Die Autoren möchte der schwedischen Forschungsrat (349-2007-8680) für die Finanzierung und Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Schweden) für die Spende von Rindern Nebennieren zu danken.

(1) Zellkultur Bovine Chromaffin Zellen durch enzymatische Verdauung von Nebennieren isoliert
<ol><li>Um chromaffin Zellen gesammelt aus bovine Nebennieren zu isolieren, Sterilisieren Sie Zellen mit 70 % Ethanol-Lösung. Trim entfernt Fett- und Bindegewebe mit einem Skalpell. Um Blut zu entfernen, spülen Sie die Nebennieren Venen mit Lockes Lösung (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) 5,6 mM bei pH 7,4), die handlich auf 37 ° C.</li>
	<li>Um das Gewebe zu verdauen, jede Drüse durch die Injektion von etwa 2,5 mL warmen steril filtriert 0,2 % Kollagenase P Lösung durch die Nebennieren Vene mit einer Spritze aufblasen und das Gewebe für 20 min bei 37 ° c inkubieren Untersuchen Sie die Drüsen um sicherzustellen, dass die Verdauung der Medulla abgeschlossen ist. Das Gewebe sollte weich und nicht angespannt fühlen.</li>
	<li>Sammeln der verdauten Medulla schnippeln aus den Drüsen in Längsrichtung. Zerkleinere die Medulla Gewebe mit einem Skalpell. Die Gewebe-Suspension über ein Stahl Sieb filtern und verdünnen mit Lockes Lösung für ca. 50 mL Volumen reduzieren die Aktivität der Kollagenbildung P.</li>
	<li>Pellet-Zellen bei 300 X g in einer Zentrifuge für 10 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie in 50 mL sterile Reagenzgläser. Wieder auszusetzen Sie das erhaltene Pellet in 20 mL Lockes Lösung und Filtern Sie die Lösung über eine sterile 100 µm-Nylon-Netzgewebe in Tuben zu.</li>
	<li>Mischen Sie die chromaffin Zellsuspension mit sterilen Percoll (1:1) und Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 18.600 x g für 20 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die oberste Schicht der Dichtegradient und Filtern Sie die Lösung über einen 100 µm-Nylon-Netzgewebe in Tuben.</li>
	<li>Um Percoll auszuschließen, verdünnen Sie die Zellsuspension mit Lockes Lösung und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei Raumtemperatur vor Aussetzung wieder das Pellet in Lockes Lösung. Die geschätzte Zelldichte der isolierten Zellsuspension ist etwa 4 Millionen Zellen/mL.</li>
	<li>Für die Aufnahme der amperometrischen Exozytose und intrazellulären Zytometrie Messungen, Platte chromaffin Zellen Kollagen IV beschichtet 60 mm Plastikschalen bei einer Dichte von etwa 17,5 × 103 Zellen/cm2 und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C in 5 % CO2 Umgebung. Innerhalb von 1-3 Tagen Zellkultur durchführen Sie die elektrochemische Experimente.</li>
	<li>Für die TEM imaging Experimente, Platte chromaffin Zellen in 75 cm2 Zellkulturflaschen bei einer Dichte von 7 Millionen Zellen pro Flasche und Inkubation bei 37 ° C in einer 5 % CO2 Umgebung für 1 Tag.</li>
</ol>(2) einzelne Zelle Exozytose strommesstechnik Experimente24
<ol><li>Um Kohlefaser Mikroelektroden für diese Experimente zu fabrizieren, nehmen Sie ein Glas Kapillare mit einem äußeren Durchmesser geeignet für den Elektrodenhalter Stadium der Kopf, der in diesen Experimenten verwendet wird. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glas-Kapillare mit einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm und einem Innendurchmesser von 0,69 mm.<ol>
<li>Schließen Sie eines der Kapillaren enden an ein Wasserrohr streben. Platz 5 µm Durchmesser Carbonfasern auf so etwas wie ein weißes Blatt Papier, um die Visualisierung zu verbessern.</li>
		<li>Identifizieren einer einzigen Carbon-Faser und die Faser an einem Ende mit einem Finger die Carbonfaser in Position zu halten, während das offene Ende der Kapillare in der Nähe das freie Ende der Carbon-Faser Positionierung gedrückt halten. Sanft Aspirieren der Carbon-Faser in der Kapillare Glas so, dass die Carbonfaser durch beide Enden der Kapillare herausragt. Die Aspiration Kraft wegziehen.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Kapillare mit der Carbon-Faser in einer Mikropipette Puller und ziehen Sie das Glas in zwei separaten Glas Pipettenspitzen Kapillare. Um die Carbonfaser zu trennen, die zwischen den beiden Spitzen verbunden ist, verwenden Sie eine Schere schneiden die Carbonfaser und zwei Kohlefaser Mikroelektroden gewinnen.</li>
	<li>Legen Sie unter dem Mikroskop die Carbonfaser auf einen dickeren Objektträger, der ermöglicht manuelles Schneiden von Carbon-Fasern am Rand wo die Faser aus der Kapillare Glasbeschichtung mit einem Skalpell auszudehnen ist.</li>
	<li>Nach dem Schneiden der Carbon-Faser, ein Trinkgeld Glas beschichtete Kohlefaser, stecken Sie ein paar mm der Elektrodenspitze eine Epoxy-Lösung für 10 min Epoxy hochziehen und jede möglich Freifläche zwischen der Kohlefaser und dem umliegenden Glas zu versiegeln. Heben Sie die Elektroden langsam aus der Epoxy-Lösung zu verhindern, dass sperrige Leim Tropfen an der Spitze der Elektrode bildet.</li>
	<li>Platzieren Sie die Elektroden auf einem Halter (z.B. eine flache Holzstab) mit zweiseitigen hitzebeständiges Klebeband an die Elektroden angeschlossen werden können. Backen Sie die Epoxy behandelt Elektroden über Nacht im Ofen bei 100 ° C. Die Elektrode Spitzen leicht brechen, wenn sie mit einer Oberfläche in Kontakt kommen so sichern die Elektroden werden immer sicher aufbewahrt, mit einem Halter, wo die Elektroden sind fixiert und Tipps riskieren nicht berührt wird.</li>
	<li>Um eine flache Scheibe Elektrodenoberfläche zu erhalten, stellen Sie die Elektrode in die Halterung von einem Microgrinder und jeder Kohlefaser-Elektrode ein Winkel von 45° abgeschrägt. Markieren Sie nach abschrägen die Kapillare auf seiner Oberseite mit einem Permanentmarker später wissen, wie man der Elektrodenoberfläche Disk in einem 45 °-Winkel zu lokalisieren, wenn die Elektrode in der Nähe von Zellen für die Exozytose Messung zu platzieren. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, wie diese Experimente, die ovale Scheibe Elektrode muss flach auf Zellen mit seiner Oberfläche Parallel zur Oberfläche der Petrischale gelegt werden. Darüber hinaus erfolgen abschrägen Elektroden am selben Tag als Experimente um einen frischen und sauberen Elektrodenoberfläche zu gewährleisten.</li>
	<li>Vor dem Gebrauch legen Sie jedes Kohlefaser Mikroelektrode in eine Testlösung (z.B. 0,1 mM Dopamin in PBS-Puffer (pH 7,4)) zur Überwachung der aktuellen mit zyklischer Voltammetrie Steady-State. Ein zyklischer Voltammetrie Scan beantragen eine mögliche Dreieck-Wellenform von -0,2 V bis 0,8 V Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode auf 100 mV/s, um sicherzustellen, dass gute Reaktionskinetik Daten stammen, sind im Einvernehmen mit theoretisch berechneten Werte für eine 5 µm Durchmesser Scheibe Kohlefaser-Mikroelektrode25.</li>
	<li>Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose, legen Sie die Petrischale mit kultivierten chromaffin Zellen auf einem inversen Mikroskop. Es ist wichtig, das Mikroskop eingerichtet mit einem Faraday-Käfig, elektronisches Rauschen bei der Aufnahme durch die sehr kleine Ströme zu messenden strommesstechnik zu beseitigen zu schützen. Verwenden Sie Mikroskop Heizung Bühne eine Temperatur von 37 ° C in der Zellexperimente weiterhin.</li>
	<li>Ein geräuscharmer Patch Clamp Instrument zu verwenden, um eine konstante Potential von 700 anzuwenden mV an der Arbeitselektrode im Vergleich zu einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, die auch in der Petrischale abseits der Arbeitselektrode platziert wird. Digitalisieren Sie für Aufnahme Exozytose von chromaffin Zellen das Signal bei 10 kHz zu und wenden Sie einen internen Tiefpass Bessel-Filter bei 2kHz, das aufgezeichnete Signal zu filtern.</li>
	<li>Konduktometrische Aufnahme bei einzelnen Zellen ausführen, montieren Sie die frisch abgeschrägte und erprobten Kohlefaser Scheibe Mikroelektrode in den Elektrodenhalter der Kopf Bühne, die mit dem Potentiostaten verwendet wird.<ol>
<li>Sanft legen Sie die Elektrode mit der flachen ovalen Scheibe Form Elektrode Oberfläche nach unten in Richtung die apikale Oberfläche der Zelle und die Elektrode in Kontakt mit der Zellmembran mit einem Mikromanipulator.</li>
		<li>Stellen Sie den Abstand von der Elektrode in die Zelle durch die Überwachung der Zelle Verformung durch die Elektrode nach der Platzierung auf der Zellmembran und dann vorsichtig Einfahren der Elektrode zu einer Entfernung, wo die Zelle eine Form in der Nähe von seiner ursprünglichen Zellform gewinnt . Ideal für kinetische und quantitative Erfassung ist ein dünner Flüssigkeitsfilm von hundert Nanometern, die Elektrode und Zelle Oberfläche zu trennen erstellen, die ähnliche Bedingungen für postsynaptischen Detektion von chemischen Freigabe in einer Synapse.</li>
	</ol></li>
	<li>Um die Zellen zu Exozytose anzuregen, positionieren Sie ein Glas Mikropipette mit eine Größe von 2-3 µm Durchmesser, gefüllt mit 5 mM BaCl2 Lösung in einem Abstand von mindestens 20 µm von der Zelle, um zu verhindern, dass jede Lösung Austritt aus der Pipettenspitze Einfluss auf die experimentieren und anwenden einer 5 s Injektion Puls 5 mm BaCl2 Lösung an der Zelloberfläche, die Zelle Exozytose zu stimulieren.</li>
	<li>Um die reversiblen Auswirkungen des osmotischen Drucks auf die Exozytose Prozess untersuchen, bereiten eine isotonische Pufferlösung (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4) mit 310 mOsm/kg Iso-osmotischen Druck und einer hypertonen Puffer gemacht durch die Anpassung der NaCl-Konzentration der isotonische Pufferlösung mit einer Osmolalität 730 mOsm/kg entspricht.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen in der isotonischen Puffer und stimulieren Sie die Zelle Exozytose durch die Anwendung eines Barium-Injektion-Puls während der Aufnahme der amperometrischen aktuelle Transienten während der eingeleiteten Exozytose Tätigkeit für ca. 3 min zu.<ol>
<li>Um die Exozytose Antworten in isotonischen Bedingungen auf Hypertone Bedingungen vergleichen, brüten Sie die Zellen für 10 min in hypertonen Pufferlösung und danach gelten Sie Barium Injektion Impuls zur Stimulierung Exozytose und 3 min amperometrischen Aufnahme durchführen.</li>
		<li>Für die reversible Reaktion der Zellen, Zellen wieder für 10 min. in isotonische Pufferlösung brüten und stimulieren die Zellen durch die Anwendung eines 5 s Barium Injektion Puls und 3 min zur Aufzeichnung der Antwort Exozytose aus der Zelle führen.</li>
	</ol></li>
	<li>Wie Experimente, die Wirkung auf die Exozytose Aktivität durch mehrere Barium Stimulationen durchführen eine amperometrischen Aufnahme der Exozytose Release von drei aufeinander folgenden BaCl2 Stimulationen auf der gleichen Zelle platziert in isotonischen Puffer und verwenden die gleiche Zeit-Protokoll für die aufeinander folgenden Zelle Inkubation Experimente mit verschiedenen Osmolarität.</li>
</ol>(3) intrazellulären elektrochemische Zytometrie24,26
<ol><li>Um die Elektroden für die Vesikel Quanten Größenmessungen fabrizieren, verwenden Sie die gleichen Materialien und bereiten Sie eine 5 µm im Durchmesser Kohlefaser-Elektrode entsprechend den Beschreibungen in den Abschnitten 2.1 und 2.2 der Mikroelektrode Fabrikation für amperometrischen Exozytose Messungen.</li>
	<li>Verwenden Sie unter dem Mikroskop ein Skalpell zum Schneiden der Kohlefaser erweitern aus der Glas-Spitze, so dass eine Carbon-Faser mit einer Länge von 30 bis 100 µm heben sich aus der Glas-Tipp.</li>
	<li>Verwenden Sie zur Vorbereitung eines Flamme geätzten Tipp der Kohlefaser-Elektrode eine Butan-Flamme. Um eine gleichmäßig geätzt zu erreichen, zylindrisch geformten Elektrodenspitze, halten die zylindrisch geformten Kohlefaser-Elektrode beim drehen es und legen Sie die Kohlefaser-Verlängerung aus dem Glas in den blauen Rand der Flamme Butan bis die Spitze des Kohlenstoffs ein rotes entwickelt Farbe. Dies dauert oft weniger als 2 s. Wenn dies gelingt, führt dies zu einer geätzten Elektrode Tipp Größe von 50-100 nm im Durchmesser (REM-Aufnahme von solchen Tipp zeigt Abbildung 5B). Legen Sie nach Flamme Ätzen die Elektrode unter dem Mikroskop, die Elektrodenspitze zu bewerten.</li>
	<li>Einsetzen Sie die zylindrischen Nanotip Mikroelektrode in Epoxy-Lösung für 3 min, gefolgt von einer 15 s Eintauchen der Elektrodenspitze in einer Aceton-Lösung. Dies ermöglicht Epoxy versiegeln den potenzielle Lücke Raum zwischen der Carbon-Faser und die isolierende Kapillare Glaswand, während das Aceton das Epoxidharz aus der geätzten Kohlefaser Elektrodenoberfläche löscht. Um das Epoxidharz zu heilen, Backen Sie die Elektroden im Ofen über Nacht bei 100 ° C.</li>
	<li>Vor Gebrauch testen die Steady-State Strom von jedem Kohlefaser Mikroelektrode, wie in Abschnitt 2.7 erläutert mit zyklischer Voltammetrie. Für Experimente, verwenden Sie Elektroden, die ein Plateau rund um aktuelle Anzeigen nur 1,5-2,5 nA27.</li>
	<li>Legen Sie für interzelluläre strommesstechnik Messungen die Zellen unter dem Mikroskop, wie in 2.8 beschrieben und verwenden Sie die gleichen experimentellen Einstellungen Potentiostaten wie in 2,9 beschrieben.</li>
	<li>Intrazelluläre amperometrischen Messung durchführen, und setzen um erheblichen Sachbeschädigungen an der Zelle zu verhindern die Nanotip zylindrischen Mikroelektrode in die Zelle durch Zugabe von eine sanften mechanischen erzwingen, gerade genug, um die Elektrode durch das Zellplasma zu schieben Membran und in der Zelle Zytoplasma mit einem Mikromanipulator.</li>
	<li>Nach dem Einlegen und mit der Zellmembran versiegelt um die zylindrische Elektrode starten Sie die amperometrischen Aufnahme an Ort und Stelle bei live Cell. Bei der Oxidation potenzielle gilt, für die Elektrode, Vesikel werden an der Elektrodenoberfläche adsorbieren und stochastisch Bruch.  Daher gibt es keine Notwendigkeit für jede Art von Anregung, diesen Prozess zu initiieren.</li>
	<li>Um die osmotische Wirkung auf Quanten Vesikelgröße ermitteln, sammeln Sie die intrazelluläre Zytometrie Messungen aus einer Gruppe von Zellen, die in isotonischen und hypertonen Puffer über die Versuchsbedingung wie beschrieben im Abschnitt 2.13 inkubiert worden.</li>
</ol>(4) Datenanalyse strommesstechnik Aufnahmen
<ol><li>Um die aufgezeichneten strommesstechnik Daten aus Exozytose und intrazellulären Vesikel Quanten Größe Analyse analysieren, nutzen Sie eine Software, die Analyse der aktuellen Transienten in der aufgenommene Strom versus Zeit Spur also das kinetische ermöglicht Peak-Parameter und die integrierte Gesamtladung für individuelle Stromspitzen kann bestimmt werden. Für die Datenanalyse haben wir in der Sulzer-Labor, das für die Daten-Analyse-Programm, Igor28 geschrieben wurdeentwickelte Software eingesetzt.</li>
	<li>Bei der Analyse der amperometrischen Spitzen, wählen Sie einen Grenzwert für die Gipfel der drei Mal Root-Mean Square (RMS) Standardabweichung des Rauschens für jede Aufnahme.</li>
	<li>Sammle die konduktometrische Spikes von jeder Zelle-Aufzeichnung manuell, um zu verhindern, dass falsche Stacheln, die nicht die Gaußsche Form folgen, Spitzen, die das Ergebnis der zusammengeführten Exozytose Ereignisse, und akzeptieren nur "glockenförmig" geformte Spitzen mit einem Schwellenwert von drei Mal zu verdoppeln höher als die RMS-Lärm.</li>
	<li>Sammeln die Daten für die gesamte Ladung pro einzelne amperometrischen peak und Faradays Gesetz (N = QnF) zur Berechnung der molaren Menge an Katecholamin Neurotransmitter pro Exozytose oder intrazellulären einzelne Vesikel Bruch Veranstaltung, wo N die Maulwürfe von ist erkannt Neurotransmitter, die durch eine Redoxreaktion an der Elektrodenoberfläche, Q = die gesamte Ladung erkannt unter jede Spitze, n = Anzahl der Elektronen in der Redoxreaktion übertragen (n = 2 für Katecholamine), und die Faraday´s-konstante F = 96485 C/Mol.</li>
	<li>Führen Sie statistische Auswertung der erhobenen Daten durch die erste Berechnung der durchschnittlichen Gebühren pro Ereignis für jede Zelle erkannt. Anschließend Varianz zwischen den Zellen, berechnen Sie die durchschnittliche Gebühr zwischen Zellen und verwenden Sie ein Student t-Test zwischen Zellen vorausgesetzt, ungleiche Varianz. Diese Studie verwendete das MATLAB-Programm zur statistischen Auswertung.</li>
</ol>(5) TEM Bildgebung für die Vesikel Größe Analyse
<ol><li>Um TEM Bildgebung der Zellen an die unterschiedlichen osmotischen Bedingungen durchzuführen, zunächst inkubieren Sie Zellen in isotonische oder Hypertone Puffer für 10 min bei 37 ° C in einer 5 % CO2 Umgebung vor chemischen Fixierung der Zellen.</li>
	<li>Führen Sie Zelle Fixierung mit Karnovsky Fixativ Methode29. Mit dieser Methode inkubieren Sie die Zellen mit einer Lösung mit 0,01 % Natriumazid, 1 % Formaldehyd und 1,25 % Glutaraldehyd, in denen die Probe bei 4 ° c gelagert werden können</li>
	<li>Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen mit 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer.</li>
	<li>Zu die Zelle färben Proben post Fixierung und in Vorbereitung auf TEM imaging, die Zellen mit einer 1 % Osmium ausgefällt Lösung für 2 h bei 4 ° C, gefolgt von 1 h Inkubation in 0,5 %-Uranyl-Acetat-Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>In einem abschließenden Fixierung Schritt Entwässern Sie die Zellen zunächst durch die Zellen in 100 % igem Ethanol spülen und dann spülen Sie Zellen mit Aceton ab.</li>
	<li>Betten Sie die Zellproben in Epoxyharz ein und danach durchführen Sie Zentrifugation bei 4.000 x g für 30-40 min und erlauben Sie die Zellprobe polymerisieren bei 40 ° C für 15 h, gefolgt von 48 h Inkubation bei 60 ° C.</li>
	<li>In Vorbereitung für die Bildgebung, Abschnitt die Zellprobe eingebettet in Agar 100 Harz in Scheiben mit einer Dicke von 60 nm mit einer regungsloses.</li>
	<li>Vorbehaltlich der Zellen zu einer 4 % Uranyl acetate/25% Ethanol Lösung für 4 min, gefolgt von 20 s der Spülung mit Wasser. Waschen Sie die Zellen mit Reynolds Blei Citrat für 3 min, gefolgt von 20 s der Spülung mit Wasser.</li>
	<li>Durchführen Sie Getriebe-Elektronenmikroskopie-Bildgebung von Zellproben. In unseren Experimenten habe wir eine Transmissions-Elektronenmikroskop in Betrieb war bei 120 kV.</li>
	<li>Aus jedem aufgenommenen Bild einer Zelle Abschnitt illustriert die Zelle Ultrastruktur, die eine Bevölkerung der Vesikel in die Zelle Zytoplasma zeigt zuerst kalibrieren Pixel Bildgröße von im Zusammenhang mit der aufgezeichneten Maßstabsbalken in jedem TEM Bild Pixel. Verwenden Sie imaging-Software, um die Vesikel Größen bei jedem Bild der Zellen isotonische oder Hypertone Bedingungen ausgesetzt zu bestimmen. In unseren Experimenten verwendeten wir die Software ImageJ zur Bildanalyse. Es ist erwähnenswert, dass für Bildanalyse von zellulären Ultrastruktur von TEM-Aufnahmen von Zellen, Größenanpassung dieser Messungen anhand der Dicke der Zellteile muss berücksichtigt werden und wurden zuvor von Almers´s Lab30beschrieben.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll und die Vorteile der Kombination von drei ergänzende analytische Methoden zur Analyse von sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess besser zu verstehen wie eine physische Kraft wie osmotischen Druck sekretorischen Vesikel auswirken können und der Exozytose Prozess in sekretorischen Zellen. Diese Methoden umfassen die Kohlefaser-Mikroelektrode strommesstechnik, das ist eine etablierte Methode zur Erfassung von Exozytose Aktivität, intrazelluläre elektrochemische Zytometrie, ...

Chromaffin Zellen in Nebennieren sind neuroendokrine Zellen, die Neurotransmitter-Moleküle in die Blutbahn abgeben. Dies geschieht durch ein zellulärer Prozess, bei dem das Andocken, und die Verschmelzung von Neurotransmitter gefüllten Vesikel, was Inhalt Auflösung von Vesikeln in den extrazellulären Raum in einem Prozess namens Exozytose. Die Neurotransmitter (Adrenalin und Noradrenalin) in chromaffin Zellen werden aktiv von Membranproteinen in großen dichten Kern Vesikel (LDCVs) transportiert und bei hohen Konzentrationen (~0.5-1 M)1,2gespeichert. Ansammlung von Neurotransmittern im Inneren der LDCVs geschieht durch die Affinität von Katecholamin-Moleküle zu den intravesicular Rumpfkern Protein-Matrix bestehend aus Chromogranin Proteine (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, und ein intravesicular cocktail Lösung mit Schlüsselkomponenten für Katecholamin-Verladung und Lagerung in die Blase wie ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in der Lösung und ~ 40 mM verpflichtet, die Protein-Matrix)8Mg2 + (5 mM)9, Ascorbat (10-30 mM)10und einem pH-Wert von ~5.511,12. Die LDCVs pflegen einen Iso-osmotischen Zustand der Zelle Zytoplasma (310 mOsm/kg)13, obwohl die theoretische gelöste Konzentration in den Vesikeln Summe bis zu mehr als 750 mM. Die Zusammensetzung der einzelnen intravesicular ist nicht nur wichtig für die Verladung und Lagerung Katecholamine, sondern auch für die Aggregation von gelösten Stoffen, dichten Kern-Protein-Matrix. Dies reduziert die Osmolarität der Vesikel wird deutlich reduziert und beeinflussen die Menge Katecholamin, die während der Exozytose5,6freigegeben wird.
Studien über die Wirkung des extrazellulären osmotischen Drucks auf die Exozytose von amperometrischen Aufnahme haben berichtet, dass hoher extrazellulärer osmotischer Druck hemmt Exozytose Aktivität und reduziert die Anzahl der Neurotransmitter abgesondert von einzelnen Vesikel Fächer4,14,15,16,17,18,19. Die Erklärungen dieser Beobachtungen haben auf die mögliche Verbesserung der makromolekularen Engstand in der Zelle Zytoplasma hemmende Vesikel Fusion Events und eine Veränderung in der Membran Biophysikalische Eigenschaften beeinflussen die Anzahl der spekuliert. Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt. Diese Gedanken angenommen hohen extrazellulären osmotischen Stress beeinflusst nicht die Vesikel Quanten Größe, bestimmt die Anzahl der Neurotransmitter-Moleküle gespeichert in einem Vesikel-Fach in vorherige Phase der getriggerten Exozytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in konduktometrische Messungen der Exozytose Freisetzung in Einzelzellen, eine Kohlefaser-Scheibe Mikroelektrode steht in engem Kontakt mit der Zelloberfläche, erstellen eine experimentelle Einrichtung imitiert die Synapse-Konfiguration, wo der amperometrischen Elektrode dient als ein postsynaptisches Detektor (Abbildung 1)22,23. Durch die Stimulierung einer Zelle, Exozytose, kann ein Neurotransmitter gefüllten Vesikel verschmelzen mit der Plasmamembran der Zelle und lassen teilweise oder volle Blase Inhalt in den extrazellulären Raum auslösen. Diese Neurotransmitter-Moleküle an der Oberfläche der Elektrode veröffentlicht können elektrochemisch erkannt werden, wenn die Neurotransmitter elektroaktive (z.B. Katecholamine) sind durch die Anwendung ein Redoxpotential von 700 mV Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode . Daher eine Reihe von Stromspitzen markieren die Erkennung der einzelnen Exozytose Ereignisse. Vom aktuellen versus Zeit Spur in einer amperometrischen Aufnahme die Anbaufläche jedes einzelnen amperometrischen Spike stellt die Ladung pro Exozytose Ereignis erkannt und der Maulwurf von Neurotransmittern freigegeben, unter Verwendung der Gleichung Faraday konvertiert werden kann. Daher die konduktometrische Aufnahmen liefern quantitative Informationen über die Menge Neurotransmitter aus einzelnen Exozytose Veranstaltungen vertrieben und Berichten über die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse, sondern präsentieren keine quantitative Informationen über die sekretorischen Vesikel Inhalte vor der Fusion der Vesikel und Neurotransmitter-Freisetzung wurde eingeleitet.
Daher, um ein besseres Verständnis der wie sekretorischen Vesikel in der Zelle Zytoplasma reagieren auf extrazelluläre osmotischen Stress bevor die Zelle ausgelöst wird, um zu unterziehen, Exozytose, andere ergänzende analytische Methoden verwendet werden können, um diese Informationen zu bereichern. Zum Beispiel um zu untersuchen, ob osmotischen Stress Vesikel Volumen ändert, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) bildgebende Analyse lässt sich die Vesikelgröße der Zellen nach chemischen Fixierung zu messen. Um zu untersuchen ob osmotischen Stress Quanten Vesikelgröße betrifft, eine neu entwickelte amperometrischen Technik namens intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgebracht werden, für die Quantifizierung der Vesikel Neurotransmitter Inhalt an sekretorischen Vesikel in ihrer nativen Zustand noch im Zytoplasma der lebenden Zellen26wohnhaft. In der intrazellulären elektrochemische Zytometrie-Technik eine Nanotip zylindrischen Kohlefaser-Elektrode sanft das Zytoplasma von lebenden Zellen und durch die Anwendung einer + 700 mV Potenzial an dieser Elektrode eingefügt (Vs Ag/AgCl Referenz Elektrode), die Katecholamin-Inhalte in Vesikeln quantifiziert werden kann, durch den Nachweis einer Redox Stromspitze aus einzelnen Bläschen kollidieren, adsorbierenden, und anschließend stochastisch Brechung an der Elektrodenoberfläche und damit deren Inhalt gegen die Freigabe der Elektrode Oberfläche26. Daher in der amperometrischen aktuelle versus Zeit Spur, jedes einzelne Vesikel zerreißendes Ereignis kann dazu führen, dass eine aktuelle transiente und, durch die Integration von Bereich des jeweils aktuellen Spike, kann Quanten Vesikelgröße mit Faraday´s Gesetz berechnet werden.
Daher kann durch die Verknüpfung der quantitativen Informationen gewonnenen Vesikel Größenmessungen mit TEM Bildgebung Vesikel Quanten Größe und analysiert, wie von intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgezeichnet, Vesikel Neurotransmitter Konzentration auch werden Sie bestimmt. Dies ermöglicht Vesikel Charakterisierung, wenn Zellen unterschiedliche osmotische Bedingungen ausgesetzt sind und bietet eine bessere Sicht wie Bläschen auf extrazelluläre osmotischen Stress in der Phase vor der Exozytose reagieren können. Die Ergebnisse aus der Kombination dieser Methods haben gezeigt, dass im Beisein von extrazellulären hohen osmotischen Druck, Bläschen schrumpfen und passen Sie ihre Quanten Größe und Vergleich der quantitative Informationen über die relativen Veränderungen dieser Messungen, dass zeigt beim schrumpfen anzupassen Vesikel ihre Inhalt und Größe weiterhin eine konstante Neurotransmitter Konzentration24. Somit ist dieses Verständnis wertvolle im Anschluss an die Bemerkungen über Neurotransmitter-Freisetzung in Zellen osmotischen Stress ausgesetzt. In diesen Protokollen beschreiben wir die Verwendung dieser drei komplementäre Methoden, mit denen die Charakterisierung der wie sekretorischen Vesikel in ihrer natürlichen Umgebung reagieren extrazellulären Osmolalität und die Auswirkungen dieser Reaktion auf die Exozytose Prozesses. Zusätzlich zu unseren bisherigen Beobachtungen über die Wirkung der hohen osmotischen Druck auf Exozytose24präsentieren wir weitere Experimente, die Zelle Erholung nach osmotischen Schock und die Wirkung von mehreren Barium Stimulationen in chromaffin beschreiben Zellen.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche, Sweden</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;micro;M Nylon mesh</td><td>Fisher Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td><td>VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Sutter instrument Co., Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishing Inc., Japan</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy solutions (A and B)</td><td>Epoxy technology, Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveller</td><td>Narishing Inc.</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp Instrument</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh Instrument Inc., USA</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>Butane Flame</td><td>Multiflame AB, H&amp;auml;sselholm, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

Strommesstechnik Aufnahme der Zellen ausgesetzt osmotischen Schock zeigen, dass die sekretorische Zellen auf dieser physischen Stress zu reagieren, durch die Reduzierung der Exozytose-Aktivität und die Menge der Neurotransmitter aus Vesikeln im einzigen Exozytose Veranstaltungen veröffentlicht. Es wurde vermutet, dass der Rückgang der Neurotransmitter ausgestoßen aufgrund von Änderungen in Membran Biophysikalische Eigenschaften, ist wenn Zellen als Reaktion auf osmotischen Stress schrumpfen und mit Annahmen, die sekretorischen Vesikel in das Zytoplasma der Zelle sind nicht betroffen durch extrazelluläre osmotischen Stress. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose überwacht, was aus den Zellen im Moment losgelassen wird, den ein Vesikels verschmilzt mit der Plasmamembran, den aber enthält keine Angaben über den Inhalt des Vesikels bevor die Fusion der Vesikel ausgelöst wird. Daher, durch die Kombination strommesstechnik Aufnahme mit anderen ergänzenden analytischen Methoden, die sind in der Lage, die Charakterisierung der sekretorischen Vesikel, bevor Exozytose an Zellen ausgelöst wird bietet einen umfassenderen Überblick für die Prüfung wie sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess werden durch osmotischen Schock betroffen. Wir beschreiben hier, wie ergänzend strommesstechnik Aufnahme mit intrazellulären elektrochemische Zytometrie und Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung kann verwendet werden, um Änderungen im sekretorischen Vesikel Größe und Neurotransmitter an charakterisieren chromaffin Zellen im Zusammenhang mit Exozytose Tätigkeit vor und nach der Exposition auf osmotischen Stress. Durch die Verknüpfung der quantitative Erkenntnisse aus Experimenten mit allen drei analytische Methoden, wurden Schlussfolgerungen zuvor gemacht, dass sekretorischen Vesikel auf extrazelluläre osmotischen Stress reagieren, indem in der Größe schrumpfen und die Vesikel Quanten Größe zu reduzieren behalten Sie eine konstante Vesikel Neurotransmitter Konzentration. Daher gibt das einige Klarstellungen hinsichtlich warum Vesikel, in Reaktion auf osmotischen Stress die Menge Neurotransmitter bei Freigabe Exozytose freigesetzt reduzieren. Die konduktometrische Aufnahmen hier zeigen, dass dies ist ein reversibler Prozess und das telson, nachdem osmotischen Schock mit Neurotransmittern aufgefüllt werden, wenn die gesetzten Zellen in einer isotonischen Umgebung rückgängig gemacht werden.

Wir beschreiben hier das Protokoll, für wie kombinieren TEM Bildgebung zusammen mit zwei elektrochemische Methoden, Kohlefaser-strommesstechnik und intrazellulären elektrochemische Zytometrie, Auskunft geben kann, die eine breitere Sicht in Anspielung auf die Wirkung der gewinnt extrazelluläre osmotischen Druck auf die sekretorischen Vesikel und Exozytose Prozess. Vergleicht man repräsentative amperometrischen Aufnahmen der Exozytose Release auf einzelne chromaffin Zellen mit der experimentellen eingerichtet (in <str...

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Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

monitoring-effect-osmotic-stress-on-secretory-vesicles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Aufrufe.  Chalmers University of Technology. Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Serie: Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

Membran Umbau des riesigen Vesikel in Reaktion auf lokalisierte Kalzium Ionen-Gradienten

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Forschung

Chemie

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Immunologie und Infektion

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Neurowissenschaften

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Biologie

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) is a straightforward way to explore secretion from the lysosomal compartment. Taking advantage of cell culture on micropatterned surfaces to normalize cell shape, a variety of statistical tools were employed to perform a spatial analysis of secretory patterns. Using Ripley&#8217;s K function and a statistical test based on the nearest neighbor distance (NND), we confirmed that secretion from lysosomes is not a random process but shows significant clustering. Of note, our analysis revealed that exocytosis events are also clustered in nonadhesion areas, indicating that adhesion molecules are not the only structures that can induce secretory hot spots at the plasma membrane. Still, we found that cell adhesion enhances clustering. In addition to precisely defined adhesive and nonadhesive areas, the circular geometry of these micropatterns allows the use of polar coordinates, simplifying analyses. We used Kernel Density Estimation (KDE) and the cumulative distribution function on polar coordinates of exocytosis events to identify enriched areas of exocytosis. In ring-shaped micropattern cells, clustering occurred at the border between the adhesive and nonadhesive areas. Our analysis illustrates how statistical tools can be employed to investigate spatial distributions of diverse biological processes.

Live imaging of lysosomal exocytosis on micropatterned cells allows a spatial quantification of this process. Morphology normalization using micropatterns is an outstanding tool to uncover general rules about the spatial distribution of cellular processes.

Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

Automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytose

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

Eine Einführung in die Endozytose und Exozytose

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Zellbiologie

An In Vitro Technique to Visualize Exocytosis of Secretory Granules in Mast Cells

Source: Klein, O., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57936">Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique to visualize exocytosis in mast cells. The cells are incubated with FITC-dextran &#8212; a fluorescent reporter &#8212; which is taken up by cells inside secretory granules (SGs), where the acidic pH quenches its fluorescence. Upon stimulation of granule exocytosis, the medium&#39;s higher pH induces reporter fluorescence inside the fused SGs, which is visualized using a fluorescence microscope.

Eine in vitro Technik zur Visualisierung der Exozytose von sekretorischen Granula in Mastzellen

1. Preparations

	Preparation of RBL (RBL-2H3 mast cell line) culture media
	
		Mix 500 mL of low glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium ...