Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University&#160;Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer&#160;Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.

Los experimentos utilizaron ratones C57BL / 6 entre 10 y 12 semanas de edad. Todos los procedimientos que utilizan los animales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Emory Universidad Institucional Animal y se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud criterios. 1. Configuración Experimental <ol><li> Configuración del criostato <ol><li> Equilibrar criostato a -20 ° C, incluyendo la hoja microtomo y mandriles (tener mucho cuidado alrededor de la hoja!). </li><li> Llenar un vacío con criomolde octubre (compuesto óptimo de corte de la temperatura) y equilibrar a -20 ° C (~ 30 min). Retire la congelada octubre del molde y fijarla en el plato con OCT líquido. Coloque el bloque / tirada en el brazo microtomo y permitir que los PTU se asiente durante 10 min. </li><li> Ajuste el criostato a 10 micras por sección y afeitar el bloque de octubre hasta que es plana. Copia el brazo microtomo lejos de la hoja por varios centímetros. En este punto, no ajuste la cuchilla o tenazas para el resto de la experiment. </li></ol></li><li> Preparar las hojas de afeitar: Prepare 2 hojas de afeitar por muestra. Usando una lima de metal, sin brillo el borde afilado de cuchillas. A continuación, retire la brida de aluminio con unas pinzas. </li><li> Pre-enfriar un plato de Pyrex u otra superficie plana en hielo seco. </li><li> Preparar un plato de disección con 10-15 pines de disección. Un 10 cm placa de cultivo tisular de 50% lleno de silicio será suficiente. Añadir 5 ml de tampón de Hanks a TA. </li></ol> 2. Disección de colon distal de Tejidos <ol><li> Coloque los ratones en una cámara sellada y la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano y dislocación cervical, y luego rociar etanol al 70% en el abdomen y el tórax 12. </li><li> Haga una pequeña incisión en la piel del abdomen con unas tijeras y luego hacer una incisión para exponer la cavidad peritoneal. Procedimientos similares se pueden encontrar aquí descrito 12. </li><li> Cortar el intestino grueso en el borde anal y desmenuzar el mesenterio hasta que el colon es gratuita. </li><li> Extirpar un colon distalsegmento entre 0 y 6 cm del ano. Aquí, la profundidad de las criptas es de ~ 150 micras (véase la Figura 1B). Corte abierto el colon longitudinalmente con unas tijeras y retire los contenidos fecales. </li><li> Pin el tejido para el plato de disección con la superficie de la mucosa hacia arriba. Estire los tejidos utilizando pasadores de disección en un plato de silicio en tampón Hanks y dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente (Figura 1C). Esto elimina los pliegues del tejido y permite que las capas de músculo se relaje. </li></ol> 3. Monte de Tejidos en el criostato de seccionamiento <ol><li> Deslizar una hoja de afeitar en la sección deseada de tejido y luego verter fuera el tampón de Hanks. Añadir otra hoja de afeitar para la parte superior, haciendo un sandwich. Cortar el segmento de tejido y quitar los pasadores. Transferir el sándwich cuchilla de afeitar / tejido para hielo seco. Permitir que el tejido se congele (5-10 min, la Figura 1D). </li><li> Recoge la navaja / sándwich de tejidos y deje que se caliente un poco colocando un dedo en el bl superiorade (lado de la mucosa hacia arriba. Esto orienta el tejido de modo que las capas musculares basales se seccionan primero.). Separar el sándwich y cortar alrededor de los bordes del segmento de tejido. Cortar un segmento de tejido aproximadamente, 0,5 cm x 1 cm. Zonas de borde tienen una tendencia a curvarse, haciendo que las secciones en serie a contienen muchas capas de tejido. Tenga en cuenta que el exceso de corte es mejor que bajo el corte, por lo que errar por el lado de la precaución. </li><li> Deje que el tejido se caliente hasta que el hielo en la parte superior del tejido comienza a derretirse. En este punto de forma rápida y con cuidado presione el tejido en el bloque de octubre en el criostato. </li><li> Retire la hoja colocando un dedo sobre la muestra. La transferencia de calor le permitirá quitar la cuchilla sin alterar el tejido. </li><li> Escudo del tejido con octubre y equilibre durante 5 min. Cortar secciones a las 10 micras (Figura 1E, F). Inspeccione visualmente las secciones hasta que se ven las criptas. Coloque las secciones en unos tubos de 1,5 ml o en las diapositivas. </li><li> Para el análisis de ARNm o proteína, lugar tél muestras en tubos con 5 cripta-base, 5 de transición y 5 secciones de superficie por tubo. Para la recolección de ARN añadir 1 ml de reactivo aislamiento comercial e incubar a TA durante 10 min. Realizar la purificación del ARN según las instrucciones del fabricante. Utilice 5-10 g de ARN total para la generación de ADNc. </li><li> Para la purificación de proteínas, añadir 0,5 ml de tampón de lisis frío RIPA (más inhibidores de la proteasa) por 5 secciones. Sonicar 3 veces en un ciclo de 70%, en hielo. <ol><li> Añadir muestras a SDS buffer de carga de la página (tampón Laemmli) e incubar a 100 ° C durante 10 minutos. Muestras sujetas a SDS PAGE y transferencia, a continuación, en el bloque 5% de leche / PBS durante 2 horas. Realizar análisis de transferencia Western seguido de incubación con anticuerpos KLF4 (1: 500) O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+development+and+differentiation.">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li><li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis.">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li><li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+is+it+really+just+another+break+in+the+wall.">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors.">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li><li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues.">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li><li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia.">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li><li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction.">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192 (2011).</li><li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors.">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li><li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm.">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine.">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040 (2012).</li><li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo.">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li><li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon.">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li><li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins.">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li><li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+an+intestine.">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Los mecanismos moleculares implicados en la proliferación de células epiteliales del colon y la diferenciación son poco conocidos. Esto incluye lagunas en nuestra comprensión del entorno de señalización celular del compartimento de células madre en la base de las criptas epiteliales del colon. También hay un creciente interés en los procesos que subyacen a la diferenciación enterocito. Por ejemplo, el aumento se requiere la comprensión de la diferenciación in vivo como un punto de referencia para los estudios destinados a la producción de sistemas intestinales primarias in vitro 16. El procedimiento anterior contiene varios pasos que requieren una atención especial. En primer lugar, se requiere la eliminación de los bordes de todo el segmento de tejido congelado (como se discutió en la sección 3.2), como los bordes de tejido rizo durante la disección y la congelación. Si no se mueve estos bordes resultados es una población mixta de células de la superficie de base y cripta. Montaje del tejido en un bloque de pre-enfriado, nivelado octubre también es esencial. Tsu protocolo puede ser adaptado a otras áreas del colon distal alterando el número de secciones en cada piscina. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1B, la longitud de la cripta mucosal varía entre 150-300 micras. Por lo tanto, en el estudio de la región entre los 4 cm de 6 cm del ano, el número de secciones debería aumentarse de 15 a 30. Es importante destacar que este protocolo no se sugiere para el colon proximal (7 cm 9 cm) debido a los pliegues ( plicas obliquae) que se extienden hacia la luz por lo que es imposible de superficie y la cripta-base celdas separadas por seccionamiento de serie. Técnicas de seccionamiento en serie se han utilizado para estudiar cripta-base y la superficie poblaciones de células epiteliales en los seres humanos. Sin embargo, nuestro protocolo añade pasos adicionales que se requieren debido al pequeño tamaño de tejido murino. Proponemos que el protocolo anterior permitirá la investigación de la cripta-base y la población de células epiteliales superficiales en sistemas de ratón genéticamente manejables. De hecho, las secciones agrupados Yield proteínas de alta calidad y el ARN análisis de aguas abajo adecuado. Las futuras aplicaciones podrían incluir el estudio de las vías de señalización celular o inmunoprecipitación de la cromatina. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, al igual que varios de los métodos alternativos descritos anteriormente, las secciones resultantes contienen una mezcla de células de la lámina propia epiteliales e intersticiales. En conclusión, el protocolo descrito aquí proporciona un método rápido rendimiento, alta para el análisis de los procesos moleculares en regiones espacialmente distintas de la mucosa del colon murino.

El revestimiento epitelial del colon es un tejido altamente regenerativa, con células madre residentes reponer el tejido cada pocos días 1. Este proceso de regeneración requiere el mantenimiento de un compartimento de células madre proliferativa. Con el tiempo, las células hijas recién producidos pierden su potencial proliferativo y migran hacia la superficie luminal del intestino. Coincidiendo con la migración, las células progenitoras se diferencian en enterocitos barrera formadora maduros o mucosas células caliciformes productoras. Fracaso de este programa de diferenciación se cree que contribuyen a la barrera epitelial comprometida tal como se observa en la enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer de colon 2,3. Estudio detallado de los procesos anteriores requerirá metodologías para aislar cripta-base y los teléfonos superficie poblaciones. Existen métodos múltiples, cada uno con sus ventajas y desventajas únicas. Los métodos actuales para el aislamiento de células epiteliales intestinales incluyen chagentes elating y disociación mecánica, lo que resulta en el aislamiento de criptas enteras, láminas epiteliales o células individuales, dependientes de las condiciones experimentales 4,5. Estos son los métodos de alto rendimiento, sin embargo, los cambios en la señalización intercelular se han reportado en estas condiciones que pueden no representar el entorno nativo de 6,7. Captura de microdisección láser permite la recolección de material distinto espacial, pero logra bajo 8,9 rendimiento molecular. En el tejido del colon humano, métodos cryosectioning horizontales de serie se han desarrollado 10. Sin embargo, los tejidos mucosos murinos son prohibitivamente pequeño para la apropiación directa de esta técnica. En los seres humanos, las longitudes de cripta intestinal (la distancia entre la cripta-base y células de la superficie) en el colon varía entre 100-1.000 micras ~ 11. En ratones, las longitudes de las criptas son entre ~ 50-300 micras (ver Figura 1A). El pequeño tamaño de las criptas murinos presenta un desafío a la isolación de estas dos poblaciones celulares utilizando protocolos existentes. Ahora describir un bajo costo, método de alto rendimiento para el aislamiento de la cripta-base y la superficie de la población de células epiteliales en el tejido del colon murino. Tejido recogido de esta manera puede entonces ser analizada por un número de aplicaciones posteriores estándar, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia, RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real-) o el Western Blot.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Germany</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ real time PCR detector</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>High profile microtome blade</td><td>Leica Biosystems, Nussloch germany</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM industrial blades</td><td>American Safety Razor Blades</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicon elastomere base</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g needle</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>pins for dissection</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Antibody ZO-1</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Antibody KLF4</td><td>Cell Signaling</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Antibody mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Secondary Alexa conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-rabbit</td></tr><tr><td>Antibody Secondary HRP conjugate</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>rabbit/mouse&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs balanced salt buffer</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate</td></tr><tr><td>primer TBP 3&#039;</td><td></td><td></td><td>GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td></tr><tr><td>primer TBP 5&#039;</td><td></td><td></td><td>GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td></tr><tr><td>primer KLF4 3&#039;</td><td></td><td></td><td>TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td></tr><tr><td>primer KLF4 5&#039;</td><td></td><td></td><td>ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td></tr></tbody></table>

cryosectioning method for microdissection of murine colonic mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Secciones de tejido del colon se procesaron para la evaluación histológica y H &amp; E tinción 13. Una vista en sección transversal tradicional de la mucosa se ​​ve en la Figura 2A. Áreas basales contienen la muscular externa, compuesta principalmente de la capa muscular circular. Procediendo hacia el lumen, la muscularis mucosa es evidente adyacente a las células epiteliales de las criptas-base, células de transición están en el medio del tejido, y, finalmente, las poblaciones celulares superficie de la cara la luz intestinal. El método de seccionamiento en serie descrito aquí mantiene una orientación tal que la capa muscular longitudinal y circular se encuentran primero (Figura 2B), seguido por la muscularis mucosa (Figura 2C). Tenga en cuenta la aparición de células intersticiales no musculares en la parte superior izquierda de la imagen. Para el análisis de aguas abajo se describe a continuación, las secciones musculares se descartan. Las secciones siguientes contienen células epiteliales y del tejido intersticial (lámina propia), A partir de las células de las criptas-base (Figura 2D). Nótese la ausencia de un lumen central en la mayoría de las criptas, que aparecen más oscuro debido a los núcleos estrechamente empaquetados. Estas capas contienen el compartimento proliferativo. Las células transicionales parecen tan apretujada glándulas con lúmenes centrales prominentes (Figura 2E). Por último, las poblaciones de células de superficie tienen una estructura irregular, con zonas de la monocapa epitelial visto en face (Figura 2F). Serial secciones descritas anteriormente también pueden ser procesados ​​para el etiquetado de inmunofluorescencia y microscopía confocal (como se describe aquí 14). Figura 2G muestra criptas aislados fijos y permeabilized en el 100% de metanol y posteriormente teñidas para núcleos (azul) y la proteína de unión célula-célula zonula occludens 1 (ZO-1, verde). En la orientación de corte tradicional, células de la cripta y la superficie se puede ver simultáneamente (Figura 2G </strong&gt;). Tenga en cuenta que las ZO-1 líneas de mancha de la unión de la luz de la cripta del colon. Este revestimiento Z0-1 de la luz también se puede ver en muestras seriadas seccionadas de las poblaciones de células de transición, en el centro de las glándulas circulares (Figura 2G). Enhanced ZO-1 mancha se ve en las poblaciones de células de superficie (Figura 2I y J). Varios factores de diferenciación son conocidos por ser expresado de una manera espaciotemporal a lo largo del eje cripta-a-superficie. Esto incluye el factor de factor de transcripción Kruppel-like 4 (KLF4), que es conocido por ser enriquecido en poblaciones de células de superficie. El uso de métodos tradicionales de seccionamiento, KLF4 se encuentra en los núcleos de lumen que enfrentan las poblaciones de células de superficie (Figura 2K). Por lo tanto, especuló que KLF4 ARNm se expresa predominantemente en las poblaciones de células superficiales. Para probar esto, se recogieron y se agrupan en muestras superficiales, de transición, y la cripta a base de secciones en serie. Subsequently, el ARN se cosechó utilizando Trizol extracción estándar, con una purificación adicional por la columna RNeasy y tratamiento con ADNasa. ARN se recogió de 5 secciones consecutivas agrupados, que arrojó entre 5-10 g de ARN total por muestra. Estas muestras se sometieron entonces a la PCR en tiempo semi-cuantitativa real para ambos KLF4 y un gen de referencia, caja TATA proteína de unión 1 (TBP-1) (Figura 2L) 14. Como se muestra en la Figura 2L, después de la normalización a TBP-1, se encontraron células de la superficie para expresar hasta 8 veces el ARNm KLF4 que se expresa en células de las criptas. Del mismo modo, se encontraron niveles de proteína KLF4 para exhibir regulación espacial a lo largo del eje cripta-superficie. Las secciones seriadas se agruparon como se describe anteriormente y luego se incubaron en tampón de lisis durante 20 min a 4 ° C. Esto produjo entre 200 a 250 g de proteína por muestra. Las muestras se sometieron entonces el análisis por SDS-PAGE (Figura 2 M) 15. Como se muestra en la Figura 2 M, p KLF4niveles rotein son dramáticamente más alta en las poblaciones de células de la superficie. Los resultados anteriores demuestran la capacidad de este protocolo para aislar grandes cantidades de células epiteliales de las criptas de la superficie y de la mucosa del colon murino. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figura 1: (A) que muestra esquemática murino mucosa colónica y las capas musculares externas. Nuestro método tiene como objetivo recoger las células de la superficie y la cripta de base poblaciones celulares discretas por cryosectioning serie (10 m cada uno). Las capas musculares externas se descartan. Altura (B) Cripta varía a lo largo de la longitud del colon (distancia entre las criptas-base y la superficie capas). Los puntos de datos indican las mediciones de las criptas individuales y símbolos indican réplicas biológicas (n = 4). (C) segmentos de colon recogen, se bisecaron, y puestas en una placa de silicio de disección. (D) Un tejido segment aproximadamente 3 cm del ano se presiona entre dos hojas de afeitar y el congelado en hielo seco. (E) El tejido se monta en un bloque de octubre pre-nivelado. (F) criosecciones se retiran y se inspeccionó visualmente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figura 2:. Los datos representativos (A) tejido colónico se tiñeron con hematoxilina-eosina en sección transversal que muestra la capa muscular circular (cm), la muscularis mucosa (mm), células de las criptas-base, las células de transición, y las células de la superficie. (B - C) capas musculares del colon. (D) células de las criptas-base. Nótese la ausencia de un lumen central. (E) Las células de transición. (F) las células superficiales. Tinción (G) de inmunofluorescencia de las criptas del colon aisladas. ZO-1 (verde) y núcleos (azul) se observan en sección transversal. (HOLA) ZO-1 y la tinción nuclear en las células de transición y de superficie. (J) vista ampliada de ZO-1 tinción. (K) KLF4 (verde) se enriquece en las poblaciones de células de superficie. (L) La evaluación de PCR en tiempo real de los niveles de ARNm KLF4 entre los tres compartimentos. (M) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína KLF4 en estas poblaciones de células.

Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa at JoVE.com

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K vistas.  Emory University, Atlanta, Georgia. Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Video: Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neurociencias

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount importance when studying diseases of the gastrointestinal (GI) tract. The murine colonic pinch biopsy model is a useful tool to define these processes. Additionally, the interplay between gut luminal content (e.g., microbes) and the colon can be studied. However, wound induction and the ability to track wound closure over time in a reliable manner can be challenging. Moreover, tissue preparation and orientation must be carried out in a standardized way to optimally interrogate histologic and molecular changes. Here, we present a detailed method describing biopsy-induced injury and the monitoring of wound closure through repeat colonoscopies. An approach is described that ensures consistent and reproducible measurements of wound size, the ability to collect the wound bed for molecular analyses as well as visualize the wound bed upon sectioning of tissues. The ability to successfully carry out these techniques allows for studies of the acute injury response, wound healing and luminal-host interactions within the colon.

Here, we provide a detailed description of the procedure to induce colonoscopic-guided pinch biopsies in mice and track wound closure in real time. Additionally, methods for the preparation of tissues for histological, immunohistochemical and molecular analyses of the wound bed are provided.

Realización de biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y evaluación de cambios de tejido posteriores

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biología

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

Source: Bonetto, A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54893" target="_blank">The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.

Congelación rápida de tejido muscular para seccionamiento: un protocolo para obtener secciones ultrafinas de tejido muscular murino congelado rápidamente

Source: Bonetto, A. et al. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (2016)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Investigación sobre el cáncer

Gastrointestinal Cancer

Animal model studies

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine Model

Source: Schewe, M. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/56329" target="_blank">The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a technique to isolate whole crypts from a mouse&#8217;s small intestine. The isolated whole crypts can be used to propagate long-lived and self-renewing 3D organoids in vitro.

Aislamiento de criptas intestinales: un método para aislar criptas enteras del intestino delgado de un modelo murino

Source: Schewe, M. et al. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

Frozen Mouse Brain Tissue Sectioning: A Procedure to Obtain Thin Frozen Tissue Sections from Frozen Murine Brain Tissue

Source: Comba, A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the sectioning of a frozen mouse brain tumor tissue using a cryostat. The frozen brain tissue sections so obtained are stored at low temperatures until further analysis.

Seccionamiento de tejido cerebral de ratón congelado: un procedimiento para obtener secciones delgadas de tejido cerebral congelado a partir de tejido cerebral murino congelado

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...