.

시간을 초과가 실험 동물 내로하면 종양 세포의 초기 접종을 수행하는 데 걸리는 행하는, 생체 내 종양 분석, 조직 수확 RNA 분리 및 QRT-PCR 분석에 기본이 1-2 일 과정이다 (도 1) . 총 분석의 예는 폐 조직 내에서 종양 세포를 평가하기위한 생물 발광 이미징이다. 여기서, 유방 종양 실험은 ACT1라는 갭 정...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K 조회수.  Medical University of South Carolina.  이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다. 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론<em&gt; 드 노보</em&gt; 유방암 전이

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

연구

암 연구학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

의학

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>orthotopically 주입된 유방 종양 세포의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 In vivo imaging

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

요약

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전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리