Wir untersuchen die Wechselwirkungen zwischen Rezeptor-Tyrosinkinasen und der Plasmamembran von Säugetieren. Wir wollen wissen, wie Lipid Rafts und Lipidasymmetrie die Lokalisierung, Aktivierung und Signalübertragung von Rezeptoren steuern. Es ist schwierig, Lipid Rafts direkt zu untersuchen, da sie klein, dynamisch und empfindlich gegenüber Temperaturbedingungen sind.
Forscher müssen oft Modellsysteme mit großen Ordnungsbereichen verwenden, um Wechselwirkungen zu untersuchen. Synthetische und Plasmamembranvesikel sind unvollkommene Darstellungen von Zellmembranen, denen Lipidasymmetrie und Organellen fehlen. Durch die Arbeit mit lebenden Zellen erreichen wir eine genaue Darstellung der Plasmamembran.
Sie beleuchten die Initiierung der Rezeptorsignalisierung im Kontext lebender Zellen. Dies gibt Aufschluss über die Wirkung von Membranumgebungen auf Rezeptoren und ihre nachgeschalteten Signalwege. Zu Beginn aliquotieren Sie den Lipidstock mit einer Direktverdrängerpipette mit einer Glasspitze in ein Borosilikatröhrchen.
Stellen Sie das Borosilikatrohr auf einen Heizblock, der auf etwa 50 Grad Celsius eingestellt ist, und geben Sie einen Strom von Stickstoffgas auf das Rohr, bis das gesamte sichtbare Chloroform verdampft ist. Bringen Sie das Röhrchen in eine Vakuumkammer und setzen Sie es eine Stunde lang einem Hochvakuum aus, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen. Geben Sie dann serumfreies Ham's F-12-Medium zum getrockneten Lipidfilm, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erreichen.
Decken Sie die Tube mit einem Deckel oder Teflonband ab und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang in einem 70 Grad Celsius warmen Wasserbad. Als nächstes wird die Lösung vortext, um Lipide zu suspendieren und mehrlamellare Vesikel oder MLVs zu bilden. Nachdem das Medium trüb geworden ist, geben Sie das gesamte Volumen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie es bis zu drei Tage lang bei vier Grad Celsius.
Die vorbereiteten MLVs werden mit Methyl-alpha-Cyclodextrin bis zu einer Endkonzentration von 40 Millimolar gemischt. Inkubieren Sie die Lipidmischung 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius oder 55 Grad Celsius heißen Wasserbad. Beobachten Sie, wie die Medien von wolkig zu klar übergehen.
Lassen Sie dann das Lipidaustauschmedium 30 bis 60 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Erhalten Sie Insulinrezeptorzellen des chinesischen Hamsters, die bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in supplementiertem DMEM gezüchtet wurden, das 4,5 Gramm pro Liter Glukose enthält. Säen Sie 1,5 mal 10 hoch sechs Zellen in 60-Millimeter-Platten aus und inkubieren Sie sie, um eine Konfluenz von 80 bis 90 % zu erreichen.
Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit einem Milliliter PBS. Hungern Sie die Zellen über Nacht in zwei Millilitern serumfreiem F-12-Medium von Ham. Nachdem Sie die Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie einen Milliliter des vorbereiteten Austauschmediums hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie alle 15 Minuten, um eine gleichmäßige Exposition gegenüber dem Austauschmedium zu gewährleisten. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie das PBS vollständig von der Zellkulturplatte und stellen Sie die Platte 10 Minuten lang in einem 45-Grad-Winkel auf oder bis sie vollständig trocken ist.
Nachdem Sie den Restpuffer entfernt haben, geben Sie einen Milliliter einer Hexan-Isopropanol-Lösung zu den getrockneten Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Gib nun die Lösung in ein Borosilikatrohr. Nachdem Sie die Tube abgedeckt haben, lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.
Als nächstes lösen Sie die restlichen Zelltrümmer mit 500 Mikrolitern eines normalen Natriumhydroxids auf. Schütteln Sie den Behälter 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Um die Austauscheffizienz zu überprüfen, gießen Sie 100 Milliliter einer Chloroform-Methanol-30%-Ammoniumhydroxidlösung in einen Dünnschicht-Chromatographie-Tank aus Glas.
Decken Sie den Tank fest ab und lassen Sie den Dampf mindestens eine Stunde lang ausgleichen. Trocknen Sie die Lipidextraktprobe auf einem Heizblock bei niedriger Einstellung unter einem Strom von Stickstoffgas, bis das organische Lösungsmittel verdampft ist. Lösen Sie dann den Lipidfilm in 50 Mikrolitern einer Eins-zu-Eins-Chloroform-Methanollösung auf.
Laden Sie mit einer 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze ein bis 10 Mikroliter der Probe auf eine Siliziumdioxid-Hochleistungs-DC-Platte. Tragen Sie die Probe in Ein-Zentimeter-Bändern auf und laden Sie maximal 10 Bänder pro 20-Zentimeter-Platte. Stellen Sie die DC-Platte aufrecht in den DC-Tank und lassen Sie die Lösungsmittelfront acht Zentimeter wandern, um die Phospholipidspezies zu trennen.
Lassen Sie die Platte dann 10 Minuten trocknen und besprühen Sie sie mit einer wässrigen Lösung aus 3 % Kupferacetat und 8 % Phosphorsäure. Lassen Sie die Platte nochmals 30 Minuten bei Raumtemperatur oder mit einer Heißluftpistole trocknen. Die Platte sollte sich von durchscheinendem Blau zu Deckweiß verfärben.
Anschließend den Teller in einem bei 180 bis 200 Grad Celsius temperierten Ofen 5 bis 10 Minuten lang verkohlen oder bis schwarze Lipidbanden sichtbar werden. Inkubieren Sie die behandelten Zellen mit 500 Mikrolitern 100-Nanomol-Insulin in serumfreien Medien für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen haben, legen Sie sie auf Eis, um die Stimulation zu stoppen.
Fügen Sie dann einen Milliliter eiskaltes PBS hinzu und ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Pelletieren Sie die Zellen bei 3000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie anschließend 100 bis 200 Mikroliter vollständigen RIPA-Lysepuffer zum Zellpellet und resuspendieren Sie es 30 bis 40 Mal, um die Zellen zu lysieren.
Nachdem Sie das Lysat 10 Minuten lang auf Eis inkubiert haben, zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius, um die Rückstände zu trennen. Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration das Lysat mit dem fünffachen Laemmli-Puffer mischen und fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen.
Laden Sie die gleichen Mengen Protein pro Probe auf ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese. Lassen Sie das Gel bei 100 bis 150 Volt in einem laufenden Puffer laufen, bis die Proteine zwischen 100 und 250 Kilodalton gut aufgelöst sind. Übertragen Sie dann die aufgelösten Proteine mit einem Transferpuffer auf eine Polyvinylidenfluoridmembran und färben Sie die Membran mit den entsprechenden Antikörpern.
Der Lipidaustausch in den IR-Zellen der Eierstöcke des chinesischen Hamsters führte zu einer erhöhten Intensität der Sphingomyelin-Bande und einer verringerten Intensität der Phosphatidylcholin-Bande, wenn Sphingomyelin im Gehirn ausgetauscht wurde. Umgekehrt stieg beim Austausch von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin oder DOPC die Intensität der Phosphatidylcholin-Bande an, während die Intensität der Sphingomyelin-Bande abnahm. Die mit DOPC ausgetauschten Zellen zeigten eine Abnahme der insulinabhängigen IR-Autophosphorylierung.
Im Gegensatz dazu behielt die Sphingomyelin-Austauschzellen im Gehirn die IR-Phosphorylierung bei oder erhöhte sie moderat. Die normalisierten Phosphorylierungsniveaus wurden bestimmt, indem die pYpY-IR-Intensität durch die IR-Beta-Intensität aus Western-Blot-Daten dividiert wurde.
