Die Software zur automatisierten Erkennung und Analyse von Exozytose ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse und TIRF-Bildsequenzen von pH-sensitiven Fluorophoren automatisch zu erkennen. Es gibt auch automatisch Merkmale der Exozytose wie die räumliche Verteilung oder die Frequenz sowie individuelle Eigenschaften exozytischer Ereignisse wie die Halbwertszeit oder die Veränderung der Fluoreszenz über dem Hintergrund aus. Darüber hinaus ist eine Option enthalten, um exozytäre Ereignisse in vier Modi der Exozytose zu klassifizieren, die zuvor in der Literatur beschrieben wurden.
Um die Software zur automatisierten Erkennung und Analyse von Exozytose zu verwenden, klicken Sie zuerst auf die Schaltfläche Datensatz suchen, und Sie navigieren zu dem Ort, an dem Ihre Daten abgelegt sind, und Sie sollten in einen Ordner namens Rohdaten gelangen. Ihre Datendateien füllen die Liste hier automatisch aus, und Sie können eine beliebige Anzahl von Datendateien in diesem Ordner haben. Als Nächstes sollten Sie ein Verzeichnis auswählen, für das Ihre Analysedateien abgelegt werden.
Hier habe ich ein Verzeichnis namens test ausgewählt. Sie sollten auch die Bildrate Ihrer Bilder sowie die Pixelgröße ausfüllen. Hier liegen meine Bildraten bei hundert Millisekunden pro Bild, meine Pixelgröße bei acht Nanometern.
Schließlich benötigen Sie Maskendateien, um die Software Zur automatischen Erkennung und Analyse von Exozytose auszuführen. Sie können die mitgelieferte Masken-Maker-Schaltfläche verwenden, um automatisch Maskendateien aus Ihren Datendateien zu generieren. Die Laufanzeige wird gelb und dann wieder grün, wenn der Maskenmacher mit dem Laufen fertig ist.
Ihre Maske wird in einem neuen Ordner namens Maskendateien in dem von Ihnen gewählten Verzeichnis abgelegt. Und beachten Sie, dass Maskendateien die Liste hier automatisch füllen. Sie sollten überprüfen, ob Ihre Maskendateien für Ihre Datendateien geeignet sind, und Sie können dies tun, indem Sie eine der Datendateien in der Liste sowie die entsprechende Maskendatei hervorheben.
Der erste Frame Ihrer Datendatei wird angezeigt und die ausgewählte Maskendatei wird ebenso angezeigt. Hier. Wir können sehen, dass unsere Maskendateien für die vorliegende Analyse geeignet sind. Maskendateien können vom Benutzer auch separat zur Verfügung gestellt werden.
Wenn Sie eine Maskendatei aus einer aktuellen Datendatei erstellen möchten, empfehlen wir die Verwendung von Image J.In öffnen Sie dazu zuerst das Bild in Image J, aus dem Sie eine Maskendatei erstellen möchten. Sie können dann das Polygonauswahlwerkzeug verwenden, um mit dem Erstellen einer Maskendatei zu beginnen, indem Sie auf den Rand der Zelle klicken. Wenn Sie Ihre Maske abgeschlossen haben, doppelklicken Sie, um eine Verbindung zum gesamten Polygon herzustellen.
Sobald dies abgeschlossen ist, gehen Sie zum Bearbeiten, Auswahlen und Erstellen der Maske. Eine invertierte Maske wird erstellt. Sie sollten diese Maskendatei unter demselben Namen wie die Datendatei speichern, gefolgt von _mask_file.
Wenn Sie nun Ihre eigenen benutzerdefinierten Maskendateien bereitstellen, ist es wichtig, die automatisierte Erkennungssoftware wissen zu lassen, wo sich diese Maskendateien befinden. Dazu klicken Sie auf die Schaltfläche Maskendateien suchen und navigieren zu dem Verzeichnis mit Ihren Maskendateien. Die neuen Maskendateien füllen dann die Liste hier.
Es ist wichtig, dass Sie für jede einzelne Datendatei eine Maske haben, bevor die Analyse ausgeführt werden kann. Sobald Sie Ihren Datensatz geladen, Ihre Maskendateien, Ihre Bildrate und Pixelgröße korrekt angepasst und ein ausgewähltes Verzeichnis ausgewählt haben, können Sie endlich entscheiden, ob Sie die Klassifizierung als Teil Ihrer Analyse einbeziehen möchten. Wenn Sie die Klassifizierungsschaltfläche umschalten, wird neben der Erkennung exozytischer Ereignisse jedes exozytäre Ereignis in eine von vier Klassen eingeteilt.
Nachdem Sie sich entschieden haben, wie Ihre Analyse ausgeführt werden soll, können Sie die Analyse beginnen, indem Sie auf die Schaltfläche Analyse klicken. Die Laufanzeige wird gelb, um anzuzeigen, dass die Analyse läuft, und wird nach Abschluss der Analyse wieder auf Grün umschalted. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, wie durch den Wechsel Ihres Ausführungsindikators von gelb nach grün angezeigt, werden Sie feststellen, dass ein neuer Datendateienordner in dem von Ihnen ausgewählten Verzeichnis angezeigt wurde.
Im Ordner "Datendateien" finden Sie Analysedateien, die jedem Bildsatz in Ihrem Analyselauf entsprechen. Darüber hinaus finden Sie hier eine Zellstatistikdatei mit zusammenfassenden Informationen wie der Häufigkeit der Exozytose für jeden der Bildsätze. Für jeden Bildsatz haben Sie eine fluoreszierende Spurendatei, die Informationen über die X-Position, die Y-Position und die Rahmennummer enthält, wo sie exozytäre Ereignisse auftreten.
Darüber hinaus wird die durchschnittliche Fluoreszenz in einer Region von Interesse um jedes exozytäre Ereignis sowohl vor, während als auch nach der Exozytose dargestellt. Darüber hinaus gibt es auch eine Tracking-Datei, die ähnliche Informationen über die X-, Y- und temporalen Positionen enthält. Wenn jedoch das Kontrollkästchen Klassifizierung aktiviert ist, gibt es zusätzlich vier zusätzliche Spalten, die die Wahrscheinlichkeit des exozyten Ereignisses angeben, das zu einer von vier Klassen gehört.
Entweder volle Vesikelfusion augenblicklich, volle Vesikelfusion verzögert, Kiss-and-Run augenblicklich oder Kiss-and-Run verzögert. Ein exozytäres Ereignis gehört zu einer der vier Klassen, wenn es größer als 0,5 ist und die höchste Wahrscheinlichkeit innerhalb der vier regierten Klassen ist. In diesem Fall gehört das erste exozytäre Ereignis hier zur momentanen Klasse der vollständigen Vesikelfusion, da es die höchste Zahl über den vier Klassen ist und größer als 0,5 ist.
Darüber hinaus gibt es für jedes Bildset eine Reihe weiterer Feature-Dateien, die bei der Klassifizierung der Exozytose verwendet werden und für die weitere Analyse von Interesse sein können. Wenn wir schließlich Ripleys K-Analyse verwenden möchten, um die räumlich-zeitliche Organisation der Exozytose zu erkennen, werden wir zunächst unsere Maskendatei in eine Neuritmaskendatei und eine Somamaskendatei aufteilen. Wir tun dies, indem wir zuerst unsere Maske in Bild J öffnen.Wir werden den Farbwähler verwenden wollen, um ein Hintergrundpixel auszuwählen.
Und auf diese Weise, wenn wir die Maskendatei ausfüllen, ist es der richtige Wert. Als nächstes verwenden wir das Polygonauswahlwerkzeug und skizzieren den somatischen Bereich. Dies erfordert nun ein wenig subjektive, manuelle Entscheidungsfindung.
Wir schlagen ein grobes Ellipsoid vor. Sobald Sie dies abgeschlossen haben, gehen Sie zum Bearbeiten, Auswahlen und Erstellen einer Maske. Schließlich kehren Sie zu unserer ursprünglichen Maskendatei zurück und verwenden Bearbeiten und Ausfüllen, um das Soma auszufüllen, und jetzt haben wir eine separate Neurit- und Somamaskendatei, die Sie dann speichern.
Sobald Sie Ihre separate Neurit- und Somamaskendatei gespeichert haben, hier habe ich sie als Maskendatei Unterstrich neur für Neurit und Unterstrich soma, wir kommen zu MATLAB und öffnen die Neurite 2D Netzwerk MATLAB Datei. Hier navigieren wir über den aktuellen Ordner zu unserem Verzeichnis, in dem wir alle unsere Analysedaten hinterlegt haben. Sobald wir das getan haben, haben wir den Maskennamenpfad in unsere neue Maskendatei geändert, die der Neurit ist.
In diesem Fall habe ich also meine Neurite-Maskendatei unter dem Ordner Maskendateien. Wir ändern dann den CSV-Dateinamen so, dass sich unsere fluoreszierende Traces-Datei befindet. In diesem Fall befindet es sich immer noch im Ordner "Data Files", und so sind die Datendateien Schrägstriche und der Name der fluoreszierenden Traces-CSV-Datei.
Sobald dies abgeschlossen ist, können Sie auf Ausführen klicken. Dadurch wird dann eine skelettierte Version der Neurite-Maskendatei erstellt und als CSV-Datei unter dem Ordner Maskendateien abgelegt, den wir hier sehen können. Als nächstes generieren wir auch eine CSV-Datei für die Soma.
Öffnen Sie dazu die CSV-Maskenerstellerdatei. Sie sollten den Pfad für Ihre Soma-Maske und einen Namen für die zu erstellende CSV-Datei einfügen. Hier habe ich einfach den gleichen genauen Dateinamen verwendet, nur mit Punkt CSV angehängt.
Klicken Sie auf Ausführen, und Sie werden sehen, dass neben dem Neurit eine neue Soma-CSV-Datei erstellt wurde. Sobald wir die CSV-Dateien sowohl für die Neurite-Maske als auch für die Soma-Maske erstellt haben, können wir Ripleys K-Analyse ausführen. Dazu navigieren wir zu R Studio und öffnen die Ripley's K Analysis R Datei.
Hier gibt es zwei Hauptvariablen, auf die man achten muss, Neuronenmaske und Neuronendatenpunkte. Die Neuronenmaske weist auf die Maskendateien hin, die Sie ausführen möchten. In diesem Fall führe ich zuerst die Soma-Maskendateien aus.
Sie sollten alle Ihre Soma-Maskendateien getrennt von allen Neurite-Maskendateien ausführen. Hier habe ich zwei Neuronen, die ich für diese Analyse verwenden werde. Sie können jedoch so viele verwenden, wie Sie möchten, für die Ripley's K-Analyse, Sie sollten nur diesen Code für die Neuronenmaske kopieren und einfügen und die Variable in drei und weiter ändern.
Die zweite Variable sind Neuronendatenpunkte. Hier möchten Sie es auf die Datei verweisen, die von Ihren Features generiert wurde, alle extrahierte R-Datei. Jetzt wurde meine Fusionsstatistik genannt, und das ist es, was sie hier liest.
Wie bereits erwähnt, habe ich eine zweite Soma-Maskendatei und ein Neuron, das zusammen analysiert wird, damit wir das Ripley's K zusammen aggregieren können. Nachdem Sie diese Pfade in den richtigen Pfad geändert haben, verwenden Sie Code, führen Region aus und führen alle aus. Nach Abschluss des Durchlaufs werden mehrere Diagramme generiert, einschließlich der gruppierten Ripley-K-Werte sowie der Dichtediagramme.
Diese können gespeichert werden, indem Sie exportieren, das Bild speichern unter und das entsprechende Bildformat, das Verzeichnis, den Dateinamen und schließlich auf Speichern klicken. Hier sehen wir repräsentative Ergebnisse von 12 murinen kortikalen Neuronen, die Entlüftung zu Fluor exprimieren, die an zwei Tagen in vitro mit TIRF-Mikroskopie abgebildet wurden. In A sehen wir die Häufigkeit der Exozytose geteilt nach Klasse.
Hier können wir sehen, dass die vollständige Vesikelfusion augenblicklich häufiger auftritt als die anderen Klassen. In B können wir die Modenverteilung sehen, was bestätigt, dass die vollständige Vesikelfusion augenblicklich mehr als die Hälfte aller Ereignisse ausmacht. In C bestimmen wir die räumliche Verteilung der Exozytose als Heatmap.
Wir können sehen, dass die Mehrheit der exozytären Ereignisse in einem Hotspot in der Nähe des Somas sowie an den distalen Enden der Neuriten gruppiert ist. In D können wir feststellen, dass exozytäre Ereignisse statistisch signifikant geclustert sind und dass die Größe dieser Cluster von einem halben Mikrometer bis zu einem Mikrometer reicht. Der Einsatz eines automatisierten Analyseprogramms zur korrekten Identifizierung und Analyse exozytärer Ereignisse auf unvoreingenommene Weise erhöht die Analyseeffizienz und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge.
Um die Genauigkeit der Erkennung zu gewährleisten, ist es wichtig, während der Bildgebung ein hohes Signal zu Rauschen aufrechtzuerhalten. Die Erfassung exozytärer Ereignisse oder anderer pH-sensitiver transienter Ereignisse erfordert eine Bildgebungsfrequenz, die schnell genug ist, um alle Ereignisse zu erfassen und Schätzungen wie die Halbwertszeit oder die Spitzenänderung der Fluoreszenz zu verbessern. Wir haben gezeigt, dass dieses Programm nicht nur die pH-sensitive Fluoreszenz in sich entwickelnden Neuronen genau erfasst, sondern auch andere Zelltypen.
Wenn Sie jedoch einen anderen Zelltyp verwenden, ist es wichtig, aufgrund des unterschiedlichen Verhaltens vorübergehender Ereignisse in anderen Zelltypen nach Unterschieden in der Genauigkeit zu suchen. Diese Klassifikation wurde bisher nur bei der Entwicklung von Neuronen verwendet. Und tatsächlich wissen wir nicht, dass diese Prozesse in anderen Zelltypen oder zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Neuronen existieren.
